Гемостимулирующие свойства конъюгатов гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора с алендроновой кислотой

Полный текст

Список сокращений: АЛН – алендроновая кислота; ГМ-КСФ – гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор; рчГМ-КСФ – рекомбинантный гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор человека; ГАП – гидроксилапатит; EDC – 1-этил-3-[3-диметиламинопропил] карбодиимид; ЦФ – циклофосфан; ИФА – иммуноферментный анализ; ОКК – общее количество кариоцитов.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность поиска новых средств и способов лечения нейтропений различной этиологии, возникающих, в частности, в результате химио- и радиотерапии онкологических больных, чрезвычайно высока. Индуцированные химиотерапией нарушения гемопоэза и прежде всего, подавление продукции лейкоцитов, в ряде случаев становятся основными показателями для прерывания лечения, несмотря на отчетливый онколитический эффект терапии [1].

Природный белок-цитокин – гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ), который регулирует пролиферацию и дифференцировку стволовых клеток с образованием колоний нейтрофильных, эозинофильных лейкоцитов и макрофагов [2–4]. Способность ГМ-КСФ усиливать гемопоэз послужила основанием для разработки и введения в клиническую практику лекарственных препаратов на его основе, Leukine и Leucomax (США), для снижения побочных эффектов противоопухолевой терапии, усиления устойчивости к инфекциям, при трансплантации костного мозга. Однако, несмотря на высокий уровень безопасности препаратов ГМ-КСФ, их применение приводит к развитию побочных реакций, таких как лихорадка, озноб, летаргия, миалгия, костные боли, повышение температуры, колебания массы тела, генерализованный кожный зуд, покраснение и эритематозная реакция вокруг места подкожной инъекции [5–8]. В связи с этим, несомненный интерес представляет усовершенствование препаратов ГМ-КСФ в части повышения их тропности к тканям-мишеням, снижения терапевтической дозы и, как следствие, побочных эффектов лечения.

В литературных источниках описаны примеры использования различных векторных молекул для адресной доставки иммунорегуляторных лигандов, в частности, цитокинов [9–11]. В качестве средств доставки биологически активных веществ в костную ткань и костный мозг используют бисфосфонаты, отличающиеся высоким сродством к ионам кальция и способностью к быстрому накоплению в кости [12–17]. Одним из методических приемов при получении таргетных лекарственных средств на основе бисфосфонатов является их конъюгирование с лекарственными веществами [12, 13].

Принимая во внимание все вышесказанное, нами были получены конъюгаты человеческого фактора некроза опухоли альфа с аминобисфосфонатом алендроновой кислотой (АЛН), которые продемонстрировали способность накапливаться в очагах костного метастазирования опухоли, проявляя тем самым противоопухолевую активность [18, 19]. Эти данные стали основанием для использования АЛН в качестве векторной молекулы для доставки к клеткам костного мозга рекомбинантного гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека (рчГМ-КСФ).

В ИМБТ ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора разработана технология получения рчГМ-КСФ в прокариотической системе экспрессии (рекомбинантный штамм E. coli SG20050/p280_2GM) [20], а также способы конъюгирования рчГМ-КСФ с АЛН с использованием разных типов сшивающих агентов [21]. Показано, что полученные конъюгаты обладают повышенным, по сравнению с рчГМ-КСФ, сродством к гидроксилапатиту – аналогу минерального матрикса костной ткани. Оценка специфической активности конъюгатов in vitro подтвердила сохранность биологической активности рчГМ-КСФ в их составе [21].

ЦЕЛЬ. Оценка гемостимулирующей активности конъюгатов рчГМ-КСФ с алендроновой кислотой на модели цитостатической миелосупрессии, а также изучение динамики накопления рчГМ-КСФ в составе конъюгата в костной ткани и костном мозге мышей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследуемые препараты

Экспериментальные препараты представляли собой конъюгаты рчГМ-КСФ с АЛН, полученные описанными способами [21]. Ключевым моментом в процессе синтеза был выбор условий, позволяющих минимизировать конформационные изменения молекул белка с целью сохранения его биологической активности. Для этого использовались эквимолярные количества белка рчГМ-КСФ и АЛН. В качестве сшивающего агента был выбран 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимид (EDC); декстран с молекулярной массой 40000 Да, активированный периодатом, применяли в качестве линкера. Конъюгацию с помощью EDC осуществляли двумя способами: методом прямой (рчГМ-КСФ →EDC → AЛН) и обратной (AЛН →EDC → рчГМ-КСФ) последовательности нанесения компонентов на твердую фазу (сорбент гидроксилапатит, ГАП). При конъюгировании методом прямой последовательности хроматографическую колонку с ГАП уравновешивали 2 мМ калий-фосфатным буфером, рН 7,0. На уравновешенную колонку наносили раствор белка рчГМ-КСФ, после сорбции которого также на колонку подавали раствор EDC. Выход раствора из колонки перекрывали на 2 ч для связывания компонентов, затем колонку промывали 2 мМ калий-фосфатным буфером (рН 7,0) и наносили раствор AЛН. Для освобождения от несвязавшихся компонентов колонку повторно промывали фосфатным буфером. Элюцию полученного конъюгата с колонки проводили 0,2 М калий-фосфатным буфером, рН 7.0. Синтезированный конъюгат переводили в физиологический раствор диализом.

При использовании декстрана в качестве линкера при конъюгировании его вносили в раствор, содержащий периодат натрия, с целью образования реакционноспособных альдегидных групп в соотношении 1:40 (моль/моль), перемешивали и инкубировали при 20°С в течение часа. Активированный декстран отделяли гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-25. В раствор декстрана вносили растворы белка и AЛН в эквимолярных соотношениях: на 1 моль декстрана 1 моль белка и 1 моль AЛН. Полученную смесь инкубировали 3 ч при 20°С. Для удаления непрореагировавших компонентов проводили гель-фильтрацию на колонке с сефадексом G-25. Синтезированный конъюгат переводили в физиологический раствор диализом.

Были получены конъюгаты трех типов:

1 – GEA – конъюгат рчГМ-КСФ с АЛН, полученный с помощью синтеза на твердой фазе через карбоксильную группу белка с использованием EDC методом прямой (белок→EDC→AЛН) последовательности нанесения компонентов на сорбент, с концентрацией белка 1,09 мг/мл (рис. 1, дорожка 1);

2 – AEG – конъюгат рчГМ-КСФ с АЛН, полученный с помощью синтеза на твердой фазе через карбоксильную группу белка с использованием EDC методом обратной (AЛН→EDC→белок) последовательности нанесения компонентов на сорбент, с концентрацией белка 1,45 мг/мл (рис. 1, дорожка 2);

3 – DGA – конъюгат рчГМ-КСФ с АЛН, полученный синтезом через аминогруппу белка с использованием в качестве линкера молекулы декстрана с помощью реакции Малапрада [22], с концентрацией белка 0,86 мг/мл (рис. 2, дорожка 1).

 

Рисунок 1 – Электрофореграмма конъюгатов, полученных в результате прямой последовательности нанесения GEA (1) и обратной последовательности AEG (2). Примечание: Электрофорез в 15 % полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях, окрашивание Кумасси R-250. Дорожки: 3 – белковый маркер 10–250 кДа; 4 – белок рчГМ-КСФ, 20 мкг.

 

Рисунок 2 – Электрофореграмма конъюгата, полученного с помощью декстрана (1). Примечание: Электрофорез в 15% полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях, окрашивание Кумасси R-250. Дорожки: 2 – белок рчГМ-КСФ, 20 мкг; 3 – белковый маркер 10–250 кДа.

 

Препарат сравнения

Белок рчГМ-КСФ, полученный в ИМБТ ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора по описанному методу [23], использовали в качестве препарата сравнения и для получения конъюгатов с АЛН. Субстанция белка была охарактеризована по показателям качества в соответствии с требованиями нормативной документации¹. Концентрация белка в используемой субстанции составляла 1,5 мг/мл, гомогенность препарата 99,2%.

Экспериментальные животные

Исследование проведено на 66 здоровых самцах мышей линии СВА/Calaс c массой тела 19–23 г, полученных из питомника НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ, и 45 самках белых беспородных мышей CD-1 (ICR) массой 22–25 г из питомника ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (р.п. Кольцово, Новосибирской обл.). Возраст животных составлял 2,0–2,5 месяца. Перед началом исследования животные прошли период адаптационного карантина. Мыши содержались в стандартных условиях вивария при постоянной температуре и влажности, корм и питье были доступны в любое время суток. Содержание животных и экспериментальные исследования проводили в соответствии требованиями Международной конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и научных целей (Страсбург, 1986 год), а также с соблюдением директивы 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 года по охране животных, используемых в научных целях. Исследования были одобрены Биоэтической комиссией ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (протокол № 5 от 01.10.2020 г.).

Метод оценки гемостимулирующей активности коньюгатов

Гемостимулирующую активность препаратов исследовали на модели цитостатической миелосупрессии, вызванной введением мышам СВА/Calaс циклофосфана (ЦФ, «Sigma-Aldrich», США) [24].

Животные были разделены на 5 экспериментальных групп (4 опытные и 1 контрольная) по 12 самцов мышей в каждой. Всем экспериментальным животным однократно внутрибрюшинно вводили раствор ЦФ в максимально переносимой дозе (250 мг/кг) в объеме 0,25 мл на 20 г массы тела.

Через 24 ч после инъекции ЦФ мышам опытных групп в течение 4–5 сут вводили подкожно один из следующих препаратов: 1) рчГМ-КСФ; 2) конъюгат GEA; 3) конъюгат AEG; 4) конъюгат DGA. Доза введения, определенная ранее как эффективная гемостимулирующая с использованием препарата рчГМ-КСФ [25], составляла 90 мкг/кг, объем введения 0,2 мл на 20 г массы тела животного. Мыши контрольной группы получали подкожно физиологический раствор в эквивалентном объеме по аналогичной схеме. В качестве дополнительной контрольной группы использовали шесть интактных животных (без введения препаратов рчГМ-КСФ и ЦФ). Все манипуляции с животными проводились в одно и то же время (в утренние часы).

Через сутки после окончания курса введения препаратов (на 5 сут после введения ЦФ) у половины животных из каждой группы забирали на анализ образцы крови из кончика хвоста, а после цервикальной дислокации шейных позвонков – образцы костного мозга. Вторая половина животных в этот день получала еще одну инъекцию препаратов, биоматериал на анализ забирали через 24 ч после введения.

В образцах крови методом световой микроскопии определяли общее количество лейкоцитов (кровь разводили в 20 раз 3%-ным раствором уксусной кислоты, подсчет проводили в камере Горяева), относительное и абсолютное содержание нейтрофилов и других морфологических форм лейкоцитов. В образцах костного мозга подсчитывали общее количество кариоцитов (ОКК) и рассчитывали количество клеток на бедро. Для получения костного мозга выделяли бедренную кость мыши, очищали ее от мягких тканей бедра и тщательно промывали костномозговой канал 3%-ным раствором уксусной кислоты в объеме 1 мл. Подсчет ОКК осуществляли с помощью камеры Горяева.

Метод изучения динамики накопления рчГМ-КСФ

Для изучения динамики накопления рчГМ-КСФ в костной ткани и костном мозге самок мышей CD-1 разделили на 3 группы: контрольную (5 особей) и две опытные (по 20 особей). Накануне эксперимента в конце рабочего дня мышей пересаживали в чистые клетки без корма. Корм животным давали через 2 часа после введения препаратов, воду – без ограничений.

Животные первой опытной группы получали внутривенную инъекцию рчГМ-КСФ, мышам второй опытной группы вводили конъюгат AEG. Препараты вводили в дозе 90 мкг/кг массы тела, по 0,2 мл на 20 г веса животного. Контрольными животными (третья группа) служили интактные мыши.

Спустя 3 мин, 1, 4 и 24 ч после введения препаратов у 5 животных из каждой опытной группы после эвтаназии забирали кровь и одну бедренную кость. У мышей контрольной группы брали аналогичный материал в первый день эксперимента. Из крови получали сыворотку, из бедренной кости извлекали костный мозг путем промывания костномозгового канала 0,9%-ным раствором хлорида натрия в объеме 1 мл. Клетки костного мозга ресуспендировали дозатором до гомогенной суспензии. Бедренную кость после удаления костного мозга взвешивали и готовили 10%-ный гомогенат в 0,1 М калий-фосфатном буфере (рН 7,2), на гомогенизаторе «GlasCol» (США). Полученный биоматериал хранили при температуре не выше –20°С. В день проведения анализа гомогенаты костного мозга и бедренных костей размораживали, центрифугировали (центрифуга 5810R, Eppendorf, Германия) при 5000 g и температуре 2–8°С в течение 5 мин, отбирали супернатанты.

В сыворотке крови и супернатантах гомогенатов определяли содержание рчГМ-КСФ иммуноферментным анализом (ИФА) с применением наборов реагентов для определения ГМ-КСФ человека в сыворотке, плазме крови, супернатантах культур клеток и гомогенатов органов «Human Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (ГМ-КСФ) ELISA Kit», «CUSABIO», КНР. Диапазон определяемых концентраций стандартного образца, входящего в состав набора, составлял 15,6–1000 пг/мл, чувствительность – менее 3,9 пг/мл.

Статистическая обработка полученных результатов

Полученные результаты обрабатывали с помощью пакета программ «Statgraphics, Versin 5.0» «Statistical Graphics Corp.», США. В связи с малыми объемами выборок для оценки значимости межгрупповых различий применяли непараметрические критерии – двухвыборочный U-критерий Манна-Уитни и H-критерий множественных сравнений Краскела-Уоллиса с критическим уровнем статистической значимости (р), равным 0,05. При обнаружении статистически значимых различий в Н-тесте проводили апостериорные сравнения с помощью U-критерия, при этом скорректированный критический уровень значимости (р) для трех попарных сравнений принимали равным 0,0170 [26, 27]. Экспериментальные данные представлены в виде средней арифметической величины и стандартной ошибки (М±m). Рисунки построены с использованием программы Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование показало, что однократное введение мышам ЦФ в дозе 250 мг/кг приводило к закономерному развитию миелосупрессии. Общее количество кариоцитов костного мозга у мышей контрольной группы на 5-е сут после введения ЦФ снизилось в 1,5 раза, лейкоцитов крови в 5,5 раза, количество сегментоядерных нейтрофилов – в 13,9 раз.

Изменение числа лейкоцитов, сегментоядерных нейтрофилов и клеток костного мозга мышей после введения препаратов оценивали по сравнению с показателями контрольной группы (физиологический раствор), значения которых принимали за 100 %. Введение животным как препарата рчГМ-КСФ, так и его конъюгатов с АЛН, приводило к более быстрому статистически значимому (p ≤0,05) увеличению числа лейкоцитов крови по сравнению с контрольными показателями (рис. 3). На 5-е сут после введения ЦФ число лейкоцитов крови мышей, получавших препараты рчГМ-КСФ, превышало контрольный показатель на 46–100%, на 6-е сут – на 56–94%. Существенных отличий в уровне стимуляции лейкопоэза в группах, которым вводили конъюгаты разного типа, либо рчГМ-КСФ, не наблюдалось.

 

Рисунок 3 – Количество лейкоцитов в периферической крови мышей линии СВА на фоне введения ЦФ, препарата рчГМ-КСФ и его конъюгатов с АЛН. Примечание: по оси абсцисс – сроки исследования (сутки). * – статистически значимое отличие по отношению к контролю (физиологическому раствору); ** – статистически значимое отличие по отношению к рчГМ-КСФ при p ≤0,05. Область между пунктирными прямыми – доверительный интервал показателя у интактных мышей.

 

В группах мышей, которым вводили конъюгаты GEA и DGA, на 5-е сут после введения ЦФ отмечено статистически значимое увеличение числа сегментоядерных нейтрофилов по сравнению с контролем (на 414 и 200%, соответственно, p ≤0,05), на 6-е сут повышенные (на 77 и 169%) значения показателя зарегистрированы во обеих группах с введением конъюгатов. Достоверный стимулирующий эффект исходного рчГМ-КСФ был отмечен лишь на 6-е сут, число сегментоядерных нейтрофилов крови в этот период повышалось на 218% по сравнению с показателем животных, получавших физиологический раствор (рис. 4).

 

Рисунок 4 – Количество сегментоядерных нейтрофилов в периферической крови мышей линии СВА на фоне введения ЦФ, препарата рчГМ-КСФ и его конъюгатов с АЛН. Примечание: по оси абсцисс – сроки исследования (сутки). * – статистически значимое отличие по отношению к контролю (физиологическому раствору); ** – статистически значимое отличие по отношению к рчГМ-КСФ при p ≤0,05. Область между пунктирными прямыми – доверительный интервал показателя у интактных мышей.

 

Из данных, представленных на рисунке 5, видно, что введение рчГМ-КСФ приводило к статистически значимому увеличению общего числа кариоцитов через 5 сут на 43% после введения ЦФ по сравнению с контрольными значениями. Аналогичные, но более выраженные, изменения были отмечены в группах мышей, которым вводили конъюгаты. При этом максимальным был эффект DGA (повышение показателя на 100% по сравнению с контролем). Через 6 сут после введения цитостатика число кариоцитов в костном мозге мышей, которым вводили конъюгаты, на 58–63% превышало уровень контроля и на 30–34% уровень показателя, зарегистрированного после введения рчГМ-КСФ.

 

Рисунок 5 – Количество кариоцитов в костном мозге мышей линии СВА на фоне введения ЦФ, препарата рчГМ-КСФ и его конъюгатов с АЛН. Примечание: по оси абсцисс – сроки исследования (сутки). * – статистически значимое отличие по отношению к контролю (физиологическому раствору); ** – статистически значимое отличие по отношению к рчГМ-КСФ при p ≤0,05. Область между пунктирными прямыми – доверительный интервал показателя у интактных мышей.

 

Таким образом, конъюгирование рчГМ-КСФ с АЛН не приводило к снижению гемостимулирующей активности белка. Не обнаружено значимых различий в уровне лейкостимулирующей активности исследованных препаратов. Конъюгаты GEA и DGA ускоряли восстановление числа нейтрофилов крови мышей. Конъюгаты AEG и DGA оказывали более выраженное по сравнению с ГМ-КСФ стимулирующее действие на продукцию клеток костного мозга, что проявлялось в более интенсивном и более раннем увеличении общей клеточности костного мозга после воздействия цитостатика.

Усиление стимулирующего эффекта рчГМ-КСФ в составе конъюгата на продукцию кариоцитов, очевидно, может быть связано с повышенной тропностью белка к клеткам костной ткани.

Для подтверждения адресной доставки рчГМ-КСФ в составе конъюгата с АЛН в костную ткань было проведено сравнительное изучение накопления препарата в костной ткани и костном мозге после внутривенного введения препарата рчГМ-КСФ и его конъюгата AEG.

Динамика изменения концентрации белка в крови, костной ткани и костном мозге мышей после однократного внутривенного введения препарата рчГМ-КСФ и его конъюгата в эффективной гемостимулирующей дозе (90 мкг/кг) представлена в таблице 1.

 

Таблица 1 – Динамика изменения уровня рчГМ-КСФ в крови, костной ткани и костном мозге мышей после однократного внутривенного введения препаратов

Препарат	Концентрация рчГМ-КСФ в образцах
	Сыворотка крови, пг/мл
	3 мин	1 ч	4 ч	24 ч
рчГМ-КСФ	151715±32571	3138±214	24,5±2,3	0,174±0,148
Конъюгат AEG	406468±54586**	8500±2539**	48,8±9,0**	0,676±0,676
	Бедренная кость, пг/г
Контроль	184±139
рчГМ-КСФ	3869±458*	322±151	436±52	137±105
Конъюгат AEG	11154±1613*,**	1108±387	1706±374*,**	1652±449
	Костный мозг бедренной кости, пг/бедро
Контроль	3,52±2,03
рчГМ-КСФ	237±36*	9,84±7,47	0±0	1,20±1,20
Конъюгат AEG	567±127*	20,3±12,8	5,64±5,64	15,7±9,7

Примечание: экспериментальные данные представлены в виде средней арифметической величины и стандартной ошибки (М±m); * – отличия статистически значимы, по сравнению с контролем; ** – отличия статистически значимы, по сравнению с показателем мышей, которым вводили рчГМ-КСФ (р <0,05 для крови; р <0,017 для тканей).

 

Полученные данные свидетельствуют о том, что наибольшие значения рчГМ-КСФ в крови мышей были зарегистрированы через 3 мин после введения препаратов и составляли 19,2% от введенной дозы у мышей, получавших конъюгат AEG, и 7,2% у мышей после введения рчГМ-КСФ (табл. 1). Белок сохранялся в сыворотке крови мышей обеих экспериментальных групп в течение 4 ч наблюдения. Через 1 час после введения препаратов значения показателя уменьшались по сравнению с точкой «3 мин» в 48 раз и в последующие сроки отмечено их дальнейшее снижение до уровня фона. Концентрация рчГМ-КСФ в крови мышей, получавших инъекцию конъюгата, превышала соответствующий показатель после введения рчГМ-КСФ в 2,7 раза через 3 мин и 1 ч, в 2 раза – через 4 ч после введения (различия статистически значимы, p ≤0,05). Через 24 ч после введения рчГМ-КСФ в незначительных количествах был обнаружен в крови двух животных из пяти после введения препарата рчГМ-КСФ и у одной мыши из пяти, получавших инъекцию конъюгата AEG. В сыворотке крови контрольных животных значения показателя ни в один из сроков наблюдения не отличались от нуля.

Наибольший уровень рчГМ-КСФ в гомогенатах бедренных костей мышей был обнаружен через 3 мин после введения препаратов. При этом содержание белка в костной ткани мышей, получавших конъюгат, в этой точке в 60 раз превышало показатель животных с введением рчГМ-КСФ. В последующие сроки концентрация белка во всех бедренных костях мышей, которым вводили рчГМ-КСФ, снижалась до уровня контроля (1 ч после введения, табл. 1). В образцах костной ткани мышей, получавших инъекцию конъюгата AEG, концентрация рчГМ-КСФ через 1 ч после введения превышала контрольный уровень в 6 раз (отличия статистически недостоверны, p ≤ 0,017), в последующие сроки (4 и 24 ч) – в 9 раз (статистические отличия наблюдались в 4-часовой точке). Через 24 ч после введения только у двух из пяти мышей, получивших инъекции рчГМ-КСФ, в костной ткани было обнаружено повышенное содержание рчГМ-КСФ (541 и 146 пг/г ткани), тогда как более высокий, чем в контроле, уровень рчГМ-КСФ (от 1408 до 2460 пг/г) после введения конъюгата AEG наблюдался у четырех из пяти животных.

Максимальную концентрацию рчГМ-КСФ в костном мозге мышей обеих опытных групп, также как в крови и гомогенатах бедренных костей, регистрировали в первой точке, через 3 минуты после введения (табл. 1). Значения показателя у мышей, которым вводили конъюгат AEG, в 161 раз превышали контрольные значения и в 2,4 раза – показатель мышей, которым вводили рчГМ-КСФ. В последующие сроки содержание белка в обеих опытных группах снижалось. Однако следует отметить, что через 4 и 24 ч после введения рчГМ-КСФ у всех пяти мышей белок в костном мозге не определялся, в то время как в группе, получившей конъюгат AEG, у 2 мышей были зарегистрированы следовые количества рчГМ-КСФ (от 28,2 до 42,2 пг/бедро).

Таким образом, введение в состав рчГМ-КСФ алендроновой кислоты способствовало повышению накопления и распределения рчГМ-КСФ в костной ткани и костном мозге мышей, что согласуется с имеющимися литературными данными о накоплении препаратов алендроновой кислоты в костной ткани, прочном связывании и удержании их костным матриксом [28–34]. Концентрация конъюгированного белка в крови в первые часы после введения была выше, чем свободного рчГМ-КСФ, что, возможно, связано с повышением в результате модификации устойчивости белка к протеолитическим ферментам и, как следствие, появлением у него способности дольше циркулировать в кровеносном русле.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Установлено, что конъюгаты рчГМ-КСФ с АЛН обладают гемостимулирующей активностью, сравнимой с активностью исходного белка. Эффект рчГМ-КСФ в составе конъюгатов на клетки костного мозга был более выраженным и продолжительным, что, по-видимому, связано с более длительным присутствием белка в составе конъюгата в крови и повышенным накоплением его в костной ткани и костном мозге. Полученные данные позволяют сделать вывод о перспективности дальнейших работ по созданию гемостимулирующих препаратов на основе конъюгатов рчГМ-КСФ с алендроновой кислотой.

ФИНАНСОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Исследование проведено в рамках работ по выполнению государственного задания ГНЦ ВБ “Вектор” Роспотребнадзора, тема ГЗ-39/21.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ВКЛАД АВТОРОВ

Г.Г. Шимина – проведение экспериментальных исследований, статистическая обработка данных, построение диаграмм, написание текста статьи; А.В. Батенева – литературный поиск, проведение экспериментальных исследований, статистическая обработка данных, написание текста статьи; Е.С. Цыпленкова – проведение экспериментальных исследований; С.Г. Гамалей – проведение литературного поиска, формирование цели и задач исследования, разработка дизайна исследования, доработка текста статьи; Т.И. Есина – получение препаратов для исследования; Волосникова Е.А. – получение препаратов для исследования; Е.Д. Даниленко – утверждение плана экспериментального исследования, редактирование и пересмотр содержания текста статьи, утверждение окончательной версии статьи.

 

¹ ОФС.1.7.1.0007.15 «Лекарственные средства, получаемые методами рекомбинантной ДНК» // Государственная фармакопея Российской федерации XIV издание. – Москва, 2018. – Т. 2. – С. 2575–2595. – [Электронный ресурс]. – Режим доступа: https://docs.rucml.ru/feml/pharma/v14/vol2/763/

Об авторах

Галина Григорьевна Шимина

Институт медицинской биотехнологии ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Автор, ответственный за переписку.
Email: shimina_gg@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0002-1078-7033

научный сотрудник отдела биологических исследований

Россия, 633004, Бердск, ул. Химзаводская, д. 9

Алена Владимировна Батенева

Институт медицинской биотехнологии ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Email: bateneva_av@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0002-3761-7798

научный сотрудник отдела биологических исследований

Россия, 633004, Бердск, ул. Химзаводская, д. 9

Елена Сергеевна Цыпленкова

Институт медицинской биотехнологии ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Email: tsyplenkova_es@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0002-1277-6258

младший научный сотрудник отдела биологических исследований

Россия, 633004, Бердск, ул. Химзаводская, д. 9

Светлана Георгиевна Гамалей

Институт медицинской биотехнологии ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Email: gamaley_sg@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0002-7441-333X

заведующий отделом биологических исследований

Россия, 633004, Бердск, ул. Химзаводская, д. 9

Татьяна Игоревна Есина

Институт медицинской биотехнологии ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Email: esina_ti@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0001-9006-8313

младший научный сотрудник отдела разработки технологий и пилотного производства биопрепаратов

Россия, 633004, Бердск, ул. Химзаводская, д. 9

Екатерина Александровна Волосникова

Институт медицинской биотехнологии ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Email: volosnikova_ea@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0001-5028-5647

кандидат биологических наук, заведующий лабораторией получения и анализа биосубстанций отдела разработки технологий и пилотного производства биопрепаратов

Россия, 633004, Бердск, ул. Химзаводская, д. 9

Елена Дмитриевна Даниленко

Институт медицинской биотехнологии ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Email: danilenko_ed@vector.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0001-5026-1602

кандидат биологических наук, директор

Россия, 633004, Бердск, ул. Химзаводская, д. 9

Список литературы

Дополнительные файлы