Экстраокулярные мышцы mdх-мышей как мишень для клеточной терапии: гистологическая характеристика с использованием компьютерного морфометрического анализа

Полный текст

Введение

Миодегенеративные процессы в экстраокулярных мышцах (ЭОМ) довольно часто развиваются как неблагоприятный исход у лиц, перенесших офтальмогерпес, а также после токсических поражений и травм [1]. У пациентов с такой патологией наблюдаются различные виды косоглазия, трудно поддающиеся лечению. Возможно, что в этих случаях может оказаться эффективной терапия «клеточными препаратами» [2-4].

На данный момент разработка методов клеточной терапии патологии ЭОМ осложняется отсутствием адекватной экспериментальной модели, которую можно было бы использовать для доклинических исследований и оценки терапевтического эффекта. Нами выполнена попытка оценить возможность использования mdх-мышей в качестве экспериментальной модели для разработки подходов клеточной терапии миодегенеративных процессов глазодвигательного аппарата [5].

Мышечная дистрофия у mdх-мышей обусловлена точечной мутацией в 23-м экзоне гена дистрофина, расположенного в Х-хромосоме [6]. Миодистрофию у этих мышей следует расценивать как процесс, гомологичный прогрессирующей мышечной дистрофии у людей.

Существует ряд исследований, касающихся вовлечения экстраокулярных мышц mdх-мышей в миодегенеративный процесс. В одних довольно однозначно говорится о том, что ЭОМ несмотря на отсутствие в их структуре дистрофина, особым образом компенсируют этот дефект и остаются полностью морфологически и функционально сохранными [7]. Механизм такой компенсации, однако, остается дискуссионным [8, 9]. В других исследованиях было показано, что добавочные ЭОМ и глобулярные слои всех ЭОМ mdх-мышей всё-таки вовлекаются в патологический процесс, хотя и в меньшей степени чем, например, m. quadriceps femoris тех же животных [8, 10]. Степень повреждения мышц оценивается в этих исследованиях по экспрессии маркерных белков (дистрофин, утрофин, дистрогликаны, ламинины) методами RT-PCR, иммуногистохимии. Существует и морфологическая характеристика сравниваемых групп мышц. Однако, ресурс, который имеет «классический» гистологический анализ для оценки степени повреждения мышечной ткани, остается использованным не оптимально. Это происходит, в частности, из-за незначительной разницы в оцениваемых количественных показателях, таких, как ядерно-цитоплазматическое соотношение, площадь мышечных волокон и т. д., различия между которыми тяжело учесть без применения адекватного статистического анализа [8, 9]. Численные параметры используются, но, в большинстве случаев, только для описания отдельных тканей, а не для сравнения их друг с другом [7, 9].

Нашей целью было охарактеризовать гистологические особенности экстраокулярных мышц mdх-мышей и мышей линии С57Вl в сравнении с m. quadriceps femoris тех же животных методами компьютерной морфометрии и статистического анализа, для:

• выявления и оценки степени поражения этой группы мышц;
• выявления информативных показателей, характеризующих глубину и тяжесть развития дегенеративных процессов;
• оценки возможности использования ЭОМ mdх-мышей в качестве модели при разработке клеточных технологий для лечения дегенеративных процессов ЭОМ.

Нами были отобраны морфометрические критерии для оценки процессов дегенерации и регенерации в ЭОМ. Это - число ядер в мышце, число мышечных волокон в мышце, CNI - центральный ядерный индекс и CVА - гетерогенность площади поперечного сечения мышечных волокон в мышце.

Материал и методы

Исследование проведено на самцах mdх-мышей и мышах линии С57Вl в возрасте 10-12 мес. Мышей содержали в стандартных условиях, в соответствии с этическими нормами и правилами обращения с лабораторными животными. После декапитации животного глазные яблоки с ЭОМ отделяли от стенок орбиты и век и фиксировали в 10% растворе нейтрального (pН = 7,3) формалина, аналогично обрабатывали m. quadriceps femoris. Весь материал подвергали стандартной гистологической обработке и изготавливали срезы толщиной 4 мкм. Окраску проводили гематоксилином и эозином.

Морфометрические показатели оценивали методами полуавтоматического морфометрического анализа с использованием программы «Флюороденситоморфометрия» (ЗАО «МеКоC»). Выявляли:

• площадь мышцы на поперечном срезе (соединительная ткань, мышечные волокна);
• площадь соединительной ткани на поперечном срезе мышцы;
• площадь мышечных волокон на поперечном срезе мышцы;
• доля соединительной ткани в мышце (отношение площади соединительной ткани ко всей площади мышцы на поперечном срезе);
• площадь мышечного волокна на поперечном срезе мышцы;
• число мышечных волокон в мышце на поперечном срезе;
• число ядер в на поперечном срезе мышечного волокна;
• число ядер на исследуемом поперечном срезе мышцы;
• плотность ядер в мышце (количество ядер на единицу площади мышцы);
• плотность ядер в мышечных волокнах (количество ядер на единицу площади мышечных волокон в мышце);
• центральный ядерный индекс (CNI) (рассчитывается как отношение числа мышечных волокон с одним и более ядром в центре к общему числу мышечных волокон, исключая мышечные волокна без ядер в поперечном сечении), характеризующий долю регенерировавших волокон;
• гетерогенность площади поперечного сечения мышечных волокон в мышце (CVА); рассчитывается как коэффициент вариации площади поперечного сечения мышечных волокон. Этот признак используется для оценки интенсивности процессов регенерации скелетных мышц: чем больше отличаются отдельные мышечные волокна по своим размерам, тем сильнее выражены процессы восстановления [11].

Для оценки значимости различий средних значений использовали t-критерий Стьюдента (и его модификации) при уровне значимости Р = 0,01.

Результаты и обсуждение

Гистологические данные о строении изученных мышц страдают известной скупостью и не дают существенной информации для сравнительного анализа (рис. 1). Без дополнительных исследований по гистологическим препаратам нельзя судить о наличии достоверных различий между исследуемыми группами. Однако при морфометрическом и последующем статистическом анализе выявлено, что для ЭОМ, также как и для m.quadriceps femoris mdх-мышей характерно статистически значимое изменение некоторых морфометрических признаков относительно контрольной группы мышей линии С57Вl, (табл.). Так в мышцах mdх- мышей, снижаются значения таких абсолютных признаков, как:

• площадь мышцы на поперечном срезе - в 3 раза для ЭОМ и в 6 раз для m. quadriceps femoris;
• площадь соединительной ткани на поперечном срезе мышцы - в 3 раза для ЭОМ и в 8 раз для m. quadriceps femoris;
• площадь мышечных волокон на поперечном срезе мышцы - в 2 раза для ЭОМ и в 5 раз для m. quadriceps femoris;
• число ядер на исследуемом поперечном срезе мышцы
• в 2 раза для ЭОМ и в 2 раза для m. quadriceps femoris;
• число мышечных волокон в мышце - в 3 раза для ЭОМ и в 6 раз для m. quadriceps femoris.

 

Рис. 1. Попереные срезы исследованных мышц: А - экстаокулярная мышца мыши линии С57Bl; Б - экстраокулярная мышца mdx-мыши; В - m. quadriceps femoris мыши линии С57Bl; Г - m. quadriceps femoris mdx-мыши. Окраска: гематоксилин и эозин. А, Б - ×250; В, Г - ×250

 

Гистоморфометрическая характеристика экстраокулярных мышц и m. quadriceps femoris mdx-мышей

Параметр, размерность	Экстраокулярные мышцы		т. quadriceps feтoris
	С57Вl	mdx	С57Вl	mdx
Площадь мышцы (на поперечном срезе)	39311±25998	14138±4666*	299631±63524	53561±40453*
Площадь соед. ткани	17269±12853	5597±2500*	117135±21908	13894±13115*
Площадь мыш. волокон в мышце (на поперечном срезе)	22042 ± 14307	8542±2511*	182496±21908	39667±28699*
Число ядер в мышце	81±42	36±13*	146±35	90±62*
Число мыш. волокон в мышце	69±44	21±8*	90±20	16±13*
Площадь мыш. волокна (на поперечном срезе)	293 ± 133	450±188	1574±652	2200±1119
Ср. кол-во ядер на мыш. волокно	1,3±0,3	1,7±0,6	2±0,5	5,5±1,4
Доля соединительной ткани в мышце, %	42,8±9,1	38,6±7,2	39,1±7,3	23,1±9,7
Плотность ядер в мышце	2316±715	2570±373	489±115	1866±767
Плотность ядер в мыш. волокнах	4143±1465	4276±976	798±131	2374±693
CNI, %	1,45	4,51*	5,33	87,75*
CVA	0,52	0,58*	0,44	0,64*

Примечание: * - различия статистически значимы.

 

Как было показано в исследовании, посвященном изучению процессов дегенерации и регенерации поперечно- полосатой мускулатуры, такое уменьшение площади мышцы, площади отдельных волокон и др. свидетельствуют о дегенеративных процессах в ткани [11]. Таким образом, нами показано наличие процессов дегенерации в ЭОМ, также как и в m. quadriceps femoris mdх-мышей.

В ЭОМ mdх-мышей увеличиваются такие относительные признаки как:

• центральный ядерный индекс (CNI);
• коэффициент вариации площади поперечного сечения мышечных волокон (CVА).

Такие изменения по данным тех же авторов [11] говорят о наличии процессов регенерации. Поскольку в исследованных ЭОМ mdх-мышей эти изменения присутствуют, следует констатировать протекание в них и процессов регенерации.

Для m. quadriceps femoris mdх-мышей также статистически значимо увеличивается среднее количество ядер в мышечном волокне, плотность ядер в мышце и мышечных волокнах и значимо уменьшается доля соединительной ткани в мышцах относительно контрольной группы мышей линии C57Вl, что позволяет определить дегенеративные и регенераторные процессы в мышечной ткани m. quadriceps femoris mdх-мышей. Для ЭОМ достоверных изменений этих признаков не выявлено.

При анализе распределения величин поперечного сечения мышечных волокон выявлено увеличение доли волокон с большой площадью в мышцах (m. quadriceps femoris и экстаокулярных мышц) у mdх-мышей по сравнению с линией С57Вl (рис. 2, 3).

 

Рис. 2. Гистограмма площади поперечного сечения мышечных волокон в экстраокулярных мышцах мышей линии С57Bl и mdx-мышей

 

Рис. 3. Гистограмма площади поперечного сечения мышечных волокон в m. quadriceps femoris мышей линии С57Bl и mdx-мышей

 

Представляется целесообразным предположить, что увеличение количества мышечных волокон с большой площадью является одним из компенсаторных механизмов.

Мы считаем, что абсолютные признаки, такие, как площадь мышцы, площадь соединительной ткани в мышце, площадь мышечных волокон в мышце, напрямую зависят от факторов, которые трудно учесть (уровень и направление среза, расположение мышцы), а потому все эти признаки следует исключить из критериев для оценки степени дистрофии.

Таким образом, на основании статистически подтвержденных различий между показателями, измеренными у контрольных С57Вl и mdх-мышей, для оценки миодистрофии из всех предложенных показателей можно выбрать следующие:

• число ядер на исследуемом поперечном срезе мышцы;
• число мышечных волокон на поперечном срезе мышцы;
• CNI - центральный ядерный индекс;
• CVА - коэффициент вариации площади поперечного сечения мышечных волокон.

По этим признакам обнаружены значимые различия между группой mdх-мышей и мышей С57Вl как в экстраокулярных мышцах, так и в m. quadriceps femoris.

Анализ гистологических препаратов, проведенный с использованием методов объективной морфометрии и статистики, свидетельствует о том, что в экстраокулярных мышцах mdх-мышей имеют место процессы дегенерации и регенерации меньшей степени выраженности, чем в m. quadriceps femoris, что, в целом, согласуется с существующими литературными данными о том, что ткани ЭОМ являются структурно дефектными, но имеют механизмы компенсации [7, 8, 10].

Таким образом, нами установлено, что экстраокулярные мышцы mdх-мышей можно использовать в качестве экспериментальной модели миодистрофических процессов глазодвигательных мышц, в частности, для разработки методов клеточной и генной терапии миодистрофий в офтальмологии.

Об авторах

Сергей Эдуардович Аветисов

ГУ НИИ глазных болезней РАМН

Email: pavliukster@gmail.com
Россия, Москва

Александр Сергеевич Павлюк

ГУ НИИ глазных болезней РАМН; Российский государственный медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: pavliukster@gmail.com
Россия, Москва; Москва

Марина Александровна Стенина

Российский государственный медицинский университет

Email: pavliukster@gmail.com
Россия, Москва

Анатолий Александрович Федоров

ГУ НИИ глазных болезней РАМН

Email: pavliukster@gmail.com
Россия, Москва

Л. П. Кривов

Российский государственный медицинский университет

Email: pavliukster@gmail.com
Россия, Москва

Д. С. Николаенко

ГУ НИИ глазных болезней РАМН

Email: pavliukster@gmail.com
Россия, Москва

П. Ю. Баранов

ГУ НИИ глазных болезней РАМН

Email: pavliukster@gmail.com
Россия, Москва

Анастасия Михайловна Суббот

ГУ НИИ глазных болезней РАМН

Email: pavliukster@gmail.com
Россия, Москва

Амир Ильдарович Тухватулин

ГУ НИИ глазных болезней РАМН

Email: pavliukster@gmail.com
Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы