Mutation lanscape of acute myeloid leukemia in elderly patients

Full Text

Введение Острые миелоидные лейкозы (ОМЛ) - это злокачественные новообразования крови, заболеваемость которыми увеличивается с возрастом, достигая максимума в группах больных пожилого и старческого возраста. Они развиваются вследствие соматических мутаций в ключевых прото- и антионкогенах кроветворных клеток-предшественниц, характеризуются сложной клональной архитектурой и динамическими изменениями молекулярно-генетического профиля в процессе онкогенеза [1]. Так, мутации генов NPM1, FLT3, NRAS возникают на поздних стадиях онкогенеза и связаны с клинической манифестацией лейкоза. Напротив, мутации в генах DNMT3A, ASXL1, TET2 появляются, как правило, на ранних стадиях злокачественной трансформации и могут длительно персистировать в фазе ремиссии, обусловливая риск развития рецидивов. При этом некоторые мутации могут определяться в лейкоцитах периферической крови здоровых доноров задолго до манифестации заболевания, и их частота также коррелирует с возрастом. Указанный феномен характеризуется как «клональный гемопоэз с неопределенным потенциалом» и ассоциирован с повышенным риском развития лейкозов с частотой 0,5-1,0% в год [1-3]. Цель исследования - определить частоту мутаций генов DNMT3A, FLT3, KIT, NPM1, NRAS, TP53 и WT1 у больных ОМЛ в возрастной группе 60 лет и старше. Материал и методы Исследовали пробы костного мозга и периферической крови 54 больных ОМЛ в возрасте 60 лет и старше после получения информированного согласия, проходивших лечение в Свердловском областном онкогематологическом центре в период 2009-2018 гг. Среди пациентов было 26 мужчин (48,1%) и 28 женщин (51,9%). Средний возраст больных составлял 67,7±1,8 лет. Диагностику ОМЛ проводили в соответствии с рекомендациями вОз [4, 5]на основании клинической картины, цитологического анализа крови и костного мозга, цитохимического и иммунофенотипического исследований. По показаниям выполняли трепанобиопсию подвздошной кости с последующим гистологическим и иммуногистохимическим анализом [6]. Морфологический вариант ОМЛ определяли согласно франко-американо-британской (FAB) классификации [7], в соответствии с которой пациенты были распределены по подгруппам: М0 - 2 пациента, М1 - 6, М2 - 27, М3 - 2, М4 - 11, М5 - 1, М6 - 3, острый миелофиброз - 1, бластная плазмацитоидная дендритоклеточная опухоль - 1. Всем пациентам было выполнено цитогенетическое и(или) молекулярно-генетическое исследование аспирата костного мозга: полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени на транслокации t(8;21)(q22;q22), t(15;17)(q22;q11 ), t(9;22)(q34;q11 ), инверсию inv(16)(p13;q22), аномалии сегмента 11q23. В 23 пробах костного мозга пациентов с ОМЛ уточнить вариант генетической поломки с применением цитогенетического и ПЦР-методов не удалось. Они, соответственно, были классифицированы как ОМЛ с неуточненным кариотипом [8]. Детекцию криптических генных мутаций осуществляли с помощью технологии прямого автоматического секвенирования. Всего на наличие мутаций в кодирующих последовательностях экзонов 12-15 и 19-21 гена FLT3 в изучаемой выборке были протестированы 49 проб периферической крови и костного мозга, экзонов 4-11 гена ТР53 - 45, экзонов 9-12 гена NPM1 - 37, экзонов 7-12 и 16-19 гена KIT - 34, экзонов 1-4 гена NRAS - 26, экзонов 6-9 гена WT1 - 26, экзонов 18-26 гена DNMT3A - 11. Праймеры, использованные для детекции мутаций в указанных генах, а также лабораторные протоколы исследований, описаны нами ранее [9, 10]. Проверку статистических гипотез проводили с применением точного критерия Фишера (F). Доверительные интервалы (ДИ) для средних частот мутаций генов определяли на основе биномиального распределения. Результаты Наиболее частым типом хромосомных аберраций в обследованной группе больных являлись комплексные хромосомные аберрации (22,2%, n=12, при 95% ДИ от 13,2 до 34,9%). В 20,4% случаев (n=11, при 95% ДИ от 11,8 до 32,9%) определялся нормальный кариотип лейкемических бластов. Специфические структурные аберрации хромосом, ассоциированные с благоприятным прогнозом, были выявлены в 2 пробах (3,7%, при 95% ДИ от 1,0 до 12,5%), в том числе транслокация t(8;21 )(q22;q22) и транслокация t(15;17)(q22;q11) - по одному случаю (1,9%, при 95% ДИ от 0,3 до 9,9%). Изолированные специфические хромосомные аберрации, ассоциированные с неблагоприятным прогнозом, в исследуемой выборке не определялись. Неслучайная хромосомная аномалия трисомия хромосомы 8 была обнаружена в 4 образцах (7,4%, при 95% ДИ от 2,9 до 17,5%) при ОМЛ М2, М4 и бластной плазмацитоидной дендритоклеточной опухоли, случайные изохромосомы i(7) и i(7)(p1 0) - по одному случаю (1,9%, при 95% ДИ от 0,3 до 9,9%) при ОМЛ м2. Патогенетически значимые для ОМЛ мутации в экзонах 4-11 гена TP53 являлись наиболее частыми клинически значимыми криптическими генными мутациями, выявленными в исследуемой группе больных ОМЛ, они определялись в 9 биообразцах (20,0%, при 95% ДИ от 10,9 до 33,8%) при оМл М2, М4, М6. В 7 биообразцах указанные аномалии были ассоциированы с комплексными хромосомными аберрациями (при ОМЛ М2, М4, М6), по одному случаю (при ОМЛ М2) - с нормальным и неуточненным кариотипом лейкемических клеток. В 7 пробах (15,6%, при 95% ДИ от 7,8 до 28,8%) были выявлены нуклеотидные замены (при ОМЛ М2, М4, М6), по одному случаю (2,2%, при 95% ДИ от 0,4 до 11,5%) - делеция и тандемная дупликация гена ТР53 (при ОМЛ М2). У одного пациента при ОМЛ М2 с кариотипом 45, XY, del(2)(q), iso(9)(q), r(12), del(17) (q), add(19)(p), -15 одновременно были обнаружены две транзиции в кодирующей последовательности гена ТР53 - c.292C>T и c.817C>T. Первая из них обусловливала замену p.98P>S в пролиновом домене белка р53, вторая - p.273R>C в ДНК-связывающем домене. Во всех остальных случаях определялись изолированные мутации, обусловливавшие инактивацию белка р53. Они были представлены тремя транзициями (c. 377A>G, c. 659A>G, c. 817C>T), тремя трансверсиями (c. 395А>С, c. 733G>T, c. 841G>T), фреймшифт-мутацией (c. 645delG) и тандемной дупликацией 1 9 нуклеотидов, начиная с позиции 960 от начала кодирующей последовательности гена ТР53. Подробная характеристика мутаций в гене ТР53 у больных ОМЛ представлена в табл. 1. Генетические изменения в экзонах 12-15 и 19-21 гена FLT3, значимые для онкогенеза ОМЛ, были выявлены в 9 пробах (18,4%, при 95% ДИ от 1 0,0 до 31 ,4%) при морфологических вариантах М1, М2, М4 и М5. Среди них в 1 образце была обнаружена трансверсия с. 2479 A>T (2,0%, Гены & Клетки, том XIV, № 4, 2019 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 21 Таблица 1. Характеристика патогенетически значимых мутаций в гене TP53, выявленных у больных ОМЛ пожилого и старческого возраста Вариант по FAB Кариотип Мутация Локализация мутации в гене Локализация и тип мутации в белке М2 46, ХХ c. 377 A>G Экзон 5 ДНК-связывающий домен, p.126 Y>C М2 >50, XXX (околотриплоидия) c. 395A>C Экзон 5 ДНК-связывающий домен, p.132 K>T М2 47, XY, del(3)(p12), del(5)(q31), add(17)(p13), -7, +21, +mar c. 645delG Экзон 6 ДНК-связывающий домен, фреймшифт М2 42, X, add(1)(q31), add(12)(q24), del(15)(p12), add(16)(p13), del(18)(?12), -3, -9, -13, -X c. 841 G>T Экзон 8 ДНК-связывающий домен, p.281 D>Y М2 Неуточненный (низкая митотическая активность) TD Экзон 9 С-концевой/NLS (сигнал ядерной локализации), фреймшифт М2 45, XY, del(2)(q), iso(9)(q), r(12), del(17)(q), add(19)(p), -15 c. 292 C>T, c. 817 C>T Экзоны 4 и 8 Пролиновый домен, р. 98 P>S, ДНК-связывающий домен, p. 273 R>C М4 52, XYY, inv(3)(p12;q24), +1, +9, +11, +13, +19, +Y, +mar c. 733 G>T Экзон 7 ДНК-связывающий домен, p.245 G>C М6 46, XX, del(5q)(3.2), add(18p)(1.1.3) or t(5;18) (q2.3;p1.1)/46, XX, del(17p)(1.2), add(18p) (1.1.3) or t(17;18)(p1.2;p1.1)/47, XX, del(5q) (3.2), add(18p)(1.1.3) or t(5;18)(q2.3;p1.1), +mar/46, XX c. 659A>G Экзон 6 ДНК-связывающий домен, p.220 Y>C М6* 40-45, XY, del(4)(p14), -5, dup(7)(q11;q22), del(11)(q21), del(17)(p12),-19, +Ph, +mar1-4 [7]/ 41-45, XY, del(4)(p14), -5, del(6) (q23), dup(7)(q11;q22), del(11)(q21), +Ph, +mar1-3 [6]/ 40-45, XY, del(4)(p14),-5, dup(7) (q11;q22), del(11)(q21), inv(17)(q21;q25), -19, +Ph, +mar1-4 [5]/ 44, XY, del(4)(p14), -5, dup(7)(q11;q21), -19, +Ph [2] c. 817 C>T Экзон 8 ДНК-связывающий домен, p. 273 R>C Примечание: *при ПЦр-исследовании транскрипт химерного BCR-ABL в пробе не выявлен Таблица 2. результаты исследования проб больных ОМЛ пожилого и старческого возраста с несколькими мутациями Подтип Характеристика выявленных мутаций в генах по FAB DNMT3A FLT3 KIT NPM1 TP53 Кариотип М1 WT ITD с. 1621А>С, с. 2586G>C Инсерция типа А WT Неуточненный М4 с. 2645 G>A ITD WT WT WT Неуточненный М5 WT ITD n. Del 1529-1774 WT WT Неуточненный М2 NA ITD WT Инсерция типа Ural-2 WT Нормальный М2 WT с. 1683 A>G с. 1621А>С, с. 2586G>C WT TD Неуточненный М2 WT WT WT NA с. 292 С>т, с. 817 С>Т 45, XY, del(2) (q), iso(9)(q), r(12), del(17)(q), add(19)(p),-15 Примечание: функционально значимые мутации (в т. ч. гена KIT с. 1621А>С) выделены полужирным шрифтом, случаи выявления полиморфного аллеля гена ТР53 c. 215 C>G в таблицу не включены; WT - дикий тип (изменений кодирующей последовательности в сравнении с референсной не обнаружено), ITD - внутренняя тандемная дупликация, TD - тандемная дупликация, NA - исследование не проводилось Гены & Клетки, том XIV, № 4, 2019 22 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Таблица 3. Частота выявления патогенетически значимых генных мутаций при ОМЛ Исследуемая группа Частота мутаций в исследованных генах, % DNMT3A FLT3 KIT NPM1 NRAS TP53 WT1 ОМЛ, возраст 15-45 лет [16] 7,1 21,9 10,0 10,7 13,0 0,0 11,1 ОМЛ, возраст 60 лет и старше 9,1 18,4 5,9 5,4 7,7 20,0 0,0 ОМЛ, возраст 65 лет и старше [17] 27,0 12,0 - 16,0 12,0 21,0 - Примечание: «-» - исследование не проводилось при 95% ДИ от 0,4 до 10,6%), в 8 (16,3% при 95% ДИ от 8,5 до 29,0%) - внутренние тандемные дупли-кациии (ITD) и инсерции, различающиеся по длине и локализации в кодирующих последовательностях юкстамембранного и киназного доменов. Во всех случаях выявленные ITD обусловливали чувствительность опухолевых клеток к ингибиторам тирозинкиназ I типа [11-13]. Кооперация FLT3 ITD с мутациями в других исследованных генах зафиксирована у 4 пациентов (44,4%, при 95% ДИ от 18,9 до 73,3%, табл. 2). Частота детекции точечных мутаций в кодирующей последовательности экзонов 18-26 гена DNMT3A в исследуемой выборке составила 9,1 % (при 95% ДИ от 1,6 до 37,8%). Выявленная мутация была представлена транзицией с. 2645 G>A, обусловливавшей замену остатка аргинина на гистидин в позиции 882 кодируемого белка, и определялась при ОМЛ М4 с неуточненным кариотипом и FLT3 ITD (табл. 2). Мутации в гене NRAS были найдены у 2 пациентов (7,7%, при 95% ДИ от 2,1 до 24,2%) при оМл М2 и представлены, соответственно, функционально значимыми заменами с. 35 G>A и с. 181 С>А. Случаев их кооперации с другими молекулярными повреждениями зафиксировано не было. Инсерции в экзоне 12 гена NPM1 были обнаружены у 2 пациентов при ОМЛ М1 и М2 (5,4%, при 95% ДИ от 1 ,5 до 1 7,7%) и соответственно, представлены мутациями типа А и Ural-2 [6]. Наряду с ними в пробах выявлялись дополнительные мутации-FLT3 ITD и трансверсия с. 1621 А>С в гене KIT (табл. 2). Проведенные статистические расчеты показали, что мутации генов NPM1 и FLT3 являлись неслучайными генетическими событиями, кооперация которых в онкогенезе ОМЛ обусловливала ухудшение прогноза общей выживаемости NPM1 -позитивных пациентов [6]. Структурные изменения в кодирующей последовательности гена KIT определялись в 12 пробах (35,2%, при 95% ДИ от 20,0 до 52,7%). Среди них в 8 случаях выявлялись изолированные синонимичные замены (23,5%, при 95% ДИ от 21,5 до 52,1%, с. 2586 G>C, с. 1638 A>G, с. 2394 С>Т), в 2 случаях (5,9%, при 95% ДИ от 1,6 до 19,1%) - несинонимичная замена с. 1621 А>С в сочетании с трансверсией с. 2586 G>C, по 1 случаю (2,9%, при 95% ДИ от 0,5 до 14,9%) - делеция (n. Del 1529-1774) в сочетании с трансверсией с. 2586 G>C и замена с. 1621 А>С в сочетании с транзициями с. 1636 A>G и с. 1821 Т>С. При ОМЛ М5, наряду с мутациями в гене KIT, определялась также мутация fLt3 iTd (табл. 2). В 2 образцах с трансверсиями с. 1621 A^ и с. 2586 G>C были обнаружены также клинически значимые изменения других прото- и антионкогенов: при ОМЛ М1, - инсерция типа А в гене NPM1 и мутация FLT3 ITD, а при ОМЛ М2 - тандемная дупликация в гене TP53 (табл. 2). По литературным данным трансверсия с. 1621 A^ является полиморфным аллельным вариантом гена KIT, не имеющим самостоятельного прогностического значения при ОМЛ [14, 15], что подтверждается полученными нами результатами о случайном характере ее сочетания с другими функционально значимыми генетическими аномалиями при ОМЛ [16]. Делеция n. Del 1529-1774 в кодирующей последовательности экзонов 1 0 и 1 1 гена KIT, приводящая к утрате 82 остатков аминокислот в белке Kit, была описана нами ранее при ОМЛ М2 с транслокацией t(8;21)(q22;q22) и ОМЛ М4 с инсерцией типа А в экзоне 12 гена nPm1 [16]. По данным, опубликованным в работе [15], мутации в экзоне 1 1 гена KIT являются патогенетически значимыми, т. к. затрагивают участок рецептора, обеспечивающий ингибирование его аутофосфорилирования. Следовательно, в подобных случаях должен прорабатываться вопрос о назначении таргетного лечения ингибиторами тирозинкиназ I типа в рамках клинических исследований. Структурные изменения в кодирующей последовательности гена WT1 в исследованных пробах (n=26) не определялись, однако в 3 образцах (11,5%, при 95% ДИ от 4,0 до 28,9%) при ОМЛ М2, м3 и М5 было найдено преобладание экспрессии транскрипционного варианта типа D, тогда как в остальных случаях транскрипты типа A и D выявлялись в эквивалентном количестве. Обсуждение Функционально значимые мутации в кодирующих последовательностях экзонов 18-26 гена DNMT3A, 12-15 и 19-21 гена FLT3, 7-12 и 16-19 гена KIT, 1-4 гена NRAS, 9-12 гена NPM1 и 4-11 гена ТР53 были обнаружены с использованием технологии прямого автоматического секвенирования в 21 исследованной пробе от больных ОМЛ в возрасте 60 лет и старше (38,9%, при 95% ДИ от 27,0 до 52,2%), что коррелировало с ранее полученными результатами (табл. 3). В целом оказалось, что с максимальной частотой при ОМЛ в возрастной группе пациентов 60 лет и старше определялись функционально значимые мутации в гене ТР53 (20,0%), что было существенно выше, чем у больных ОМЛ в возрасте 15-45 лет (табл. 3) и сопоставимо с результатами исследования H. Dohner с соавт. (2018) [17]. Частота генетических изменений в гене FLT3 была сопоставима с таковой в ранее обследованной группе больных ОМЛ в возрасте 15-45 лет [16], однако не превышала 20,0%. Имевшие патогенетическое значение при ОМЛ мутации в гене KIT выявлялись в группе больных ОМЛ старше 60 лет с частотой 5,9% (n=2, при 95% ДИ от 1,6 до 19,1%). Мутации в генах DNMT3A, NRAS и NPM1 обнаруживались с более низкой частотой (9,1 %, 7,7% и 5,4%, соответственно) по сравнению с результатами работы H. Dohner с соавт. (2018) [17]. Для мутаций гена DNMT3A и инсерций экзона 12 гена NPM1 это частично можно объяснить цитогенетическим профилем выборки (диплоидия определялась лишь в 20,4% наблюдений). Гены & Клетки, том XIV, № 4, 2019 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 23 По две и более функционально значимые мутации в исследованных генах были обнаружены у 6 больных ОМЛ в возрасте 60 лет и старше (11,1% при 95% ДИ от 5,2 до 22,2%, табл. 2). У 3 больных при ОМЛ М1, М2, М4 и М5 была выявлена кооперация мутации FLT3 ITD с мутациями в генах KIT и NPM1 (по 2 случая), а также DNMT3A (1 случай, табл. 2). У одного больного при ОМЛ М2 с мутацией TD в гене TP53 ко-мутацией являлась трансверсия c. 1621А>С в гене KIT. У другого пациента при ОМЛ М2, были обнаружены одновременно две мутации в гене ТР53. Таким образом, только в пяти пробах (9,3%, при 95% ДИ от 4,1 до 20,0%) определялось по два патогенетически значимых при ОМЛ молекулярных события. Определенный интерес в исследованной выборке вызывают результаты детекции генетических аномалий в пробах от пациентов с редкими гематологическими заболеваниями, относящимися к ОМЛ - острым миелофиброзом, острым промиелоцитарным лейкозом (ОПЛ) и бластной плазмоцитоидной дендритоклеточной опухолью, т. к. сведения об их молекулярно-генетических особенностях у лиц пожилого и старческого возраста ограничены [1, 5, 17]. Так, в двух пробах от пациентов с ОПЛ (мужчины, возраст 60 и 62 года) мутаций в исследованных прото- и антионкогенах выявлено не было: у одного пациента цитогенетически определялась транслокация t(15;17)(q22;q21), а у другого - методами цитогенетики и ПЦр хромосомные поломки не обнаружились. Оба случая характеризовались ранней летальностью на фоне проведения индукционной полихимиотерапии, включающей полностью транс-ретиноевую кислоту. При остром миелофиброзе (женщина, 67 лет) также не удалось выявить значимых мутаций в генах FLT3, NPM1, KIT, TP53 и хромосомных аберраций цитогенетическим и ПЦр-методами. Также не были обнаружены значимые изменения в исследованных генах у больного бластной плазмоцитоидной дендритоклеточной опухолью (мужчина, 61 год), хотя в данном случае был определен аберрантный кариотип лейкозных бластов (трисомия хромосомы 8). Для последних двух пациентов была характерна первичная резистентность опухолей к проводимому химиотерапевтическому лечению. Это свидетельствует о возможном участии в онкогенезе указанных разновидностей миелоидных лейкозов иных молекулярных событий, для детекции которых необходимо использовать технологии массового параллельного секвенирования. В целом, в обследованной группе преобладали пациенты с неблагоприятным и неуточненным цитогенетическим прогнозом. Однако дополнительный анализ биоматериала пациентов с применением технологии прямого автоматического секвенирования позволил в 38,9% случаев выявить скрытые патогенетически значимые мутации исследованных генов, в т. ч. в 3 случаях (27,3%) - в подгруппе промежуточного, в 7 (30,4%) - неуточненного и в 11 (61,1%) - неблагоприятного прогнозов. При этом прогностическая стратификация ОМЛ ухудшалась у 9 пациентов (26,5%, при 95% ДИ от 14,6 до 43,2%) в группах промежуточного и неуточненного цитогенетического прогнозов. У остальных пациентов она не менялась, т. к. выявленные хромосомные аберрации были ассоциированы с неблагоприятным прогнозом. Таким образом, по результатам цитогенетического и дополнительного молекулярно-генетического исследований благоприятный прогноз общей вероятностной выживаемости был установлен у 2 пациентов (3,7%, при 95% ДИ от 1,0 до 12,5%), промежуточный - у 9 (16,7%, при 95% ДИ от 9,1 до 28,8%), неблагоприятный - у 27 (50,0%, при 95% ДИ от 37,1 до 62,9%), неуточненный - у 16 (29,6%, при 95% ДИ от 16,5 до 50,0%). Полученные данные необходимо учитывать для планирования и разработки персонализированных программ лечения больных ОМЛ пожилого и старческого возраста и включить технологии секвенирования в алгоритмы диагностики ОМЛ, предусмотренные национальными клиническими рекомендациями. Выводы 1. Кумулятивная частота детекции патогенетически значимых мутаций в генах DNMT3A, FLT3, KIT, NPM1, NRAS и ТР53 у больных ОМЛ пожилого и старческого возраста составляла 38,9%. 2. С максимальной частотой у больных ОМЛ в возрасте 60 лет и старше определялись мутации в генах ТР53 (20,0%) и FlT3 (18,4%), частота клинически значимых мутаций остальных исследованных генов варьировала в диапазоне 5,4-9,1%, а мутации в гене WT1 не определялись. 3. Частота обнаружения множественных генных мутаций у больных ОМЛ в возрасте 60 лет и старше составляла 11,1%, наиболее часто в кооперации участвовали мутации гена FLT3. 4. Применение метода прямого секвенирования позволило уточнить прогноз у 26,5% больных ОМЛ из групп промежуточного и неуточненного цитогенетического прогнозов за счет выявления криптических мутаций в генах TP53, FLT3, KIT, NRAS, NPM1 и DNMT3A. Однако прогноз стандартного химиотерапевтического лечения ОМЛ во всех случаях ухудшался.

About the authors

A. V Vinogradov

Ural State Medical University; Sverdlovsk Regional Clinical Hospital N 1

Email: a.vinogradov@egov66.ru
Ekaterinburg, Russia

A. V Rezaykin

Ural State Medical University

Email: a.vinogradov@egov66.ru
Ekaterinburg, Russia

S. V Sazonov

Ural State Medical University; Institute of Medical Cell Technologies

Email: a.vinogradov@egov66.ru
Ekaterinburg, Russia

A. G Sergeev

Ural State Medical University

Email: a.vinogradov@egov66.ru
Ekaterinburg, Russia

M. Y Kapitonova

University Malaysia Sarawak (UNIMAS)

Email: a.vinogradov@egov66.ru
Malaysia

References

Supplementary files