АКТИВНОСТЬ ГЕНОВ NOTCH-СИГНАЛЬНОГО ПУТИ И NOTCH-ЗАВИСИМЫХ ГЕНОВ В ПЕЧЕНИ КРЫС ПОСЛЕ СУБТОТАЛЬНОЙ РЕЗЕКЦИИ

Полный текст

Введение NOTCH-клеточный сигнальный путь представляет собой одну из регуляторных систем, которые управляют жизненным циклом, дифференцировкой, пролиферацией клеток у большинства многоклеточных организмов. NOTCH-система состоит из 4-х видов трансмембранных NOTCH-рецепторов (NOTCH-1, -2, -3, -4), 2-х лигандов SERRATE/JAGGED (Jag-1, -2) и 3-х лигандов DELTA-LIKE (Dll-1, -3, -4), а также ряда внутриклеточных белков [1]. Гены 4-х NOTCH-рецепторов экспрессируются в печени взрослых млекопитающих, при этом гены notch1 и notch2 преимущественно экспрессируются в гепатоцитах и холангиоцитах, тогда как экспрессия генов notch3 и notch4 обнаружена в клетках стромы [2]. В научной литературе имеется множество сообщений о роли NOTCH-сигналинга в развитии печени. Показано, что активация данного сигнального пути посредством NOTCH1 и NOTCH2 рецепторов в гепа-тобластах приводит к их дифференцировке в направлении холангиоцитов [3]. Подавление экспрессии e-mail: fatkhudinov@gmail.com NOTCH2 рецептора вызывает гипоплазию внутрипеченочных желчных протоков [4]. Данные о роли NOTCH-сигналинга при регенерации печени в основном касаются регуляции репрограммирования гепатоцитов в направлении холан-гиоцитов и активации резидентных прогениторных клеток печени. Обнаружено, что при токсическом повреждении печени в гепатоцитах активируется NOTCH-сигнальный путь и начинается экспрессия маркеров холангиоцитов. Подобное явление наблюдается также при искусственной активации экспрессии генов NOTCH-сигнального пути в гепатоцитах [3, 5]. Сходная картина выявлена при активации в гепатоцитах Hippo/Yap-сигнального пути, при этом показано, что ключевой ген этого молекулярного каскада yap также является NOTCH-зависимым геном [6]. Сообщения о роли NOTCH-системы в регенерации печени после резекции немногочислены и противоречивы. В одной из немногих работ указывается, что в течение 4 сут. после резекции 70% массы печени крыс в гепатоцитах и холангиоцитах повышается синтез белков NOTCH1 и JAGGED1. Подавление экспрессии соответствующих генов с помощью РНК-интерференции вызывает снижение пролиферации гепатоцитов после резекции печени [7]. Однако в другой работе показано, что при инактивации гена notch1 у мышей в неоперированной печени наблюдается спонтанная активация пролиферации гепатоцитов и узловая гиперплазия без разрастания соединительной ткани. У животных той же линии, но после резекции печени скорость регенерации и уровень пролиферации гепатоцитов были ниже, чем у животных с нормальной экспрессией notch1 [8]. Возможно, это связано с тем, что к моменту операции у животных с подавленной экспрессией notch1 масса печени уже была увеличена. Резекция печени привела к меньшей редукции массы органа относительно массы всего животного [8]. Таким образом, NOTCH-сигналинг имеет ключевое значение в регуляции пролиферации гепатоцитов при регенерации печени после удаления части органа. Данные об экспрессии гена notch2 и его роли в регенерации печени млекопитающих после резекции отсутствуют. С точки зрения расширения знаний о фундаментальных механизмах регенерации печени актуальным является изучение особенностей восстановительного процесса в печени после резекции разного объема. Как известно, субтотальная резекция (удаление 80% массы печени) приводит к обратимому блоку митотического цикла гепатоцитов [9]. Поэтому интересным представляется изучение особенностей реализации NOTCH-сигнального пути в данных условиях репаративного процесса. Эта проблема имеет и прикладное значение, поскольку субтотальная резекция является моделью синдрома «малого остатка органа», который особенно актуален в онкологии и трансплантологии [10]. Пересаживаемая часть донорской печени оказывается слишком малой для поддержания гомеостаза в организме реципиента, что ведет к развитию острой печеночной недостаточности. Подобное состояние развивается и у пациентов, которым произведена достаточно обширная резекция печени в связи с опухолевым процессом [10, 11]. При этом молекулярные механизмы повреждения и недостаточной регенерации печени в условиях синдрома малого остатка органа остаются мало изученными. Цель работы - изучение экспрессии ряда генов NOTCH-сигнального пути (notchl, notch2), а также NOTCH-зависимых генов (sox9, hes1, yap) на модели регенерации печени крыс после субтотальной резекции. материал и методы Экспериментальная модель Исследование проводили на крысах Вистар (n = 93) массой тела 300-400 г, полученных из питомника Филиала ИБХ РАН (г. Пущино). Содержание и использование животных осуществляли в соответствии с Приказом министерства здравоохранения СССР № 755 от 12 августа 1977 г. «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных». Животным экспериментальной группы (n = 83) под наркозом диэтиловым эфиром (МедХимПром, Россия) была проведена субтотальная резекция печени. После вскрытия брюшной полости удаляли срединную, левую боковую и правую верхнюю доли печени (всего 80% общей массы печени), время операции с 9.00 до 11.00. Животных выводили из эксперимента передозировкой диэтилового эфира через 3, 6, 12, 24, 30, 48, 72 ч., а также через 7 и 10 сут. после резекции печени, по 5-6 животных на каждый срок. Показателем полноты регенерации печени служило восстановление массы печени, которую оценивали с помощью взвешивания целого органа. Контролем служили интактные крысы, одновозрастные с оперированными животными (n = 10). Оценка функции печени Для оценки восстановления функций печени в сыворотке крови крыс измеряли концентрацию альбумина и активность аланинаминотрансферазы (АЛТ). Концентрацию альбумина (г/дл) определяли с помощью фотометрического теста с бромкрезоловым зеленым (Albumin DiaS, Диакон-ДС, Россия), активность АЛТ (Е/л) - фотометрическим тестом (ALAT(GPT Dias), Диакон-ДС, Россия). Гистологическое исследование Для гистологического исследования печень фиксировали в 10% забуференном растворе формалина, после стандартной проводки заливали в парафин, далее готовили срезы толщиной 5-7 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином. Для исследования пролиферации гепатоцитов определяли их митотический индекс, выраженный в промилле С%о). Митозы подсчитывали на гистологических срезах печени, окрашенных гематоксилином и эозином на 6000 клеток для каждого животного. Иммуногистохимическое исследование На гистологических срезах выявляли экспрессию фактора транскрипции SOX9 (1:100, Abcam, Великобритания), а также цитокератина-19 (CK19, 1:100, Abcam, Великобритания). Иммуногистохимическая реакция была поставлена на парафиновых срезах с использованием иммунопероксидазного метода. Демаскировку антигена проводили путем кипячения срезов в цитратном буфере (pH 6,0). Применяли соответствующие вторые антитела и систему визуализации (Abcam, Великобритания). Срезы докрашивали гематоксилином. На препаратах подсчитывали SOX9+ и CK19+-клетки и вычисляли индекс SOX9+-клеток и индекс СК19+-клеток как соотношение маркер-позитивных клеток к общему количеству гепатоцитов на поле зрения в процентах (%). Вестерн-блот анализ Результаты иммуногистохимического исследования экспрессии SOX9 и CK19 подтверждали методом вестерн-блот гибридизации. Выделение общего белка из образцов печени крыс проводили с помощью набора MicroRotoforCellLysiskit (BioRad Laboratories Inc., США). Концентрацию общего белка измеряли по методу Брэдфорда, используя набор QuickStartBovine y-GlobulinStandardSet (BioRad Laboratories Inc., США). Перенос белков из геля на PVDF мембрану осуществляли полусухим способом при помощи набора Trans-Blot® Turbo™ RTA Mini LF PVDF TransferKit (Bio-Rad Laboratories Inc., США), окрашивали первыми антителами к SOX9, CK19 (1:100, Abcam, Великобритания) или р-тубулину (1:100, Abcam, Великобритания), затем вторыми антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (Immun-StarGoatAnti-Rabbit (GAR)-HRP Conjugate, Bio-Rad Laboratories Inc., США). Проявление блота проводили с помощью набора Clarity™ Western ECL (Bio-Rad Laboratories Inc., США) и системы визуализации ChemiDoc™(Bio-Rad Laboratories Inc., США). Полученные результаты анализировали в программе ImageLab (Bio-Rad Laboratories Inc., США). В качестве референсного белка использовали тубулин. Полимеразная цепная реакция в реальном времени Для оценки активности всего NOTCH-сигнального пути обычно изучают экспрессию как генов самого сигнального каскада, так и некоторых NOTCH-зависимых генов, чаще всего hes1 и sox9 [5]. С помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) изучали экспрессию генов notch1, notch2, hes1, yap и sox9. При выведении животных из эксперимента фрагменты печени массой 30 мг помещали в раствор RNA-later (QIAGEN, Нидерланды), инкубировали в течение суток при +4°С, хранили при -80°С. В качестве индивидуального контроля использовали ткань удаленных долей печени. Из образцов выделяли тотальную РНК с помощью набора RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN, Нидерланды). Синтез кДНК с матрицы полученной тотальной РНК осуществляли с применением готового набора реактивов MMLV RT kit (Евроген, Россия). Далее с кДНК ставили ПЦР, используя готовые наборы реактивов qPCRmix-HS SYBR, содержащие флуоресцентный интеркалирующий краситель Sybr Green I (Евроген, Россия). Праймеры для ПЦР подбирали с помощью онлайн-приложения Primer-BLAST в соответствии с общепринятыми требованиями. Выбранные праймеры (табл. 1) были синтезированы фирмой Евроген (Россия). Для анализа экспрессии генов применяли метод определения порогового цикла (Ct) и вычисляли относительную экспрессию гена по методу Pfaffl [12] с учетом рекомендаций Vandesompele [13]. В качестве эндогенного контроля использовали гены actin-в, b2m, gapdh. Статистический анализ Полученные данные анализировали с применением программы SigmaStat 3.5 (SystatSoftwareInc, США). Сравнение двух выборочных долей проводили с помощью z-критерия. Полученные относительные экспрессии сравнивали с помощью U-критерия Манна - Уитни. При сравнении более двух групп использовали ANOVA on Ranks. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05. результаты Восстановление массы и функции печени После выполнения субтотальной резекции печени масса органа у выживших животных (табл. 2) постепенно нарастала и через 10 сут. после операции масса печени у животных экспериментальной группы не отличалась от массы печени интактных крыс (p>0,05, рис. 1А). Кроме того, к этому же сроку концентрация альбумина и активность АЛТ в сыворотке крови оперированных крыс не отличалась от показателей животных контрольной группы (p>0,05, рис. 1Б, В). Таким образом, регенерация печени крыс после субтотальной резекции происходит за 10 сут., что согласуется с данными других исследователей [9, 11]. таблица 1. Использованные праймеры Ген 5'-праймер 3'-праймер Notch1 AGTGGCCAACGGCACTGAA CATTGGCCAGAGGTGTCAG Notch2 CAACGGCACAGGCTACTGC GAGGTCGAGTATTGGCAGTC Hes1 CTCTGAGCACAGAAAGTCATC TTCATGCACTCGCTGAAGCC Yap CTTCGCAAGCTGCCCGACT GGGATCTCAAAGGAAGAC TG Sox9 AGAGGCCACCGAACAGACT TGCTCAGCTCACCGATGT C actp GAGATTACTGCCCTGGCTCC GCTCAGTAACAGTCCGCCTA b2m CTCGCTCGGTGACCGTGAT GGACAGATCTGACATCTCGA gapdh GCGAGATCCCGCTAACATCA CCCTTC CACGATGCCAAAGT таблица 2. Смертность животных после субтотальной резекции печени Время после операции Кол-во погибших животных Кол-во выживших животных Кол-во прооперированных животных 3 ч. 0 5 5 6 ч. 0 6 6 12 ч. 0 5 5 24 ч. 1 5 6 30 ч. 2 6 8 48 ч. 5 6 11 72 ч. 5 5 10 5 сут. 4 6 10 7 сут. 5 6 11 10 сут. 5 6 11 Общее количество 27 56 83 животных 12 МИ,%0 10 Рис. 1. Показатели регенерации и функционального состояния печени крыс после субтотальной резекции: А - масса печени крыс после субтотальной гепатэктомии (к - масса печени животных контрольной группы); Б - активность АЛТ в сыворотке крови крыс; В - концентрация альбумина в сыворотке крови крыс; Г - митотический индекс гепатоцитов; * - различия при сравнении с контролем статистически значимы, p<0,05 1 сут 2сут Зсут 5сут 7 сут 10сут Митотическая активность гепатоцитов В первые сут. после резекции наблюдалось полное отсутствие делящихся гепатоцитов в оперированной печени (рис. 1Г). Наибольших значений митотический индекс гепатоцитов достигал через 48-72 ч. и через 7 сут. после субтотальной резекции (рис. 1Г). Экспрессия генов NOTCH-сигнального пути и NOTCH-зависимых генов При изучении активности генов NOTCH-сигнального пути было обнаружено, что гены notch1 и notch2 в печени экспериментальных животных экспрессировались на более низком уровне, чем в контроле (рис. 2А, Б). Активность notch1 у животных экспериментальной группы была ниже по сравнению с контролем через 12, 48ч., а также в период 3- 10 сут. после операции (рис. 2А), активность notch2 была снижена в период 0,5-12 ч. после резекции печени (рис. 2Б). Для оценки активности NOTCH-сигнального пути была изучена экспрессия NOTCH-зависимых генов: hes1, sox9 и yap. С помощью ПЦР-РВ было выявлено, что активность гена sox9 повышалась через 24 ч. после субтотальной резекции печени (рис. 2В). Помимо повышенной экспрессии гена sox9, с помощью ПЦР-РВ была обнаружена повышенная экспрессия другого NOTCH-зависимого гена hes1, активность которого была выше, чем у животных контрольной группы через 3 и 6 ч. после субтотальной резекции (рис. 2Г). Кроме классических NOTCH-зависимых генов была изучена экспрессия гена yap, который является не только NOTCH-зависимым геном, но и входит в Hippo-сигналинг, регулирующий дифференцировку гепатоцитов и холангиоцитов [6]. Через 30 мин., 7 и 10 сут. после субтотальной резекции было обнаружено статистически значимое снижение активности yap (p<0,05). Повышение экспрессии гена yap ни на одном сроке выявлено не было (рис. 2Д). Иммуногистохимический анализ показал увеличение количества клеток, экспрессирующих SOX9 в печени после субтотальной резекции через 2 и 7 сут. после операции. На этих сроках в печени появлялось большое количество SOX9+ гепатоцитов, при этом у животных контрольной группы белок SOX9 в печени определялся исключительно в ядрах холангиоцитов (рис. 3А, Б). При определении содержания SOX9 в регенерирующей печени методом вестерн-блота была обнаружена сходная динамика. Наибольшее количество белка SOX9 в печени было выявлено через 2 и 7 сут. после операции (рис. 3В). NOTCH-сигнальный путь предположительно регулирует трансдифференцировку гепатоцитов в холангиоциты [3, 5]. Исходя из этого, мы изучили экспрессию белка цитокератина 19 - маркера холан-гиоцитов. CK19 экспрессировался исключительно в клетках в составе эпителия желчных протоков (рис. 3Г). Доля CK19+ клеток в печени оперированных животных увеличивалась по сравнению с контролем на 2-3 сут. после операции, однако эти колебания были минимальны (рис. 3Д). При изучении экспрессии CK19+ в регенерирующей печени методом ве-стерн-блота достоверных различий между группами выявлено не было (рис. 3Е). Таким образом, мы обнаружили, что на разных сроках после субтотальной резекции в печени крыс происходит подавление экспрессии генов notch1, notch2, yap и активация таких NOTCH-зависимых генов как sox9 и hes1. обсуждение Изучению роли NOTCH-сигнального пути при развитии печени млекопитающих посвящено множество работ, в которых показана ключевая роль данного молекулярного каскада в дифференцировке холангиоцитов [3, 5]. Участию NOTCH-сигнального пути в репарации печени посвящено значительно меньше работ, которые, прежде всего, касаются восстановительных процессов при токсическом повреждении печени [5]. В этих исследованиях получены доказательства возможности трансдифференцировки гепатоцитов в направлении холангиоцитов и ключевой роли активации NOTCH-сигнального пути и связанных с ним генов в данном процессе. Нами получены данные, свидетельствующие о подавлении активности генов notch1 и notch2 NOTCH-сигналинга при регенерации печени крыс после субтотальной резекции (удаление 80% тканей печени). При этом сниженная экспрессия notch1 предшествовала активной пролиферации гепатоцитов, а подавление notch2 совпадало по времени с периодом наибольшей митотической активности гепатоцитов (рис. 1, 2). АБ 0,5ч Зч 6ч 12ч 24ч 30ч 48ч Зсут 5сут 7сут 10сут Рис. 3. Экспрессия SOX9 и цитокератина 19 в печени крыс после субтотальной резекции печени: А - клетки печени, продуцирующие белок SOX9; Б - количество клеток печени (%), экспрессирующих SOX9; В - содержание белка SOX9 в печени оперированных крыс по данным вестерн-блота и денситометрического анализа вестерн-блота; Г - клетки печени, экспрессирующие белок цитокератин 19; Д - количество клеток печени (%), экспрессирующих цитокератин 19; Е - содержание белка цитокератина 19 в печени оперированных крыс по данным вестерн-блота и денситометрического анализа вестерн-блота. А, Г - иммуногистохимическое исследование, докраска гематоксилином. Ув.: А, Г х400; * - различия при сравнении с контролем статистически значимы, p<0,05 Таким образом, полученные нами данные согласуются с работами, в которых показано, что активация пролиферации гепатоцитов возможна только в условиях подавленной активности NOTCH-сигналинга [7, 8]. Несмотря на подавление генов notch1 и notch2 в печени после субтотальной резекции, мы обнаружили повышение экспрессии NOTCH-зависимых генов hes1 и sox9. Возможно, это связано с тем, что ген sox9 является не только NOTCH-зависимым, но также WNT-зависимым, и, кроме того, его экспрессия повышается под влиянием TGFb, FGF10 [3, 14]. В свою очередь, показано, что активация гена sox9 вызывает увеличение экспрессии hes1 [14] SOX9 - транскрипционный фактор, который играет важную роль в гистогенезе ряда тканей млекопитающих [15]. В постнатальном периоде онтогенеза SOX9 экспрессируется многими малодифференцированными клетками, например сперматогониями, эпителиоцитами дна кишечных крипт и др., поэтому SOX9 рассматривают как маркер прогениторных клеток [16]. При этом считают, что SOX9 участвует в поддержании клетки в малодифференцированном состоянии [15]. Хорошо известно, что гепатоциты перед вступлением в митотический цикл претерпевают некоторую дедифференцировку и начинают экспрессировать ряд маркеров гепатобластов, например а-фетопротеин [17]. Возможно, экспрессия SOX9 в гепатоцитах отражает более глубокую дедифференцировку после субтотальной резекции по сравнению с той, которая происходит при резекции печени меньшего объема. На связь экспрессии SOX9 в гепатоцитах и пролиферации указывает совпадение или предшествование периодов увеличенной экспрессии SOX9 и пиков митотического индекса гепатоцитов. Кроме того, роль SOX9 в пролиферации показана на линии клеток легочной аденокарциномы A549. Обнаружено, что при трансфекции геном sox9 у клеток данной линии in vitro повышается пролиферативная активность, способность к миграции и инвазии [18]. Вероятно, дедифференцировкой гепатоцитов перед вступлением в митотический цикл объясняется и увеличение экспрессии гена hes1, который также участвует в поддержании недифференцированного состояния клеткой [19, 20]. Однако, несмотря на обнаружение экспрессии маркеров незрелых клеток в печени после субтотальной резекции, нам не удалось обнаружить активации альтернативных путей регенерации печени (активации прогениторных клеток, трансдифференцировки гепатоцитов в холангиоциты). Об том свидетельствует распределение CK19+, которые располагались исключительно в составе желчных протоков, как и у животных контрольной группы, а также отсутствие в тканях печени оперированных животных клеток с промежуточным между гепатоцитом и холангиоци-том фенотипом. На отсутствие трансдифференцировки гепатоцитов в холангиоциты также указывает сниженная экспрессия генов notch1, notch2 и yap1, которые обычно активизированы при данном процессе [5, 6]. Таким образом, после субтотальной резекции происходило подавление активности экспрессии генов notchl и notch2 NOTCH-сигнального пути, что, видимо, является необходимым условием активации пролиферации гепатоцитов. Экспрессия таких NOTCH-зависимых генов как sox9 и hes1 после субтотальной резекции в печени, повышалась, возможно, под влиянием других регуляторных каскадов и скорее свидетельствует о более глубокой дедифференцировке гепатоцитов по сравнению с той, которая наблюдается при резекции печени меньшего объема, чем об их трансдифференцировке в холангиоциты. благодарности Данная работа была выполнена при финансовой поддержке РФФИ (Соглашение 14-04-01224 от 26 декабря 2013 г.) и гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых (№ 14.120.14.6239 от 3 февраля 2014 г.).

Об авторах

А. В Ельчанинов

Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова; Научно-исследовательский институт морфологии человека

Москва, Россия

Т. Х Фатхудинов

Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова; Научно-исследовательский институт морфологии человека

Москва, Россия

Е. Ю Кананыхина

Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова; Научно-исследовательский институт морфологии человека

Москва, Россия

И. В Арутюнян

Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова; Научно-исследовательский институт морфологии человека

Москва, Россия

А. В Макаров

Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова; Научно-исследовательский институт морфологии человека; Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова

Москва, Россия

Л. А Князева

Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова

Москва, Россия

Г. Б Большакова

Научно-исследовательский институт морфологии человека

Москва, Россия

Г. Т Сухих

Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова

Москва, Россия

Список литературы

Дополнительные файлы