Создание системы для автоматического детектирования экспрессии гена Oct4 in vivo и in vitro

Аннотация

Полный текст

Продукт гена Oct4(Pou5f1) - один из наиболее изученных факторов плюрипотентности. К настоящему моменту показано, что он является необходимым как для поддержания плюрипотентного статуса клеток, так и для его индукции из клеток дифференцированных. Кроме того, было показано, что эктопическая экспрессия Oct4 позволяет фибробластам и клеткам крови трансдифференцироваться в нейрональные клетки без достижения стадии плюрипотентности. Таким образом, можно сказать, что Oct4 увеличивает «пластичность» клеток, давая им возможность принять решение о дальнейшей дифференцировке. Эта способность объясняется тем, что Oct4 является так называемым пионер-фактором, способным занимать участки закрытого хроматина, потенциируя их для дальнейшей активации другими факторами транскрипции и факторами ремоделирования хроматина. Большой интерес представляет способность Oct4 увеличивать клеточную пластичность не только на искусственных моделях, но и в реальных биологических случаях. Например, недавно было показано, что делетирование его промотера и первого экзона приводит к увеличению нестабильности бляшек на мышиной модели атеросклероза. При этом, способность гладкомышечных клеток, участвующих в формировании бляшки, мигрировать и проявлять свойства макрофагов (что является примером естественной пластичности) ингибируется. Кроме того, важным вопросом является участие Oct4 в поддержании популяции раковых стволовых клеток внутри опухолей. Для того, чтобы решить такого рода вопросы, мы создали генетическую систему, позволяющую in vivo и in vitro, в автоматическом режиме, маркировать клетки, которые когда-либо запускали экспрессию Oct4. Для этого, мы, при помощи системы CRISPR/Cas9 встроили сконструированные кассеты, содержащие сайт-специфические рекомбиназы и маркерные последовательности в два локуса эмбриональных стволовых клетки мыши - Oct4 и Rosa26. Конструкция, встроенная в локус Rosa26 служит спусковым крючком для сенсибилизации всей системы, после запуска которой, рекомбиназа, стоящая в локусе Oct4, автоматически активирует маркирование клеток, запустивших экспрессию Oct4. Сейчас мы показали работу всей системы на эмбриональных стволовых клетках мыши, получили предварительные данные о запуске экспрессии Oct4 в линии раковых клеток Neuro-2a, а также приступили к созданию линии мышей, содержащих нашу систему детекции.