Оценка уровня антиоксидантной активности растительного сырья Actinidia argutа (Siebold et Zucc.) Planch. ex Miq., выращиваемой в регионе кавказских минеральных вод

Полный текст

Список сокращений: DPPH- 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил; ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота; ДК – диеновые конъюгаты; ТБК-АП – активные продукты тиобарбитуровой кислоты; АФК – активные формы кислорода; СОД – супероксиддисмутаза; ГП – глутатионпероксидаза; НАДФН – никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный; ERK – внеклеточная регулируемая киназа; MAPK – митоген-активируемая протеинкиназа.

ВВЕДЕНИЕ

Род Актинидия (Actinidia Lindl.) включает порядка тридцати видов, места естественного произрастания которых – Центральная и Восточная Азия, остров Ява. В России это реликтовые растения Дальнего Востока (виды: актинидия Джиральда – Actinidia giraldi Diels.; актинидия коломикта – Actinidia kolomikta (Maxim.) Maxim.; актинидия острая – Actinidia argutа (Siebold et Zucc.) Planch. ex Miq.; актинидия полигамная – Actinidia polygama (Siebold et Zucc.) Maxim. Селекционную работу с дальневосточными актинидиями в 1906 г. начал Мичурин И.В., которым был создан селекционный фонд отечественных актинидий [1].

Одним из перспективных видов является Actinidia argutа (Siebold et Zucc.) Planch. ex Miq., так как хорошо переносит температурные перепады и отличается стойкостью к пониженным температурам (зимний период), высокой урожайностью. Мичуриным И.В. из образцов этого вида были выведены сорта: ранний и урожайный [2]. В данное время произрастание Actinidia argutа распространилось достаточно далеко за пределы естественного ареала и с каждым годом он все более интересен как перспективный вид для садоводства, так и медицинского использования [4]. Плоды ценятся по содержанию аскорбиновой кислоты [3, 8], а также в связи с высоким содержанием биологически активных веществ (БАВ), обладающих антиоксидантными, адаптогенным и иммуномодулирующими свойствами [5–7]. Актинидия аргута (Siebold et Zucc.) Planch. ex Miq. – известное растение Японии под названием сарунуши, в плодах которых установлено содержание таких БАВ, как: катехины, аскорбиновая кислота, антоцианы, бета-каротины и другие полифенолы, хорошо сохраняющихся и в продуктах переработки. Исследования японских ученых показывают, что компоненты сока A. аrguta являются перспективными для потенциального использования в качестве химиопрепаративных агентов [8, 9]. Имеются исследования о том, что виды рода Actinidia Lindl. могут быть потенциальным источником природных антиоксидантов [10].

В настоящее время Actinidia argutа (Siebold et Zucc.) Planch. ex Miq. успешно выращивается в условиях Кавказских Минеральных Вод и представляет интерес для научного исследования. В течение последних десяти лет нами проводятся наблюдения за выращиваемыми экземплярами в климатических условиях г. Пятигорска. Следует отметить неприхотливость в уходе, морозостойкость, ежегодное плодоношение и неплохую урожайность.

Проведенным скрининговым фитохимическим анализом в листьях Actinidia argutа (Siebold et Zucc.) Planch. ex Miq. нами установлено содержание флавоноидов, дубильных веществ, присутствие которых прогнозирует возможную антиоксидантную активность [11].

ЦЕЛЬ. Выявление и оценка антиоксидантной активности потенциально нового лекарственного сырья – актинидии аргута листьев (Actinidia arguta folia).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования

Объект исследования – актинидии листья (Actinidia folia), заготовленные в фазу плодоношения (осень) производящего растения – Actinidia argutа семейства Actinidiaceae, с экземпляров, выращиваемых в климатических условиях г. Пятигорска Ставропольского края в открытом грунте в районе Новопятигорск–Скачки, координаты: 44°01’07” с.ш. и 43°03’12” в.д., высота над уровнем моря 545 м. Идентификация сырья произведена доцентом кафедры фармакогнозии, ботаники и технологии фитопрепаратов Пятигорского медико-фармацевтического института – филиала ФГБОУ ВО ВолгГМУ Минздрава России – Вдовенко-Мартыновой Н.Н. Actinidia argutа (Siebold et Zucc.) Planch. ex Miq. – двудомная многолетняя лиана до 15 метров высотой с сильно вьющимся стеблем, который со временем одревеснел. Листья крупные до двенадцати сантиметров длиной, зеленого цвета, осенью становятся ярко-желтого и опадают в ноябре. Плодоносит ежегодно. Плоды – ягода до 3 см длиной, сочная, кисло-сладкого вкуса напоминающего киви.

Получение извлечений и определение суммарного содержания антиоксидантов в пересчете на кверцетин и галловую кислоту

Извлечения для исследования готовили из высушенного измельченного сырья. Суммарное содержание антиоксидантов определяли в пересчете на кверцетин и галловую кислоту. Используя градуировочный график зависимости выходного сигнала от концентрации кверцетина и/или галловой кислоты, измеряли массовую концентрацию антиоксидантов. Определение проводили на жидкостном хроматографе «Цвет Яуза-01-АА» (ОАО НПО «Химавтоматика», Россия) амперометрическим методом [12–15].

Анализируемое сырье измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито диаметром 0,5 мм. Около 1,0 г (точная навеска) помещали в коническую колбу со шлифом вместимостью 100 мл, добавляли 30 мл экстрагента (вода очищенная, спирт этиловый различной концентрации: 95%, 70%, 40%), нагревали на водяной бане с обратным холодильником 30 минут. После охлаждения фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл. Экстракцию повторяли дважды, используя 30 мл экстрагента. Извлечения объединяли и доводили до метки [12–14].

Для каждого образца регистрировали пять последовательных измерений выходного сигнала (площади пика) анализируемого извлечения. При расчетах учитывали разведения.

Массовую концентрацию Х (мг/г) рассчитывали по формуле:

$X=\frac{X_g*V_n*N}{m_n*1000}$, (1)

где: Х_г – массовая концентрация антиоксидантов, найденная по градуировочному графику, мг/л; V_n – объем (извлечения) растительного сырья, мл; m_n – навеска растительного сырья, г; N – кратность разбавления анализируемого образца.

Определение фармакологической активности

Антиоксидантную активность извлечений Actinidia argutа изучали in vitro в следующем диапазоне разведений: 62,5 мкг/мл, 125 мкг/мл, 250 мкг/мл, 500 мкг/мл и 1000 мкг/мл. При этом оценивали ингибирующие свойства 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (DPPH), супероксида и гидроксил-радикала анализируемых образцов. Все тесты выполнялись в триплетном варианте.

DPPH тест

Способность изучаемых извлечений Actinidia argutа ингибировать образование DPPH радикала в модельной среде оценивалась по методу, описанному Flieger J, и соавт. [16]. Смесь, состоящую из 1 мл анализируемого извлечения в различных концентрациях и 0,5 мл 0,4 мМ раствора DPPH в метаноле («ч.д.а», ЗАО «Вектон», Россия), инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Далее регистрировали изменение оптической плотности изучаемых образцов при λ=518 нм относительно метилового спирта. Метанольный раствор DPPH принимали за положительный контроль (А₀). В качестве сравнения использовали кверцетин (Sigma-Aldrich, США) в аналогичных концентрациях. Процент ингибирования рассчитывали по формуле [16]:

$\% ингибирования=\frac{A_x*100}{A_0}$, (2)

где: А_х – оптическая плотность пробы образца извлечения; А₀ – оптическая плотность пробы положительного контроля.

Оценка гидроксил-радикал ингибирующей активности

Применяли метод, основанный на спектрофометрическом детектировании окрашенного конденсированного комплекса 2-тиобарбитуровой кислоты и продуктов деградации 2-дезоксирибозы, разрушаемого под действием гидроксил-радикала, генерируемого в реакции Фентона. Модельная среда имела в своем составе: 0,1 мл 2,8 мМ раствора дезоксирибозы; 0,1 мл 0,1 мМ раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА); 0,1 мл 0,1 мМ раствора аскорбата; 0,1 мл фосфатного буфера (pH 7,4) и 1 мл анализируемых извлечений Actinidia folia в оцениваемом диапазоне концентраций. Полученную смесь инкубировали при температуре 37°С в течение одного часа. Далее добавляли 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты 2,8% и 1 мл раствора 2-тиобарбитуровой кислоты 1%, нагревали 20 мин на водяной бане (100°C). После охлаждения измеряли экстинкцию проб при λ=532 нм относительно воздуха. Положительным контролем служила среда Фентона без добавления изучаемых экстрактов. В качестве сравнения использовали кверцетин аналогичных концентрациях. Степень ингибирования образования гидроксил-радикала рассчитывали по формуле (2) [17].

Оценка супероксид-радикал ингибирующей активности

Использовали метод анализа, основанный на спектрофометрической детекции продуктов реакции фотообращения рибофлавина. Модельная среда включала: 0,1 мл раствора изучаемых извлечений Actinidia folia в различных концентрациях; 0,1 мл 1,5 мМ раствора нитро-синего тетразолия; 0,2 мл 0,1 М раствора ЭДТА; 0,05 мл 0,12 мМ раствора рибофлавина и 2,55 мл фосфатного буфера (pH 7,4). Смесь инкубировали 5 мин при комнатной температуре. Экстинкцию проб измеряли при λ=560 нм относительно воздуха. Положительным контролем выступала среда инкубации без добавления изучаемых извлечений. В качестве сравнения использовали кверцетин в аналогичных концентрациях. Процент ингибирования образования супероксид-радикала рассчитывали по формуле (2) [18].

При проведении in vitro тестирования величину оптической плотности измеряли на спектрофотометре ПЭ-5400В (Промэколаб, Россия).

Оценка «острой токсичности»

Изучение токсичности извлечений Actinidia folia в остром эксперименте проводилось согласно процедуре тестирования «Up and Down», основные положения которой представлены в OECD «Руководстве по оценке пероральной токсичности химических соединений №425».

Согласно принципам оценки «острой токсичности», изложенных в OECD №425 эксперимент по изучению токсичности исследуемых образцов предполагает наличие двух этапов. Первый этап представляет собой «лимит-тест», в котором изучаемые объекты вводились перорально в дозе 5000 мг/кг. При гибели 3-х животных производили основное тестирование, в противном случае за величину LD₅₀ принимали значение 5000 мг/кг. Наблюдение за животными осуществляли на протяжении 14-ти дней с момента введения изучаемых объектов. Исследование «острой токсичности» анализируемых извлечений Actinidia folia выполняли на мышах-самцах линии Balb/c массой 20–25 грамм, полученных из питомника лабораторных животных «Рапполово» (Ленинградская область, Россия), прошедших микробиологический контроль и 2-недельный карантин. Животные содержались в стандартных условиях: температура воздуха 20±2°С, относительная влажность 60±5% при суточном цикле 12 часов день/12 часов ночь и свободном доступе к корму и воде. Дизайн исследования и условия содержания животных соответствовали общепринятым стандартам экспериментальной этики¹. Концепция работы была одобрена локальным этическим комитетом ПМФИ – филиала ФГБОУ ВО ВолгГМУ (протокол № 2 от 20.03.2019).

Оценка антиоксидантной активности исследуемых экстрактов in vivo

In vivo изучение антиоксидантных свойств извлечений Actinidia folia выполнено на 60-ти крысах-самцах линии Wistar массой 200–230 грамм. Содержание животных соответствовало таковому при оценке «острой токсичности». Исследуемые извлечения (спирт этиловый 95% – шифр А95; спирт этиловый 70% – шифр А70; спирт этиловый 40% – шифр А40 и водное извлечение – шифр АВ) вводили per os в дозе 1/50 от LD₅₀ на протяжении 10-ти дней крысам без патологии. После чего у животных производили забор крови (из брюшной аорты) в шприц с цитратным напылением, далее крыс декапитировали под хлоралгидратной анестезией (350 мг/кг интраперитонеально). Кровь центрифугировали в режиме 1000g в течение 15 мин., с получением сыворотки, в которой определяли изменение про/антиоксидантного равновесия. Веществом сравнения выступал кверцетин в дозе 100 мг/кг, который вводили по аналогичной исследуемых извлечений схеме [19].

Определение концентрации диеновых конъюгатов

Содержание диеновых конъюгатов (ДК) в сыворотке крови животных определяли спектрофотометрическим методом. ДК извлекали смесью: гептан–изопропанол (1:1). Количество ДК рассчитывали по молярному коэффициенту экстинкции конъюгированных диенов при λ=233 нм 2,2×10⁵ М ¹ · см^-1 и выражали в нмоль /мл. Величину оптической плотности измеряли на спектрофотометре ПЭ-5400В (Промэколаб, Россия) [20].

Определение концентрации ТБК-активных продуктов (ТБК-АП)

Содержание ТБК-АП определяли спектрофотометрической детекцией при λ=532 нм окрашенных продуктов реакции конденсации перекисных продуктов с 2-тиобарбитуровой кислотой. При этом окраска образующегося раствора пропорциональна концентрации ТБК-АП. Содержание ТБК-АП рассчитывали по величине молярного коэффициента экстинкции малонового диальдегида (1,56×10⁵ л · моль^-1 · см^-1). Полученные результаты выражали в нмоль/мл. Величину оптической плотности измеряли на спектрофотометре ПЭ-5400В [21].

Определение активности каталазы

Активность каталазы оценивали спектрофотометрическим методом в реакции деструкции пероксида водорода, определяемого взаимодействием с раствором молибдата аммония 4%. Интенсивность окраски продукта реакции оценивали при λ=410 нм. Активность каталазы рассчитывали по разности экстинкций опытной и холостой проб, используя коэффициент молярной экстинкции перекиси водорода, равный 22,2×10³ мМ^-1 · см^-1 и выражали в нмоль/мин/мл. Величину оптической плотности измеряли на спектрофотометре ПЭ-5400В [22].

Определение активности супероксиддисмутазы

Активность супероксиддисмутазы (СОД) оценивали ксантиноксидазным методом. Среда инкубации содержала: ксантин 0,05 ммоль/л; 2-(4-йодофенил)-3-(4-нитрофенол)-5-фенилтетразолия хлорид 0,025 ммоль/л; ЭДТА 0,94 ммоль/л, ксантиноксидаза 80 Ед/л, CAPS буфер – 40 ммоль/л. Экстинкцию проб регистрировали при λ=505 нм. Активность СОД выражали в ЕД/л. Величину оптической плотности измеряли на спектрофотометре ПЭ-5400В [23].

Определение активности глутатионпероксидазы

Активность глутатионпероксидазы (ГП) определяли в сопряженной глутатионредуктазной реакции по убыли НАДФН. Среда инкубации включала: 1 ммоль/л ЭДТА, 50 мМ К,Na-фосфатный буфера, рН 7,4; 1 ед. акт./мл глутатиоредуктазы; 20 ммоль/л НАДФН; 1 ммоль/л глутатиона (GSH); 30–60 мкг белка на 1 мл среды. Экстинкцию проб регистрировали при λ=340 нм. Реакцию начинали добавлением гидропероксида кумола в концентрации 1,5 ммоль/л проводили при температуре 25°С. Активность ГП выражали в ЕД/л. Величину оптической плотности измеряли на спектрофотометре ПЭ-5400В [24].

Статистический анализ

Статистическую обработку полученных результатов производили с применением программного пакета Statistica 6.0 (StatSoft, США). Данные выражали в виде M±SEM. Статистически значимые отличия между группами тестирования in vivo определяли методом однофакторного дисперсионного анализа с пост-тестом Ньюмена-Кейсла. Величину IC₅₀ для тестов in vitro рассчитывали методом пробит-анализа. Показатель LD₅₀ определяли методом максимального правдоподобия с применением программного обеспечения AOT425statpgm report (OECD TG 425 2002, США) [25].

РЕЗУЛЬТАТЫ

Изучение суммарного содержания антиоксидантов

Общее содержание антиоксидантов в пересчете на кверцетин и галловую кислоту, площади пиков, кратность разбавления представлены в таблице 1.

 

Таблица 1 – Содержание антиоксидантов (в пересчете на кверцетин и галловую кислоту) в извлечениях из Actinidia argutа (Siebold et Zucc.) Planch. ex Miq. листьев

Название сырья	Используемые экстрагенты	Площадь пика (нА/с)	Кратность разбавления анализируемого образца	Содержание антиоксидантов, мг/г (n=6) в пересчете
				на кверцетин	на галловую кислоту
Листья	спирт этиловый 95٪	2963,04	–	0,268±0,005	0,172±0,003
	спирт этиловый 70٪	3210,95	2	0,584±0,009	0,375±0,004
	спирт этиловый 40%	4262,38	6	2,215±0,007	1,436±0,006
	вода очищенная	3991,70	2	0,734±0,007	0,475±0,005

 

Установлено содержание антиоксидантов в исследуемых извлечениях, полученных экстракцией актинидии листьев водой очищенной, спиртом этиловым различной концентрации. Анализируя данные таблицы 1, можно сделать вывод, что максимальное содержание суммы антиоксидантов в пересчете на кверцетин и галловую кислоту обнаружено в извлечении актинидии листьев, полученном экстракцией спиртом этиловым 40%.

Оценка антиоксидантной активности in vitro

При исследовании антиоксидантных свойств изучаемых извлечений в тестах in vitro было установлено, что в отношении DPPH-радикала анализируемого извлечения характеризовались незначительной ингибирующей активностью, о чем может свидетельствовать значение IC₅₀, которое для объектов под шифрами А95, А70 и АВ составляло 1150,9±52,321 мкг/мл, 1660,9±45,954 мкг/мл и 1918,5±85,617 мкг/мл соответственно. В то же время IC₅₀ для извлечений из Actinidia folia, полученных экстракцией спиртом этиловым 40%, и кверцетина составляло 537,6±23,924 мкг/мл и 519,4±45,296 мкг/мл соответственно (рис. 1).

 

Рисунок 1 – Результаты оценки DPPH-ингибирующей активности исследуемых извлечений и кверцетина. Примечание: А95 – извлечение из листьев актинидии, полученное экстракцией спиртом этиловым 95%; А70 –извлечение из листьев актинидии, полученное экстракцией спиртом этиловым 70%; А40 – извлечение из листьев актинидии, полученное экстракцией спиртом этиловым 40%; АВ – извлечение из листьев актинидии, полученное экстракцией водой очищенной.

 

В отношении супероксид-радикала наиболее выраженную ингибирующую активность проявляли изучаемые извлечения под шифрами А95, А40 и кверцетин: показатель IC₅₀ составил 30,7±1,238 мкг/мл, 26,6±2,627 мкг/мл и 11,3±1,974 мкг/мл соответственно. При этом извлечения А70 (IC₅₀ = 204,3±9,114 мкг/мл) и АВ (IC₅₀ = 262,9±7,856 мкг/мл) генерацию супероксид-радикала в модельной среде ингибировали в меньшей степени (рис. 2).

 

Рисунок 2 – Результаты оценки супероксид-радикал-ингибирующей активности исследуемых экстрактов и кверцетина. Примечание: А95 – извлечение из листьев актинидии, полученное экстракцией спиртом этиловым 95%; А70 –извлечение из листьев актинидии, полученное экстракцией спиртом этиловым 70%; А40 – извлечение из листьев актинидии, полученное экстракцией спиртом этиловым 40%; АВ – извлечение из листьев актинидии, полученное экстракцией водой очищенной.

 

Образование гидроксил-радикала в модельной смеси наиболее значимо ингибировало внесение в среду исследуемого извлечения из листьев актинидии, полученного экстракцией спиртом этиловым 40% (IC₅₀ = 72,6±3,264 мкг/мл). В тоже время IC₅₀ для изучаемых объектов А95; А70; АВ и кверцетина составило 245,6±10,237 мкг/мл; 382,5±11,974 мкг/мл; 356,0±12,987 мкг/мл и 192,2±7,515 мкг/мл соответственно (рис. 3).

 

Рисунок 3 – Результаты оценки гидроксил-радикал-ингибирующей активности исследуемых извлечений и кверцетина. Примечание: А95 – извлечение из листьев актинидии, полученное экстракцией спиртом этиловым 95%; А70 –извлечение из листьев актинидии, полученное экстракцией спиртом этиловым 70%; А40 – извлечение из листьев актинидии, полученное экстракцией спиртом этиловым 40%; АВ – извлечение из листьев актинидии, полученное экстракцией водой очищенной.

 

Оценка «острой токсичности» исследуемых извлечений Actinidia folia

В ходе оценки «острой токсичности» (табл. 2) исследуемых извлечений было установлено, что при проведении «лимит-теста» (введение изучаемых объектов в дозе 5000 мг/кг, per os) как ранней, так и отсроченной гибели животных отмечено не было. При этом значимых отклонений в общем состоянии животных, поведенческой активности, сенсомоторном восприятии – не отмечалось. Таким образом, на основании данных, полученных в ходе реализации «лимит-теста», к проведению основного тестирования не приступали, а за величину LD₅₀ для всех исследуемых объектов принимали значение 5000 мг/кг, что позволяет отнести изучаемые извлечений Actinidia folia к 5-му классу токсичности по GSH-классификации²

 

Таблица 2 – Результаты определения «острой токсичности» исследуемых извлечений актинидии листьев

№ животного	Вес, г	Исследуемые объекты				Доза
		А95	А70	А40	АВ
1	22	О (S)				5000 мг/кг, per os
2	21	О (S)
3	20	О (S)
4	23		О (S)
5	22		О (S)
6	20		О (S)
7	24			О (S)
8	25			О (S)
9	25			О (S)
10	24				О (S)
11	21				О (S)
12	22				О (S)

Примечание: О – отсутствие гибели в первые сутки наблюдения; (S) – отсутствие гибели в течении 14-ти дней наблюдения.

 

Оценка антиоксидантной активности исследуемых извлечений из листьев актинидии in vivo

Основываясь на результатах определения «острой токсичности» изучаемых извлечений актинидии листьев, вводимая доза исследуемых объектов, при оценке антиоксидантной активности in vivo, составила 100 мг/кг (перорально). Результаты данного блока экспериментальной работы представлены в таблице 2.

На фоне 10-ти дневного введения кверцетина животным без патологического фона отмечено повышение активности СОД и каталазы по сравнению с интактными животными на 31,6% (p<0,05) и 49,1% (p<0,05). При этом каталитические свойства ГП у крыс, получавших кверцетин, статистически значимо не отличались от таковых у интактных животных (табл. 3). Также следует отметить, что при применении кверцетина, наблюдалось снижение (относительно интактных крыс) концентрации ДК и ТБК-АП в сыворотке крови животных на 30,3% (p<0,05) и 32% (p<0,05) соответственно. Как видно из полученных данных (табл. 3), курсовое введение животным без патологии извлечений под шифрами А95, А70 и АВ значимого влияния на изменение про/антиоксидантного равновесия не оказало. В тоже время при применении извлечения А40 отмечено повышение активности СОД, ГП и каталазы в сравнении с интактными крысами на 23,5% (p<0,05); 10,3% (p<0,05) и 37,7% (p<0,05) соответственно, сопровождаемое уменьшением концентрации ТБК-АП и ДК на 30,5% (p<0,05) и 32,3% (p<0,05) соответственно. При этом показатели, характеризующие состояние про/антиоксидантного равновесия, у животных, получавших кверцетин и изучаемые извлечения актинидии листьев, полученные экстракцией спиртом этиловым 40%, статистически значимо не отличались. Следует отметить, что активность СОД в сыворотке крови крыс, которым вводили экстракт А40, была на 21,9% (p<0,05); 20,8% (p<0,05) и 19,8% (p<0,05) выше аналогичного показателя у животных, получавших исследуемые объекты под шифрами А95, А70 и АВ соответственно. Также активность каталазы при применении извлечений А40 превосходила таковую у животных, которые получали экстракт А70 на 56,3% (p<0,05).

 

Таблица 3 – Изменение про/антиоксидантного равновесия на фоне курсового введения исследуемых извлечений и кверцетина животным без патологии

Группа	Интактные животные (n=10)	А95 (n=10)	А70 (n=10)	А 40 (n=10)	АВ (n=10)	Кверцетин (n=10)
СОД, Ед/л	300,5±7,129 µ	304,4±8,432 µ	307,1±8,391µ	371±8,377*	309,5±7,973 µ	395,47±8,439*
ГП, ЕД/л	602,6±5,946	601,56±6,188	603,71±6,163	664,91±9,779*	604,75±9,050	657,29±6,129
Каталаза, нмоль/мин/мл	0,863±0,0145	0,944±0,024	0,76±0,076 µ	1,188±0,084*	0,919±0,041	1,287±0,082*
ТБК-АП, нмоль /мл	5,4±0,524	4,36±0,611	4,43±0,298	3,75±0,173*	4,62±0,596	3,67±0,655*
ДК, нмоль/мл	10,8±0,696	9,71±0,31	9,74±0,454	7,31±0,271*	9,55±0,21	7,52±0,481*

Примечание: * – статистически значимо относительно интактных животных (p<0,05; критерий Ньюмена-Кейсла); µ – статистически значимо относительно животных, получавших извлечение А40 (p<0,05; критерий Ньюмена-Кейсла).

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Активные формы кислорода (АФК) образуются в клетках в процессе метаболизма и выполняют множество физиологических процессов, таких как регуляция клеточной пролиферации, микроциркуляторного кровотока, реакций апоптоза, экспрессия генов [26].

Однако гиперпродукция свободных радикалов негативно сказывается на состоянии клеток и всего организма в целом. Нарушение редокс-равновесия между продукцией АФК и их инактивацией системой антиоксидантной защиты обуславливает пероксидацию мембранных липидов, структурных белков, ДНК, углеводов, ферментов, что, в конечном счете, приводит к гибели клетки [27].

В определенных физиологических рамках система эндогенной антиоксидантной защиты призвана уменьшать отрицательное влияние оксидантов на организм. Эндогенные антиоксидантные ферменты, такие как каталаза, супероксиддисмутаза, глутатионпероксидаза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, глутатионредуктаза, обеспечивают своевременную инактивацию АФК, что предотвращает их негативное влияние на клетки [28].

В то же время смещение редокс-статуса в сторону прооксидантов и недостаточная активность ферментов эндогенной антиоксидантной защиты способствуют развитию окислительного стресса, который играет существенную роль в патогенезе ряда заболеваний: онкопатология, сахарный диабет, сердечно-сосудистые заболевания, алкогольная дистрофия печени, деменция, атеросклероз, болезнь Паркинсона [29].

Известно, в ряду АФК наибольшей цитотоксичностью обладают супероксидный радикал и его производные (пероксонитрит), а также гидроксильный радикал, которые посредством прямого деструктивного действия и косвенных реакций (как правило с вовлечением в патологический каскад вторичных эффекторных систем, например, ERK и MAPK-киназы) приводят к гибели клетки [30].

Недостаточная активность эндогенной антиоксидантной защиты и сопряженный с этим рост количества АФК требуют назначения экзогенных антиоксидантов, среди которых особенно выделяются средства природного происхождения [31].

Данное исследование было посвящено изучению антиоксидантной активности извлечений, полученных из листьев актинидии. В работе оценена антиокислительная активность 95%, 70% и 40% спиртовых извлечений, а также водного извлечения c применением in vitro и in vivo подходов. Так, при изучении антирадикальной активности (in vitro тесты) установлено, что наиболее высокой (в ряду изучаемых объектов) радикал-ингибирующей активностью, сопоставимой с индивидуальным соединением – кверцетином, обладает извлечение из актинидии аргута листьев, полученные экстракцией спиртом этиловым 40%. Величина IC₅₀ для данного извлечения в отношении DPPH; супероксид и гидроксил-радикала составила 537,6±23,924 мкг/мл, 26,6±2,627 мкг/мл и 72,6±3,264 мкг/мл соответственно, что может свидетельствовать о наличии у данного извлечения восстановительных и радикал-скэвенджерных свойств [32].

Параллельно проводилось изучение суммарного содержание антиоксидантов в пересчете на кверцетин и галловую кислоту. Также было обнаружено в извлечении актинидии аргута листьев, полученном экстракцией спиртом этиловым 40%, максимальное содержание антиоксидантов.

Известно, что DPPH – тест является наиболее распространённым подходом для оценки акцепторных свойств фенольных соединений. Принцип анализа основан на принципе восстановления свободного радикала DPPH путем акцептирования атома водорода из соединения-донора и конверсии окраски из фиолетовой в желтую. Таким образом, данный подход позволяет с достаточно высокой достоверностью оценить акцепторные свойства биологически активных веществ [33].

В тоже время супероксид- и гидроксил радикал in vitro тесты основаны на способности анализируемого объекта подавлять образование АФК в модельной среде и, соответственно, позволяют оценить скэвенджерную активность [34, 35].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Максимальное содержание антиоксидантов для актинидии аргута листьев 0,73±0,007 и 0,47±0,005 мг/г в пересчете на кверцетин и галловую кислоту соответственно. Экстрагент – спирт этиловый 40%.

Данные, полученные в тесте in vitro, были подтверждены в исследовании in vivo, в котором курсовое применение извлечения актинидии листьев, полученного экстракцией спиртом этиловым 40%, в сопоставимой с кверцетином степени, способствовало увеличению активности СОД, ГП и каталазы. Также данное извлечение способствовало снижению продуктов липопероксидации у животных без патологического фона, что дает основание предполагать наличие у исследуемого экстракта А40 высокой антиоксидантной активности. Все вышесказанное в совокупности с низкой токсичностью (LD₅₀≥5000 мг/кг, перорально) делает данное извлечение перспективным объектом для дальнейшего изучения с целью создания лекарственного средства с антиоксидантным действием.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторский коллектив выражает искреннюю благодарность безвременно ушедшему из жизни, д.м.н., профессору А.В. Воронкову за помощь в подготовке данной статьи.

ФИНАНСОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Данное исследование не имело финансовой поддержки от сторонних организаций.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ВКЛАД АВТОРОВ

Д.И. Поздняков – разработка концепции исследования, постановка in vivo эксперимента, статистическая обработка результатов исследования, подготовка окончательного варианта рукописи; С.Л. Аджиахметова – разработка концепции исследования, получение анализируемых экстрактов, проведение in vitro исследования, подготовка окончательного варианта рукописи; Н.Н. Вдовенко-Мартынова – анализ литературы, идентификация сырья, получение анализируемых экстрактов, подготовка окончательного варианта рукописи.

 

¹ Directive 2010/63 / EU of the European Parliament and of the councilon the protection of animals used for scientific purposes, September 22, 2010.

² Там же.

Об авторах

Дмитрий Игоревич Поздняков

Пятигорский медико-фармацевтический институт – филиал федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Автор, ответственный за переписку.
Email: pozdniackow.dmitry@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5595-8182

кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры фармакологии с курсом клинической фармакологии

Россия, 357532, Пятигорск, пр-кт Калинина, д. 11

Симилла Леонтьевна Аджиахметова

Пятигорский медико-фармацевтический институт – филиал федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: similla503@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6924-8563

кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры органической химии

Россия, 357532, Пятигорск, пр-кт Калинина, д. 11

Наталия Николаевна Вдовенко-Мартынова

Пятигорский медико-фармацевтический институт – филиал федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: martynovann@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-6425-4315

кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры фармакогнозии, ботаники и технологии фитопрепаратов

Россия, 357532, Пятигорск, пр-кт Калинина, д. 11

Список литературы

Дополнительные файлы