Заражение сои в условиях in vivo грибами Diaporthe eres

Full Text

Diaporthe eres Nitschke – эндофит и фитопатоген из отдела Ascomycota порядка Diaporthales семейства Diaporthaceae [1, 2, 3]. Литературные данные о распространении грибов рода Diaporthe на территории России и их филогенетическая специализация на сегодняшний день неоднозначны и требуют уточнения [4].

Распространению отдельных видов грибов рода Diaporthe способствуют их стратегия выживания и наличие разнообразных адаптаций. Как эндофиты они могут сосуществовать с некоторыми видами растений, не вызывая заболеваний, но поменяв хозяина могут проявлять себя как фитопатогены. Расширение спектра питающих растений может происходить из-за аборигенных видов, что зачастую приводит к возникновению новых консортивных связей. Кроме того, известно, что на одном растении могут существовать несколько видов грибов из рода Diaporthe [4]. Уточнение трофности и филогенетической специализации грибов, выявление потенциальных резерватов инфекции и установление их патогенности в отношении растений на сегодняшний день считают актуальными задачами.

Один из наиболее распространенных на территории России видов Diaporthe helianthi Munt.-Cvetk., Mihaljč et M. Petrov – возбудитель фомопсиса подсолнечника [5]. Известно, что с подсолнечником могут быть ассоциированы еще 13 видов рода Diaporthe, в том числе D. eres и D. phaseolorum [4]. Точная видовая идентификация грибов Diaporthe возможна только с использованием методов молекулярной филогении. Благодаря молекулярным исследованиям в России выявлен Diaporthe eres на солянке [6], D. phaseolorum на томате и сое [7, 8]. В Амурской области D. helianthi ранее не отмечали, однако наличие подсолнечника в агроценозах создает потенциальный фитосанитарный риск для появления и дальнейшего распространения этого карантинного вида. При этом достоверно обнаружены такие опасные и экспортно значимые для приграничных регионов, к которым относят Амурскую область, виды, как D. eres на абрикосе [9], D. longicolla (Hobbs) J. M. Santos, Vrandečić et A.J.L. Phillips и D. phaseolorum (Cooke et Ellis) Sacc. на сое [10, 11]. Поскольку на территории Амурской области располагается до 40 % всех посевов сои страны, вопросы о распространении грибов рода Diaporthe, их филогенетической специализации и патогенности остаются открытыми. Согласно результатам последних исследований, круг возбудителей болезней сои из представителей этого комплекса достаточно широк [12, 13]. Хотя D. eres – патоген, не подтвержденный для сои, встречаются работы, в которых указано, что грибы этого вида провоцируют гниение семян культуры, а выделенные изоляты различаются по агрессивности [14, 15]. Присутствие D. eres в фитоценозах Амурской области увеличивает риски распространения фитопатогенных грибов из-за расширения круга растений-хозяев.

Цель исследования – оценка патогенности вида Diaporthe eres в отношении сои для уточнения филогенетической специализации грибов Diaporthe.

Методика. Объектами исследования были растения сои (Glycine max (L.) Merr.) высокопродуктивных сортов, возделываемых в Амурской области – скороспелого Сентябринка и среднеспелого Китросса, два штамма микроскопических грибов Diaporthe eres – D. eres MF-Pm-4a и D. eres MF-Pm-5a, которые были выделены с побегов абрикоса маньчжурского Prunus mandshurica (Maxim.) Koehne, произрастающего в искусственных насаждениях в окрестностях г. Благовещенска (Амурская обл.). Молекулярная характеристика и филогенетический анализ сходства изолятов D. eres представлены в работе [9].

Для выявления штаммовых и видовых различий между грибами сою дополнительно инокулировали неидентифицированным видом Diaporthe, который был выделен в 2021 г. на опытных полях Всероссийского научно-исследовательского института (ВНИИ) сои (Амурская обл., Тамбовский р-н., с. Садовое) с растений сорта Сентябринка – Diaporthe sp.-1.

До рода идентификацию штамма Diaporthe sp.-1 осуществляли по культурально-морфологическим признакам методом световой микроскопии с использованием микроскопов Микромед 1 (вар. 3-20) (Микромед, Россия) и AxioLab. A1 (CarlZeiss, Германия). Для этого чистую культуру выращивали на питательных средах Чапека и картофельно-декстрозном агаре (PDA) при комнатной температуре. Изолят очень скудно спорулировал. Для активации процесса спорообразования использовали УФ-лампу с длиной волны 200…280 нм, облучению подвергали 30-дневные культуры по 15 мин 4 раза, интервал между сеансами – 2 дня.

Для подтверждения патогенности Diaporthe eres в отношении сои растения для инокуляции выращивали в вегетационном домике на базе ВНИИ сои в 2022 г. Набивку сосудов осуществляли почвой с длительного стационарного опыта ВНИИ сои. В качестве инокулюма использовали агаровые блоки, высеченные из 10-суточной чистой культуры гриба, выращенной на среде Чапека, в контроле – агаровые блоки, высеченные из чистой питательной среды, без мицелия гриба. Агаровые блоки прикладывали к искусственно созданным механическим повреждениям на стеблях сои. Место поранения дезинфицировали 70 %-ным спиртом, после чего прикладывали агаровый блок площадью 1 см², фиксировали ватой, смоченной в стерильной воде, затем обертывали место повреждения пищевой пленкой. Инокуляцию здоровых растений сои проводили на стадии формирования бобов (R-3), отбор образцов осуществляли на стадии полной спелости бобов (R-8). Всего было инокулировано 35 растений сорта Сентябринка (табл. 1). Отбор образцов для реизоляции проводили на 40-е сутки после инокуляции.

 

Табл. 1. Схема опытов

Инокуляция методом агаровых блоков (фаза развития сои R-3)		Инокуляция методом агаровых блоков (фаза развития сои R-1)		Инокуляция листьев суспензией спор
сорт сои/штамм	повторность	сорт сои/штамм	повторность	сорт сои/штамм	повторность
Сентябринка/ D. eres MF-Pm-4a	10	Сентябринка/ D. eres MF-Pm-4a	10	Сентябринка/ D. eres MF-Pm-4a	12 (6+6)*
Сентябринка/ D. eres MF-Pm-5a	10	Сентябринка/ D. eres MF-Pm-5a	10	Сентябринка/ D. eres MF-Pm-5a	12 (6+6)
Сентябринка/ Diaporthe sp.-1	10	Китросса/ D. eres MF-Pm-4a	10	Китросса/ D. eres MF-Pm-4a	12 (6+6)
Контроль	5	Китросса/ D. eres MF-Pm-5a	10	Китросса/ D. eres MF-Pm-5a	12 (6+6)
		Контроль	13	Контроль	8+8
35		53		64

*абаксиальная и адаксиальная стороны листьев.

 

Для выявления восприимчивости сои к заражению в зависимости от возраста растений дополнительно инфицировали растения сортов Сентябринка и Китросса в начале цветения (R-1). Исследования проводили в вегетационном домике на территории АФ БСИ ДВО РАН (Амурская обл., Благовещенск). Сосуды набивали субстратом (смесь песка и почвы в соотношении 1:2), который предварительно протравливали препаратами Тиовит и Фуфанол нова. Поскольку эксперименты выполняли в разное время, почву использовали согласно новой локации. На рост и развитие сои это не влияло.

Заражение опытных растений сои проводили методом агаровых блоков аналогично описанному ранее. Инокулировано 53 растения сои (см. табл. 1). Сосуды с инфицированными растениями помещали в климатические камеры, поддерживающие оптимальные условия для их роста: влажность – 50 %, температура – 24 °C, фотопериод – 16 ч. Отбор образцов для реизоляции проводили на 40-е сутки после инокуляции.

Для подтверждения проникновения патогена через естественные пути листья сои инокулировали суспензией спор штаммов D. eres MF-Pm-4a и D. eres MF-Pm-5a. Растения сортов Сентябринка и Китросса выращивали в вегетационном домике АФ БСИ ДВО РАН в 2023 г. Листья для инокуляции отбирали на стадии R-1 с визуально здоровых растений, на которых не наблюдали симптомов, характерных для поражения грибами рода Diaporthe. После этого их помещали в чашки Петри на стерильную увлажненную фильтровальную бумагу. В качестве инокулюма использовали суспензию спор грибов, полученную смывом конидий с поверхности 6-недельных грибных колоний, выращенных на среде Чапека. Аликвота инокулюма составляла 50 мкл, концентрация спор ~1,7 × 10⁶ КОЕ/мл. Инокулюм наносили на абаксиальную и адаксиальную стороны листьев. Всего было заражено 64 листа сои (см. табл. 1). В контрольном варианте в качестве инокулюма использовали стерильную воду.

Перед реизоляцией патогена в чистую культуру проводили поверхностную стерилизацию фрагментов. Их промывали водопроводной водой, затем 10 минут замачивали в 3 %-ной перекиси водорода, далее в течение 5 минут (для листьев 1…2 мин) обрабатывали 70 %-ным спиртом, после чего 2…3 раза промывали стерильной водой. Стерильные фрагменты раскладывали в чашки Петри с питательной средой Чапека и культивировали при комнатной температуре. Видовую принадлежность повторно выделенных изолятов определяли по культурально-морфологическим признакам с использованием световой микроскопии. За уровень инфицированности принимали процент повторного выделения патогена из ткани вне места инокуляции, то есть учитывали патоген, развивающийся только внутри самого растения.

Статистическую обработку данных проводили в программе Microsoft Office Excel. Рассчитывали стандартное отклонение и статистическую значимость различий средних величин по t-критерию Стьюдента.

Результаты и обсуждение. Анализ фрагментов генов BT и EF1-α штаммов D. eres MF-Pm-4a и D. eres MF-Pm-5a при идентификации подтвердил их расположение в пределах видового комплекса Diaporthe eres. Штаммы D. eres MF-Pm-4a и D. eres MF-Pm-5a имеют разные нуклеотидные замены в генах, кодирующих β-тубулин и фактор элонгации трансляции 1-α, и находятся в разных кластерах в пределах вида D. eres [9]. Виды рода Diaporthe очень полиморфны, разные изоляты могут образовывать отдельные клады на филогенетических деревьях в зависимости от локуса, используемого для филогенетического анализа. Изоляты, составляющие разные клады даже в пределах вида, могут различаться по своей агрессивности в отношении растений-хозяев [16, 17]. Поэтому для выявления штаммовых различий вида в пределах комплекса мы выбрали штаммы из разных генотипических кластеров.

Штамм Diaporthe sp.-1 был изолирован с Glycine max и по морфолого-культуральным признакам идентифицирован до рода Diaporthe (рис. 1). В чистой культуре на среде Чапека Diaporthe sp.-1 образует ризоидные колонии с белым воздушным мицелием, присутствуют зоны с желто-зеленой пигментацией, с возрастом колонии темнеют. Реверс, начиная с центра, развивает темную пигментацию, которая с возрастом становится интенсивнее. На среде PDA Diaporthe sp.-1 образует быстрорастущие войлочные плотные колонии белого цвета; гриб достигает границ чашки Петри на 5-е сутки. Реверс пигментирован только в центре (рис. 1 б, в). На 50…60-е сутки культивирования образуются немногочисленные черные округлые пикниды, размер которых не превышает 150…260 мкм (рис. 1 г). После первого УФ-облучения на 33 сутки культивирования начали образовываться пикниды; после четырех сеансов единичные пикниды стали выделять желтую полупрозрачную массу, содержащую альфа-конидии, бета-конидии отсутствовали (рис. 1 г). Альфа-конидии были одноклеточными, эллипсоидными, размером в среднем 6,2 ± 0,7×2,3 ± 0,3 мкм (n = 45). Из-за отсутствия и медленного спорообразования, высокой межвидовой и внутривидовой изменчивости в пределах рода видовую идентификацию необходимо осуществлять с использованием молекулярно-генетических методов [18, 19, 20].

 

Рис. 1. Морфологические признаки Diaporthe sp.-1: а) спорулирующие пикниды на стебле сои; б) колония / реверс на среде Чапека, 21-е сутки; в) колония / реверс на среде PDA, 21-е сутки; г) колония с пикнидами на среде Чапека после УФ-облучения, 35-е сутки / α-конидии.

 

До инокулирования растения сои в период вегетации от всходов до формирования бобов были визуально здоровы; симптомов, характерных для заболеваний, вызываемых комплексом видов Diaporthe, не отмечали. При отборе образцов для реизоляции на растениях наблюдали симптомы в виде некротических пятен на стеблях в местах инокуляции, усыхание листьев и формирование пикнид на поверхности стеблей. Контрольные растения не усыхали и оставались зелеными.

После сбора растительных образцов, зараженных Diaporthe sp.-1, при визуальном осмотре наблюдали симптомы в виде обширных некротических повреждений, охватывающих большую часть стебля выше и ниже места инокуляции (рис. 2 а). Появившиеся некротические пятна распространялись практически по всему стеблю, что со временем приводило к гибели растений, при этом пикниды на поверхности были немногочисленными. Наличие обширной площади некрозов на всех экспериментальных образцах и повторное выделение Diaporthe sp.-1 из них подтверждает его патогенность по отношению к сое.

 

Рис. 2. Внешний вид стеблей сои после инокуляции на 40-е сутки: а) зараженный штаммом Diaporthe sp.-1; б) контроль; в) зараженный штаммом D. eres MF-Pm-5a; г) зараженный штаммом D. eres MF-Pm-4a.

 

При заражении сои штаммами D. eres MF-Pm-4a и D. eres MF-Pm-5a некротические поражения были менее выражены, по сравнению с повреждениями, вызываемыми Diaporthe sp.-1 (рис. 2 в, г). Относительно контроля размеры некрозов были значительно больше (табл. 2). В местах поранений и инокуляции D. eres MF-Pm-5a отмечены некрозы размерами ~1,3 см. Штамм D. eres MF-Pm-4a приводил к образованию некротических пятен, размер которых в среднем составлял ~2,3 см. Более обширные некрозы свидетельствуют о повышенной скорости распространения патогена по тканям и косвенно указывают на большую агрессивность штамма D. eres MF-Pm-4a, по сравнению с D. eres MF-Pm-5a.

 

Табл. 2. Патогенность штаммов рода Diaporthe в отношении сои

Штамм	Средняя длина некроза, см ± стандартное отклонение		Частота повторного выделения из места инокуляции, %		Частота выделения из ткани вне места инокуляции, %
	Сентяб-ринка	Китросса	Сентяб-ринка	Китросса	Сентяб-ринка	Китросса
Инокуляция методом агаровых блоков (фаза развития сои R-3)
Контроль	0,50 ± 0,05	-	0	-	0	-
D. eres MF-Pm-4a	2,30 ± 0,60*	-	60	-	100	-
D. eres MF-Pm-5a	1,30 ± 0,30	-	100	-	100	-
Diaporthe sp.-1	по всей длине стебля	-	100	-	100	-
Инокуляция методом агаровых блоков (фаза развития сои R-1)
Контроль	0,50 ± 0,05	0,50 ± 0,05	0	0	0	0
D. eres MF-Pm-4a	2,00 ± 0,50	2,10 ± 0,50	70	66	10	0
D. eres MF-Pm-5a	1,80 ± 0,50	2,10 ± 0,20	54	43	0	0
Инокуляция листьев суспензией спор
Контроль	0	0	0	0	0	0
D. eres MF-Pm-4a	0,50 ± 0,10	0,50 ± 0,10	60	40	10	0
D. eres MF-Pm-5a	0,50 ± 0,10	0,50 ± 0,10	60	35	0	0

* различия достоверны, по сравнению с контролем, на уровне значимости 0,001; - – сорт не использовали в эксперименте.

 

На поверхности живых растений сои, зараженных штаммами D. eres MF-Pm-4a и D. eres MF-Pm-5a, наблюдали пикнидиальное спороношение, характерное для грибов рода Diaporthe. Повторное изолирование D. eres из фрагментов, отобранных выше мест инокулирования, составляло 100 % из-за повсеместного присутствия пикнид. Из фрагментов контрольных растений грибы рода Diaporthe не выделены.

Патогенность штамма Diaporthe sp.-1 в отношении сои была доказана и проверена постулатами Коха, для D. eres MF-Pm-4a и D. eres MF-Pm-5a она не подтвердилась, поэтому в дальнейших исследованиях использовали только эти штаммы. Растения сои, инокулированные на стадии R-1, оставались зелеными, пикниды на их поверхности не обнаруживали, признаки усыхания листьев отсутствовали, растения продолжали развиваться и образовывать бобы. На 40-е сутки после инокуляции некротические пятна, размеры которых в среднем составляли ~2 см, наблюдали на зараженных растениях исключительно в местах поранения. Размеры некрозов были больше, чем в контроле, в 4 раза (см. табл. 2).

Заражение более молодых растений не вызвало повсеместного появления пикнид на стеблях, что дало возможность повторно выделить патоген. После реизоляции из фрагментов, взятых выше мест инокуляции, штамм D. eres MF-Pm-4a выделяли в 10 % случаев. Повторное выделение патогена только на скороспелом сорте Сентябринка свидетельствует о его меньшей устойчивости к инфицированию, по сравнению со среднеспелым сортом Китросса. Повторное выделение из ткани вне места инокуляции только штамма D. eres MF-Pm-4a, а также более высокая (на 20 %) его реизоляция из мест инокуляции, косвенно указывают на большую агрессивность, по сравнению со штаммом D. eres MF-Pm-5a, что согласуется с результатами предыдущего эксперимента. В целом незначительное (10 %) повторное выделение D. eres из междоузлий и появление локальных некрозов только в местах поранений свидетельствуют о невысокой агрессивности исследуемого вида гриба в отношении сои.

При заражении сои на стадии развития R-3 отмечали более короткий инкубационный период – появление первых симптомов в виде пикнид на стеблях наблюдали через 15 дней после инокулирования, тогда как при заражении молодых растений на стадии R-1 даже через 40 суток после инокулирования развития видимых симптомов, характерных для болезней, вызываемых комплексом видов Diaporthe, не наблюдали.

Существует немало методов искусственного заражения растений, благодаря которым становится возможным определение не только толерантности генотипов растений, но и вирулентности различных изолятов возбудителя. Особенно это актуально для уточнения филогенетической приуроченности узкоспециализированных или факультативных паразитов, а также для изучения потенциальных рисков их распространения. Один из способов распространения грибов рода Diaporthe – капельная влага. Для подтверждения возможности проникновения патогена не только через повреждения, но и через естественные пути, например, устьица, использовали метод искусственного заражения листьев сои суспензией спор без нанесения механических повреждений.

На 10-е сутки после инокуляции на листьях наблюдали некротические пятна, которые по форме и диаметру соответствовали нанесенной капле со спорами и во всех вариантах составляли 0,5 см (см. табл. 2). Сильнее выраженные некрозы отмечали на абаксиальной стороне листовой пластинки, по-видимому, наличие устьичного аппарата способствовало более быстрому и легкому проникновению патогена внутрь тканей. Листья в контроле оставались без повреждений и сохраняли свой первоначальный зеленый цвет.

При реизоляции через 7…10 суток на питательной среде из образцов некротической ткани в 35…60 % случаев выделяли грибы рода Diaporthe, что свидетельствует о явном присутствии их спор/мицелия в некротической ткани (см. табл. 2). В процессе культивирования участков листовых пластин без видимых признаков некрозов в 10 % случаев выделяли D. eres, что подтверждает потенциальную вероятность развития и распространения патогена в тканях листьев сои. Всего лишь 10 %-ное повторное выделение гриба из условно здоровых фрагментов листьев (без видимых некротических повреждений) свидетельствует о низкой агрессивности вида, что согласуется с результатами, полученными в ходе инокулирования молодых растений на стадии R-1. Все случаи повторного выделения D. eres были отмечены на листьях сои скороспелого сорта Сентябринка (см. табл. 1), что может свидетельствовать о более высокой устойчивости среднеспелого сорта Китросса.

Наличие спор/мицелия в некротической ткани свидетельствует о возможности развития паразитических взаимоотношений гриба и сои. Кроме того, существует вероятность, что D. eres способен колонизировать сою как оппортунист, который при определенных условиях (инфекция, неблагоприятные абиотические факторы) может привести к гибели растения. В последних исследованиях показано, что одно растение может быть поражено более чем одним видов Diaporthe [4, 12, 15]. Например, установлено, что D. eres входит в состав патокомплекса подсолнечника, и существуют предположения, что возбудитель фомопсиса – комплекс видов рода Diaporthe [4]. Благодаря выявленному в нашем исследовании факту, что соя способна поддерживать инокулят D. eres, вид может войти в состав патокомплекса и привести к увеличению вредоносности из-за совместного влияния, особенно на менее устойчивые сорта.

Выводы. таким образом, независимо от используемого метода искусственного заражения в условиях in vivo доказано, что Diaporthe eres проявляет патогенные свойства в отношении сои. Появление симптомов болезни в виде некрозов и пикнидообразования на живых растениях, повторное выделение изолятов из фрагментов, отобранных выше мест инокуляции, подтверждают возможность развития D. еres на сое как патогена. Однако незначительная реизоляция (10 %) из фрагментов зараженных растений свидетельствует о низкой агрессивности вида в отношении сои.

Штаммы из разных генотипических кластеров демонстрируют различную агрессивность по отношению к сое. Штамм D. eres MF-Pm-4a более агрессивен, чем D. eres MF-Pm-5a, так как частота его повторного выделения из мест инокуляции была выше на 20 %, а из мест вне инокуляции составляла 10 %.

Процесс развития болезни сои в фазе R-1 характеризуется более продолжительным инкубационным периодом, даже на 40 сутки после инокулирования видимых симптомов болезни не наблюдали. Тогда как при заражении сои в фазе развития R-3 появление первых симптомов в виде пикнид на живых стеблях сои отмечали на 15 сутки после инокулирования. При этом среднеспелый сорт сои Китросса был более устойчивым, чем скороспелый сорт Сентябринка.

Несмотря на низкий патогенный потенциал исследуемых штаммов, возможное присутствие вида D. eres в патокомплексе сои может привести к повышению его вредоносности, а соя может способствовать сохранению и дальнейшему распространению вида.

Финансирование работы.

Работа выполнена в рамках государственного задания ИГиП ДВО РАН по теме № 122041800128–5; БСИ ДВО РАН по теме № 1021060207393-6-1.6.11.

Соблюдение этических стандартов.

В работе отсутствуют исследования человека или животных.

Конфликт интересов.

Авторы работы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности.

Авторы выражают благодарность старшему научному сотруднику, к. б. н. Э. В. Некрасову (АФ БСИ ДВО РАН, г. Благовещенск) за неоценимую помощь на всех этапах исследования.

About the authors

L. P. Shumilova

Institute of Geology and Nature Management, Far Eastern branch, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: Shumilova.85@mail.ru

кандидат биологических наук

Russian Federation, 675000, Blagoveshchensk, per. Relochnyi, 1

E. E. Kabotov

Amur branch of the Botanical Garden-Institute of the Far Eastern Branch, Russian Academy of Sciences

Email: Shumilova.85@mail.ru
Russian Federation, 675000, Blagoveshchensk, Ignat’evskoe shosse, 2-i km

References

Supplementary files