EXPERIMENTAL STUDY OF ANTI-THROMBOTIC ACTIVITY OF PENTOXYFILLIN MICROPARTICLES: BASED ON POLY-DL-LACTIDE-CO-GLYCOLIDE IN COMPARISON WITH PENTOXYFILLIN

Full Text

ВВЕДЕНИЕ В патологических состояниях, таких как инсульты и инфаркты пусковую роль играют тромбоцитарные тромбы [1]. Задачей фармации является разработка и исследование высокоэффективных лекарственных средств, комплексно воздействующих на сосудисто-тромбоцитарный гемостаз [2-5]. В ряду средств, нацеленных на улучшение реологических свойств крови, наиболее широкое применение получил пентоксифиллин [6, 7]. У пациентов с комплексной кардиоваскулярной патологией пентоксифиллин имеет наиболее убедительную базу для коррекции перфузионных растройств [8, 9]. При цереброваскулярных заболеваниях и заболеваниях периферических сосудов атеросклеротического генеза пентоксифиллин входит в стандарты лечения [10-13]. Его применение патогенетически и клинически обосновано для лечения больных системным атеросклерозом [14-16]. Известно, что пентоксифиллин играет роль слабого антагониста Р2Y- рецепторов, тем самым он конкурирует с АДФ за возможность связываться с этими рецепторами, в результате чего происходит уменьшение проагрегантного действия АДФ на пуриновые рецепторы и процесс сборки интегральных рецепторов. Пентоксифиллин способствует снижению агрегации и адгезии тромбоцитов, а также обладает вазодилатирующим эффектом. Так же он оказывает слабое кардиотоническое действие, оно обусловлено процессом блокировки фосфодиэстеразы III типа в кардиомиоцитах [1]. Gентоксифиллин снижает процесс синтеза фибриногена, а возникновение тканевого активатора плазминогена (I-PA) усиливает, это ведет к усилению активности фибринолитической системы [1, 17-20]. Первичный метаболизм пентоксифиллина происходит в крови, в процессе которого формируются до семи метаболитов, двое из которых характеризуются выраженной антиагрегантной активностью. В печени происходит конечный метаболизм пентоксифиллина [21]. Пентоксифиллин характеризуется хорошей переносимостью, за счет этого можно сочетать его применение со многими другими лекарственными препаратами. Существующие сегодня на фармацевтическом рынке препараты пентоксифилинна требуют трехкратного приема в сутки, что делает процесс лечения довольно комплаентным. Кроме того, в случае если больной не принял препарат вовремя, наблюдается не только снижение эффективности терапии, но и повышается риск нарушения гемореологических свойств крови. В связи с этим создание пролонгированного лекарственного средства пентоксифиллина является актуальным и перспективным [3, 22, 23]. Согласно литературным данным использование пролонгированных форм на основе РLGA (Соматулин, Сандостатин Лар и др.) позволяет увеличить биодоступность лекарственного средства и его доставку к органу мишени, поддерживать постоянную терапевтическую концентрацию в крови и уменьшить кратность приема. К достоинствам РLGA следует отнести также и то, что он обладает низкой токсичностью, а при попадании в организм полностью биодеградирует [23]. В Пятигорском медико-фармацевтическом институте проводятся исследования по созданию инновационной пролонгированной лекарственной формы пентоксифиллина на основе РLGA. Целью исследования явилось изучение влияния перорального введения микрочастиц пентоксифиллина на основе поли-DL-лактид-ко-гликолида на АДФ- индуцированный процесс агрегации в сравнении с пентоксифиллином. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Животные Лабораторные крысы были получены из вивария Пятигорского медико-фармацевтического института-филиала ФГБОУ ВО ВолгГМУ МЗ РФ. Содержание экспериментальных животных соответствовало действующей нормативной документацией, т. е. «Санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)». Животные содержались на стандартной диете, соответствующей действующим нормам. Кормление проводили в фиксированное время. Для питья лабораторных животных использовали поилки. Факторы внешней среды (температура, влажность, освещенность и кратность воздухообмена воздуха, состав подстилок) соответствовали требованиям по содержанию лабораторных животных Клетки, поилки для питья, подстил менялись не реже одного раза в неделю [24]. Содержание и все проводимые с животными манипуляции соответствовали требованиям Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей (Страсбург, 1986 г.). Дизайн исследования В качестве препарата сравнения использовалась субстанция пентоксифиллина (100 мг/кг, «TCI», USA, Lot. BRDTB-FM, P 2050), в роли исследуемого объекта - микрочастицы пентоксифиллина на основе PLGA (100 мг/кг) со средним динамическим радиусом 175,4 нм, полученные на базе Пятигорского медико-фармацевтического института. Разработана оптимальная технология получения пролонгированной лекарственной формы пентоксифиллина на основе PLGA, а именно соотношение пентоксифиллина и поли-DL-лактид-ко-гликолида (50:50), mol. wt 40.000-75.000 (Sigma) - 1:3. Точные навески полимера и субстанции пентоксифиллина подвергают растворению в 2 мл растворителя (хлороформ), далее капельно вводят готовый состав к водному раствору поливинилового спирта в концентрации 0,3%, процесс проходит при непрерывной работе гомогенизатора со скоростью 20000 об/мин на протяжении 15 минут. Готовый раствор подвергают центрифугированию со скоростью 6000 об/мин в течение 40 мин, далее надосадочную жидкость декантируют и отдают на последующий анализ. Извлеченный осадок микрочастиц промывается водой очищенной, после чего вновь центрифугируется (4 раза). Готовые микрочастицы переносятся в колбу объемом на 25 мл, и доводят до метки водой очищенной. Данная лекарственная форма была использована для проведения фармакологических исследований [22, 23]. В ходе эксперимента использовали здоровых половозрелых животных, крыс - самцов линии Wistar (m = 300-330 г), одинаковой возрастной группы (9 месяцев), прошедших карантин 14 дней. С помощью метода случайной выборки создали три группы по 6 животных: - 1 группа - это животные, получавшие per os 0,9% раствор натрия хлорида в эквиобъемном количестве (контрольная группа); - 2 группа - животные, которым однократно per os вводили пентоксифиллин в дозе 100 мг/кг (опытная группа); - 3 группа - животные, которым однократно per os вводили пролонгированную форму пентоксифиллин в дозе 100 мг/кг (опытная группа). Объекты исследования вводили в фиксированное время суток (8-00 - 8-30). Учитывая, тот факт, что пентоксифиллин широко используется в клинической практике перорально [25], то данный путь введения препарата был использован в дальнейшем исследовании. Для этого готовили суспензию на 0,9 % растворе натрия хлорида, которую затем и вводили животным с помощью специального зонда в объеме 10 мл/кг. Влияние объектов исследования на агрегацию тромбоцитов изучали в дозе 100 мг/кг (в пересчете на пентоксифиллин). Исходя из научных данных об эффективных терапевтических дозах пентоксифиллина, а также с учетом коэффициента пересчета дозы с человека на крысу, путем расчета была определена данная доза препарата [26, 27]. Забор крови у животных проводили утром натощак. Для предотвращения процесса свертывания крови использовали 3,8% раствора натрия цитрата, добавляемого в соотношении 1:9. Использовалась силиконовая посуда, исключающая контактную активность тромбоцитов. Индуцированную агрегацию тромбоцитов исследовали сразу после взятия крови на анализ. Получали богатую тромбоцитами плазму (БТП) и вели подсчет числа тромбоцитов с помощью стандартного метода [28, 26]. При помощи метода центрифугирования (в эксперименте использовали центрифугу РС-6) при 400 g и 1800 g соответственно из проб крови взятых для анализа, была получена БТП. В камере Горяева с использованием микроскопического метода при фазовом контрасте проводили подсчет числа тромбоцитов в БТП. В норме в крови у крысы меняется количество тромбоцитов в широких пределах - от 430000 до 1 млн в 1 мм3 - после проведенного анализа числа тромбоцитов в БТП. Для анализа числа тромбоцитов БТП была проведена стандартизация количества тромбоцитов, для чего БПТ развели необходимым количеством БТП до 400±30 тыс . тромбоцитов в 1 мм3 в пробе. Определяемые показатели Антиагрегантную активность пролонгированной формы пентоксифиллина оценивали по степени агрегации тромбоцитов. Регистрацию показателей осуществляли через 1, 3, 5, 8 и 24 часа после однократного введения микрочастиц пентоксифиллина на основе поли-DL-лактид-ко-гликолида. В роле индуктора агрегации выступил АДФ АДФ (НПО «РЕНАМ», Россия) с итоговой концентрацией 5 мкМ [26]. Регистрация процесса агрегации кровяных пластинок происходила при помощи системы двухканального лазерного анализатора агрегации тромбоцитов «АЛАТ-2» (источником света служит полупроводниковый лазер, длина волны 0.785 мкм, НПФ «БИОЛА», Россия), методом определения среднего относительного размера агрегатов. Методом лазерной агрегометрии провели обнаружение тромбоцитарных агрегатов и определение их размеров, которые сформированы на оценке степени рассеивания светового пучка и на анализе с флуктуаций оптической плотности, проводимой по кривой светопропускания и размера агрегатов. Данный метод позволяет исследовать процесс агрегации тромбоцитов, размеры и форму агрегантов. При добавлении индуктора степень агрегации имеет максимальное значение среднего размера агрегатов [29, 30]. По полученным агрегатограммам определяли степень агрегации тромбоцитов. Условия при исследовании тромбоцитов на агрегометре были приближенны к физиологическим, а именно: поддерживалась постоянная скорость перемешивания, моделирующая кровообращение, эксперимент проводился при температуре + 37°С. Статистическая обработка результатов Полученные данные обрабатывали пакетом прикладных программ STATISTICA 6.0 (StatSoft, Inc., США, для операционной системы Windows) и Microsoft Excel 2010. Определяли среднее значение и его стандартную ошибку (M±m). Нормальность распределения оценивали критерием Шапиро-Уилка. При нормальном распределении данных для сравнения средних использовали t-критерий Стьюдента для множественных сравнений. Различия считали значимыми при р<0,05.Параметрический t-критерий Стьюдента использовался при нормальном распределении данных [28]. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Данные амплитуды АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов в стандартизованной плазме у контрольной группы животных через 1 ч составили 41,8±4,8 усл. ед. (табл. 1). После однократного внутрижелудочного введения пентоксифиллина (в дозировке 100 мг/кг), степень АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов в стандартизованной плазме через 1 ч введения составила 23,9±1,9 усл. ед., (табл. 1) , т.е. на 42,8% ниже показателя у крыс контрольной группы. Аналогичное влияние на агрегационную активность тромбоцитов через 1 ч после введения наблюдения констатировали и при введении микрочастиц пентоксифиллина на основе РLGA: исследуемый показатель составил 24,2±4,8 усл. ед., (табл. 1) т.е. на 42,1% ниже, чем в опытной группе. Высокая эффективность пентоксифиллина, а также микрочастиц пентоксифиллина на основе РLGA как антиагрегантного средства при АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов была также зафиксирована и через 3 ч после введения (табл. 1). Следует отметить, что антиагрегантное действие в обеих опытных группах в рассматриваемом временном интервале было сопоставимо. Так, в группе с пентоксифиллином исследуемый показатель составил 23,8±1,9 усл. ед. (табл. 1), а в группе микрочастиц пентоксифиллина на основе РLGA 27,0±2,2 усл. ед., в то время как в контроле - 47,0±5,1 усл. ед. (табл. 1). Таким образом, снижение агрегации тромбоцитов составило 49,4% для «стандартного» пентоксифиллина и 42,6% для микрочастиц пентоксифиллина на основе РLGA. При исследовании в другие временные отрезки (5 ч., 8 ч. и 24 ч.) процесса агрегации тромбоцитов установлены существенные отличая влияния на исследуемого объекта от препарата сравнения. Так, в группе животных, которые получали перорально пентоксифиллин в дозе 100 мг/кг, статистически значимых отличий от животных контрольной группы не выявлено (табл. 1). В тоже время у животных, которые получали перорально микрочастицы пентоксифиллина на основе РLGA в аналогичной дозе, существенные отличия зафиксированы на протяжении анализируемого периода наблюдения. Так, спустя 5ч степень агрегации тромбоцитов составила 27,9±2,3 усл. ед., через 8 ч. - 27,2±3,2 усл. ед, и через 24 ч. - 27,2±1,7 усл. ед. (табл. 1). В контроле исследуемый показатель соответственно составил 39,4±2,9 усл. ед., 37,8±2,9 усл. ед. и 42,7±4,8 усл. ед. (табл. 1). Таким образом, пролонгированная форма пентоксифиллина на основе РLGA в дозе 100 мг/кг внутрижелудочно однократно, в отличие от стандартного пентоксифиллина в аналогичной дозе, обладает выраженной антиагрегантной активностью не только на 1 ч. и 3 ч. эксперимента, но на 5 ч., 8 ч. и 24 ч. наблюдения, соответственно ингибируя процесс агрегации тромбоцитов на 29,2%, 28,04% и 36,3%. Анализируя влияние объектов исследования на скорость агрегации тромбоцитов установлено, что микрочастицы пентоксифиллина на основе PLGA, в отличие от пентоксифиллина, значимо ингибируют данный процесс в течение всего периода наблюдения. Так экспериментально показано, что в 1-й и 3-й часы наблюдения изучаемый показатель в обеих опытных группах статистически значимо был ниже, чем у животных без фармакологической коррекции (рис. 1). В контроле скорость агрегации тромбоцитов через 1ч и 3 ч составила соответственно 52,71±2,12 усл. ед. и 57,48±1,44 усл. ед., в группе животных, которые получали микрочастицы пентоксифиллина на основе PLGA 30,90 ±1,37 усл. ед. (через 1 ч) и 29,02±1,63 усл. ед. (через 3 ч.), а в группе животных, получавших «стандартный» препарат анализируемый показатель составил 32,20±0,82 усл. ед. и 33,62±1,36 усл. ед. соответственно через 1 ч. и 3 ч. наблюдения. Дальнейшее изучение скорости агрегации тромбоцитов свидетельствует о существенном различии в действия микрочастиц пентоксифиллина на основе PLGA и препарата сравнения на динамику рассматриваемого процесса. В группе животных, которым был введен «стандартный» пентоксифиллин статистически значимых отличий от контрольных животных по воздействию на скорость агрегации тромбоцитов на 5, 8 и 24 ч. эксперимента не выявлено, т.е действие препарата заканчивается (рис. 1). В тоже время использование инновационной формы пентоксифиллина существенным образом ограничивает процесс агрегации тромбоцитов в течение всего периода наблюдения (рис. 1). Кроме того, следует особо отметить, что выраженность данного процесса в данной группе животных в течение всего эксперимента сопоставима. Генерация ТХА2 тромбоцитами и уменьшение уровня цАМФ связано с тем, что АДФ является слабым агонистом. Зафиксированное влияние микрочастиц пентоксифиллина на основе РLGA на агрегируемость клеток необходимо связывать с изменениями свойств мембраны тромбоцитов. На мембране тромбоцитов АДФ связывается с 3 пуринорецепторами (P2Y12, Р2Х1 и P2Y1). Ионотропный рецептор - Р2Х1 отвечает за вход в клетку экзогенного Са2 + и Na+, остальные два Р2Y-рецептора связаны с G-протеинами, несущими внутрь клетки сигнал стимуляции. Для того, чтобы развилась полная агрегация при воздействии на тромбоциты АДФ, требуется соединение данного агониста с обоими Р2Y-рецепторам [1]. Тот факт, что под влиянием АДФ происходит явная агрегация тромбоцитов, а также в связи с воздействием пентоксифиллина происходит существенное ее подавление, еще раз доказывает весомую роль пуринерегических рецепторов в реализации фармакологического ответа на данное лекарственное средство. Сопоставимость антитромбоцитарного действия «стандартного» пентоксифиллина и его инновационной формы на основе РLGA, которое мы выявили на 1 и 3 ч. после перорального введения объектов исследования, свидетельствуют о сохранении биофазы при реализации антитромбоцитарного действия микрочастиц пентоксифиллина (рис. 2). В тоже время длительность фармакологического ответа (24 ч.), которое мы наблюдали при исследовании микрочастиц пентоксифиллина на основе РLGA и в условиях АДФ-индукции агрегации тромбоцитов, позволяет предположить, что фармакодинамические изменения обусловлены особенностями фармакокинетики объекта исследования. Результаты проведенного исследования свидетельствуют, что микрочастицы пентоксифиллина на основе РLGA эффективно снижают (более, чем на 40%) агрегационную способность тромбоцитов в первые 3 ч. эксперимента, при этом по эффективности фармакологического действия при АДФ индуцированной агрегации тромбоцитов сопоставимы со «стандартным» пентоксифиллином (рис. 2). Согласно полученным данным в ходе эксперимента микрочастицы пентоксифиллина на основе РLGA (в отличие от пентоксифиллина) значимо ингибируют АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов и в течение 24 ч. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Использование микрочастиц пентоксифиллина на основе РLGA существенным образом способствует пролонгации действия пентоксифиллина как антиагрегационного средства на 24 ч. Результаты проведенных экспериментов показали, что микрочастицы пентоксифиллина на основе РLGA более эффективно уменьшают способность тромбоцитов к агрегации в первые 3 ч. исследования (больше, чем на 40%). Следует отметить, что по эффективности фармакологического действия во время АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов микрочастицы соизмеримы со стандартным образцом. Согласно полученным данным в ходе эксперимента микрочастицы пентоксифиллина на основе поли-DL-лактид-ко-гликолида (в отличие от пентоксифиллина) значимо ингибируют АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов и в течение 24 ч.

About the authors

T. V. Timchenko

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of Volgograd State Medical University

Email: akmivan@mail.ru

V. E. Pogorelyi

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of Volgograd State Medical University

A. V. Voronkov

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of Volgograd State Medical University

L. M. Makarova

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of Volgograd State Medical University

L. I. Scherbakova

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of Volgograd State Medical University

V. A. Kompantsev

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of Volgograd State Medical University

A. I. Medvetskyi

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of Volgograd State Medical University

A. Y. Platonova

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute - branch of Volgograd State Medical University

References

Supplementary files