Молекулярная диагностика в онкологии: новые тенденции

Полный текст

Введение

Онкология является одним из главных полигонов для испытания и внедрения методов молекулярной медицины. Существует несколько факторов, обусловливающих востребованность трансляционных исследований именно в контексте диагностики и лечения рака. Во-первых, злокачественные опухоли — одна из немногих патологий человека, которая практически всегда возникает вследствие накопления соматических мутаций. Соответственно, эти мутации служат объектом для фундаментальных исследований, а также мишенью для медицинских вмешательств. Во-вторых, сам по себе диагноз злокачественного новообразования подразумевает верификацию со стороны морфолога. Таким образом, в распоряжении специалистов имеется биологический материал опухоли, полученный от каждого онкологического пациента. Подобная доступность патологически измененных тканей является уникальной особенностью онкологии, обеспечивающей высокую информативность исследований в данной области медицины. В-третьих, если проанализировать спектр наследственных заболеваний человека, то именно семейные опухолевые синдромы занимают лидирующие позиции в этом списке. Прогресс в медицинской генетике в значительной мере определяется успехами в изучении предрасположенности к онкологическим заболеваниям. И наконец, следует признать, что само слово «рак» ассоциируется с неблагоприятным прогнозом заболевания — несомненно, даже с учетом всех этических аспектов врачебной деятельности рамки применения экспериментальных подходов в онкологии несколько шире, чем в других областях клинической медицины [1–4].

Молекулярная диагностика составляет неотъемлемый компонент обследования онкологических больных. Наиболее заметным практическим успехом в молекулярной онкологии стало формирование системы медицинских мероприятий для пациентов с наследственным раком. Гены, ответственные за основные семейные опухолевые синдромы — наследственный рак молочной железы и яичников, наследственный рак толстой кишки и эндометрия (синдром Линча), наследственный полипоз толстой кишки, синдром Ли – Фраумени и т. д., — были открыты еще в середине 1990-х годов. Этот успех медицинской генетики позволил организовать эффективную диагностику семейных опухолевых синдромов. Появились способы обнаружения здоровых носителей «раковых» мутаций, ассоциированных с фатальной предрасположенностью к той или иной разновидности новообразований. Соответственно, были разработаны мероприятия по ранней диагностике рака в группах риска, а также сформирована идеология профилактических операций. В конце прошлого десятилетия появились сведения о необычном спектре лекарственной чувствительности наследственных опухолей. В настоящее время разработан целый арсенал терапевтических средств, позволяющих эффективно лечить некоторые разновидности наследственных новообразований молочной железы, яичника, предстательной железы, толстой кишки, щитовидной железы, мозга и т. д. [4, 5]. Прорывом в трансляционной онкологии стало практически случайное обнаружение мутаций, ассоциированных с изменением конформации протеинкиназ и, как следствие, с избирательной чувствительностью мутированных онкобелков к отдельным лекарственным препаратам. В настоящее время в практической онкологии рутинно применяют тесты, направленные на анализ мутаций в генах EGFR, ALK, ROS1, BRAF, NTRK1, NTRK2, NTRK3, MET и т. д. При помощи таргетных препаратов, специфичных в отношении перечисленных киназ, удалось многократно улучшить результаты лечения отдельных категорий пациентов с раком легкого, меланомой, некоторыми другими опухолями. В целом диагностику соматических мутаций в новообразованиях можно рассматривать как отдельный компонент обследования онкологических пациентов [4]. Перечисленные выше достижения успешно используют в клинической онкологии — они уже вошли в стандарты медицинской помощи практически во всех странах мира. В настоящем обзоре мы попытаемся отразить новые тенденции в молекулярной диагностике рака, которые, скорее всего, станут главными направлениями трансляционной онкологии в предстоящем десятилетии.

Секвенирование нового поколения

Разработка и внедрение секвенирования нового поколения (next generation sequencing, NGS) представляет одно из главных достижений биомедицинской науки последних десятилетий. Суть NGS заключается в многократном прочтении случайных фрагментов ДНК-матрицы. Последующая компьютерная сборка проанализированных фрагментов помогает воссоздать исходную последовательность ДНК, которая подвергалась анализу. Исключительной особенностью секвенирования нового поколения является огромная производительность: например, стандартное оборудование для NGS позволяет в течение нескольких дней «прочитать» полный геном человека [6, 7]. С помощью NGS можно анализировать не только индивидуальные геномы, но и выполнять интегративные аналитические процедуры. В частности, NGS применяют для индивидуальной характеристики микроорганизмов, населяющих кишечник [8, 9]. Многократные прочтения обеспечивают необычайную чувствительность NGS — этот метод позволяет выявлять единичные мутированные копии генов, присутствующие в окружении избытка нормальных последовательностей ДНК, в частности, обнаруживать следовые количества опухолевых клеток [10]. Наиболее очевидное применение NGS — анализ генома человека с целью диагностики наследственных заболеваний [11]. Секвенирование нового поколения стало мощным инструментом идентификации новых генов, ассоциированных с наследственными патологиями. Полный анализ кодирующей части генома — так называемое полноэкзомное секвенирование — является неотъемлемым компонентом обследования пациентов с признаками генетических аномалий, у которых причину заболевания не удалось установить стандартными методами лабораторного анализа.

В то время как полноэкзомное секвенирование представляется предпочтительным методом для выявления новых геномных нарушений, например для научно-исследовательской работы, в практической медицине более популярно секвенирование мультигенных панелей. В частности, огромное количество наследственных болезней характеризуется наличием фенокопий — таким термином описывают явление, когда один и тот же фенотип может вызываться мутациями в различных генах. Еще несколько лет назад генетическое обследование пациентов с подобными заболеваниями предусматривало последовательный анализ всех генов, причастных к подозреваемой патологии. Подобная процедура занимала несколько месяцев и отличалась необычайно высокой стоимостью. В настоящее время более оправдано использование NGS-панели, которая включает все потенциальные гены-кандидаты. Оборудование для NGS предусматривает возможность одновременного исследования нескольких образцов — это значительно уменьшает стоимость диагностики в пересчете на одного пациента. Многие мультигенные панели формируются не столько по принципу объединенного фенотипа как такового, сколько по принадлежности генов к одному классу заболеваний. Например, некоторые диагностические NGS-наборы объединяют все гены наследственного рака — их применяют для обследования пациентов с раком молочной железы, яичника, толстой кишки и т. д. [12–14]. Технология NGS позволила идентифицировать новые гены наследственного рака. Помимо этого, значительно возросло число пациентов, обследованных при помощи мультигенных панелей. Эти работы показали, что в целом NGS отличается большей надежностью и универсальностью по сравнению со «стандартными» методами ДНК-анализа. В научной литературе описаны случаи выявления мутаций у тех пациентов, которым не удалось поставить диагноз посредством других методов ДНК-тестирования. Особенность NGS, в отличие от секвенированию по Сэнгеру, заключается в способности выявлять крупные мутации, например делеции или дупликации экзонов.

В настоящее время в клинической диагностике используют несколько коммерческих генных панелей, предназначенных для обнаружения наследственного рака. Они, как правило, включают гены как с высокой пенетрантностью, так и среднепенетрантные. Помимо этого, разработчики NGS-наборов предлагают диагностировать не только гены с твердо доказанной медицинской значимостью, но и недавно идентифицированные гены-кандидаты. Это приводит к некоторой неопределенности толкования результатов мультигенных тестов: если выявление инактивирующих мутаций в генах BRCA1 или BRCA2 не вызывает затруднений в интерпретации итогов NGS, то идентификация, например, мутации в гене BRIP1 может свидетельствовать как в пользу диагноза наследственного рака молочной железы, так и в пользу генетического дефекта с не в полной мере доказанной значимостью. Тем не менее в среднесрочной перспективе можно ожидать создания систем популяционного скрининга для определения носительства мутаций, предрасполагающих к развитию рака [4, 12, 15–17].

Другой сферой применения мультигенных тестов в онкологии является анализ соматических мутаций в опухолях. Количество известных генов-мишеней, ассоциированных с чувствительностью к тем или иным лекарственным препаратам, относительно невелико — оно измеряется в лучшем случае десятками, а при использовании максимально расширенных критериев — сотнями. Вероятность обнаружения каждого отдельного события в каждой конкретной опухоли обычно ничтожно мала: например, мутации в гене EGFR, характерные для карцином легкого, встречаются лишь в единичных случаях других разновидностей новообразований. Однако если соединить все перспективные для выбора лечения генные мутации в едином пуле и подвергнуть анализу всех пациентов, то число индивидуумов, у которых удастся выявить мишень для терапии [18–23], будет значимо. Разработка мультигенных панелей для диагностики определенных мутаций представляет нетривиальную задачу. Значительное количество предиктивных мутаций приходится на транслокации с варьирующими точками разрыва. В качестве примера можно привести перестройки в генах ALK, ROS1, NTRK1, NTRK2, NTRK3 и т. д. Для идентификации подобных событий необходимо секвенировать интроны на матрице ДНК, а также проанализировать последовательности РНК (кДНК). Еще большей проблемой является интерпретация результатов. Если достаточно частые мутации, например внутригенные делеции экзона 19 в гене EGFR или замены в кодоне 600 гена BRAF, обладают очевидной предиктивной значимостью, многие другие события, в частности редкие аминокислотные замены, далеко не всегда ассоциированы с особенностями лекарственной чувствительности опухоли [4, 21–25]. Помимо анализа индивидуальных мутаций определенную ценность может представлять примерная оценка общего количества соматических событий. Большое количество соматических генных нарушений ассоциировано с увеличенной антигенностью опухоли и, следовательно, с более высокой вероятностью ответа на иммунную терапию [26]. В мире существует несколько сервисов, специализирующихся на NGS-анализе опухолей. Они не только выполняют само NGS-исследование, но и интерпретируют его результаты. Опубликованы работы, оценивающие клиническую эффективность терапии, назначенной на основании данных мультигенного секвенирования. В целом подобный подход позволяет добиться положительного эффекта у отдельных пациентов [27–29].

Мониторинг молекулярного портрета опухоли в процессе лечения

Практически вся клиническая онкология базируется на однократном анализе опухолевой ткани, который производят в самом начале лечения. Подобный подход крайне уязвим: современные исследования показывают, что опухоль значительно видоизменяет свои характеристики в процессе терапии. Эти изменения критически отражаются на спектре лекарственной чувствительности новообразования. Механизмы приобретенной резистентности к лекарственной терапии делят на две группы. Существуют общие закономерности адаптации опухоли к терапевтическому воздействию. Например, в трансформированных клетках могут активироваться ионные каналы, через внешнюю мембрану которых происходит экскреция лекарственных препаратов. Во многих опухолях в процессе терапии наблюдается частичная инактивация процессов апоптоза, что снижает чувствительность новообразования к лекарственному воздействию [30, 31]. Другая группа способов «привыкания» карцином к терапии подразумевает перепрограммирование специфических сигнальных путей, на который воздействует лекарственный препарат. Например, конформационной модификации может подвергаться сама молекулярная мишень, на поражение которой направлен терапевтический ингибитор. Клетки могут приобретать резистентность к таргетной терапии посредством активации коллатеральных сигнальных каскадов. В некоторых случаях формируется клон опухоли, утративший зависимость от той драйверной мутации, которая изначально сыграла ключевую роль в патогенезе новообразования [30, 31]. Эволюция неоплазмы в процессе лечения происходит необычайно быстро — иногда полная трансформация биологических свойств карциномы занимает всего несколько недель. По-видимому, во многих случаях подобный процесс связан с селекцией предсуществующих клеток, которые резистентны к терапии [32]. В других ситуациях адаптация к терапевтическим воздействиям осуществляется посредством возникновения новых эпигенетических или эпигенетических событий.

Вне зависимости от сценария, по которому опухоль ускользает от системного лечения, следует признать, что терапия не может основываться лишь на анализе первичного новообразования — представляется крайне необходимым постоянно следить за динамикой свойств опухоли на протяжении всей истории болезни [30]. Необходимо учитывать, что уже в настоящее время существует целый ряд алгоритмов назначения лечения в зависимости от изменений молекулярного портрета опухоли. В ходе эндокринной или HER2-специфической терапии при раке молочной железы может меняться статус соответствующих рецепторов, что делает нецелесообразным продолжение приема таргетного средства. Лечение ингибиторами ароматазы иногда приводит к активации онкогена HER2 посредством точковой мутации — соответственно, для подобной изоформы HER2-рецептора необходимы эффективные препараты [33, 34]. Лечение гефитинибом или эрлотинибом опухолей легкого примерно в половине случаев сопровождается появлением мутации Т790М в гене, кодирующем рецептор эпидермального фактора роста (EGFR). Для инактивации Т790М-мутированного белка EGFR разработан специальный препарат — осимертиниб [35]. Наиболее наглядным примером повторного анализа опухоли в процессе лечение является исследование операционного материала, полученного после неоадъювантной терапии. В данном случае пациенты не подвергаются отдельным интервенционным мероприятиям, направленным на получение репрезентативных фрагментов новообразования. Куда более сложной представляется задача мониторинга метастатических очагов карцином, которые служат объектом для воздействия системной терапии на протяжении длительных промежутков времени. В некоторых случаях, например при таргетной терапии рака легкого, допускается выполнение серийных биопсий [36–38]. Эти инвазивные процедуры сопряжены со значительными рисками для пациента и высокой нагрузкой на систему здравоохранения в целом. Существенно, что в большинстве случаев прогрессирование заболевания сопровождается появлением нескольких метастатических очагов, при этом каждый из них может иметь собственную траекторию молекулярной эволюции. Выполнение серийных биопсий всех опухолевых узлов представляется абсолютно неприемлемым сценарием обследования больного. Значительные усилия направлены на разработку методов неинвазивного мониторинга биологического статуса новообразования [30].

Большую известность получила технология так называемой жидкостной биопсии. Известно, что у онкологических пациентов в периферической крови и других жидкостях могут содержаться фрагменты опухоли — циркулирующие трансформированные клетки, опухолеспецифические (тканеспецифические) белки, фрагменты ДНК, микроРНК и т. д. Анализ опухолеспецифических последовательностей ДНК — наиболее перспективная технологическая платформа для жидкостной биопсии, так как многие молекулярно-генетические методики — полимеразная цепная реакция, NGS и т. д. — позволяют выявлять единичную мутированную копию гена в присутствии избытка нормальной ДНК. Серийный анализ образцов плазмы не вызывает затруднений для пациента. Считается, что жидкостная биопсия позволяет получить интегральное представление о биологическом статусе всех опухолевых очагов, присутствующих в организме [39–41]. В настоящее время жидкостная биопсия уже используется в практической онкологии для анализа мутаций EGFR Т790М у пациентов, получающих лечение гефитинибом, эрлотинибом или афатинибом. На основе результатов данного теста принимают решение о целесообразности назначения ингибитора EGFR третьего поколения — препарата осимертиниба [42, 43]. Ожидается, что в среднесрочной перспективе сфера использования жидкостной биопсии заметно расширится.

Персонализированные ex vivo модели опухолей

Этот раздел целесообразно начать с примера, отражающего современные подходы к лечению инфекционных заболеваний. В настоящее время рутинным способом обследования пациентов с признаками инфекции является посев. Эта процедура позволяет не только установить спектр патогенных микроорганизмов, но и выполнить тесты на их чувствительность к антибиотикам. Примерно такой же по своей идее подход может применяться по отношению к онкологическим пациентам. Существуют методы культивирования опухолевых клеток ex vivo. Подобная технология, по крайней мере в теории, может позволить выполнить ряд тестов, направленных на персонализированный подбор противоопухолевой терапии [44]. Получение ex vivo индивидуальных клонов опухолей — достаточно сложный процесс. Наиболее простым подходом считается культивирование опухолевых клеток in vitro. В подавляющем большинстве случаев эти клетки прекращают деление уже в течение нескольких пассажей, поэтому многие тесты ориентированы преимущественно на работу с так называемыми краткосрочными культурами. Для отдельных пациентов удается получить так называемую долгосрочную культуру — как правило, это связано с тем, что при пассировании опухолевых клеток происходят дополнительные генетические события, обеспечивающие иммортализацию клеточной линии. Существует огромное количество различных лабораторных приемов для повышения эффективности процесса получения клеточных культур. Они включают использование различных питательных средств, вспомогательных факторов роста, биохимических добавок, подложек и т. д. Тем не менее многие разновидности новообразований с трудом подвергаются перевивке в культуру — в наибольшей мере это ограничение присуще карциномам с относительно благоприятным течением, в частности опухолям молочной железы, новообразованиям простаты и т. д. [44–47].

В развитых странах появились исследовательские программы, которые направлены на получение ксенографтов от каждого онкологического пациента. В этом случае фрагмент опухоли трансплантируется иммунодефицитным мышам. В общем эффективность получения опухолевых клонов при перевивке животным выше по сравнению с попытками получения клеточных культур. По-видимому, это связано с тем, что живые организмы обеспечивают более благоприятные условия для поддержания жизнеспособности пересаженных клеток [46, 48, 49]. Опухолевые клеточные линии и ксенографты, как правило, сохраняют драйверные мутации, которые послужили причиной злокачественной трансформации. Соответственно, индивидуализированные опухолевые модели отражают способность первичной опухоли отвечать, например, на терапию ингибиторами мутированных киназ. Однако, если принимать во внимание более интегральные биологические характеристики новообразований, вопрос о потенциальной медицинской информативности индивидуальных ex vivo моделей остается нерешенным. В ходе перевивки «приживается» только отдельный клон опухолевых клеток, который может не в полной мере отражать все особенности исходного новообразования. Помимо этого, как упоминалось выше, в процессе выращивания опухолевых клеток ex vivo используют довольно большое количество мощных биологически активных веществ. Эти манипуляции наверняка приводят к видоизменению многих существенных компонентов жизнедеятельности неоплазм. Следует помнить, что противоопухолевая терапия действует на фоне функционирующей системы иммунитета: не в полной мере очевидно, насколько манипуляции с клеточными культурами или иммунодефицитными мышами могут адекватно отражать особенности взаимодействий между опухолевыми клетками и лекарственными препаратами в условиях живого организма [44].

Дополнительная информация

Благодарности. Данная работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (гранты № 17-00-00171, 18-515-45012 и 19-515-25001).

Конфликт интересов. Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

Евгений Наумович Имянитов

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Петрова» Минздрава России; ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: evgeny@imyanitov.spb.ru
ORCID iD: 0000-0003-4529-7891
SPIN-код: 1909-7323

д-р мед. наук, профессор, чл.-корр. РАН, руководитель отдела биологии опухолевого роста; заведующий кафедрой общей и молекулярной медицинской генетики

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы