Optimization of purification conditions and study of antigenic properties of recombinant nucleocapsid protein of different SARS-CoV-2 strains

Full Text

Список сокращений

ИПТГ — изопропилтиогалактозид; ПЦР — полимеразная цепная реакция.

Обоснование

Пандемия COVID-19, начавшаяся в конце 2019 г., стала причиной глобального социально-экономического кризиса, последствия которого проявляются до сих пор [1]. На сегодняшний день зарегистрировано более 500 млн случаев заражения SARS-CoV-2, и с появлением новых штаммов вируса это число продолжает расти [2]. Эффективный контроль распространения инфекции может быть обеспечен при своевременном выявлении и детальном анализе каждого отдельного случая.

Традиционно лабораторный анализ на COVID-19 выполняется в двух вариантах: прямая детекция вирусной РНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени (РТ-ПЦР) в носоглоточных мазках или определение титра противовирусных антител серологическими методами (иммуноферментный анализ, реакция микронейтрализации или автоматизированный хемилюминесцентный анализ) [3]. Несмотря на то что серологическое тестирование не подходит для диагностики острой фазы инфекции, с его помощью можно оценить не только интенсивность гуморального иммунного ответа у отдельных лиц, но и темпы распространения инфекции, и степень формирования коллективного иммунитета [3].

Большинство современных иммуноферментных тест-систем для детекции антител против SARS-CoV-2 разработано на основе поверхностного шипового белка этого вируса, поскольку посредством его вирус проникает в клетки-мишени [4]. Однако определить с их помощью, что стало причиной появления противовирусных антител, вакцинация или инфекция, не представляется возможным. В этой связи целесообразна разработка аналитических тест-систем на основе других белков SARS-CoV-2, в частности консервативного и высокоиммуногенного белка нуклеокапсида (N), в больших количествах синтезируемого в зараженных клетках [5]. Дополнительный скрининг донорского материала с помощью таких тест-систем при определении иммуногенности новых вакцин против SARS-CoV-2 позволит избежать завышения данных из-за ошибочного включения в контрольную группу лиц, переболевших COVID-19 в период вакцинации [6].

Релевантность иммуноферментных тест-систем, разработанных на основе N-белка SARS-CoV-2, выделенного в начале пандемии и принадлежащего линии B.1 (Wuhan) [7–9], в случае скрининга материала лиц, переболевших вирусами других генетических линий, остается неизвестной. Таким образом, цель настоящего исследования — оптимизация условий получения рекомбинантных N-белков SARS-CoV-2 различных генетических линий и анализ возможности создания на их основе иммуноферментных тест-систем.

Материалы и методы

В исследовании приняли участие 13 реконвалесцентов COVID-19 и 17 наивных доноров 21–77 лет. Образцы венозной крови были отобраны после получения информированного согласия от доноров спустя ≥22 дня после заболевания. Данное исследование — часть проекта «Изучение формирования иммунного ответа после перенесенной коронавирусной инфекции», одобренного локальным этическим комитетом ФГБНУ «ИЭМ» (протокол № 2/20 от 7 апреля 2020 г.). Сыворотки отделяли центрифугированием при 1000 g в течение 10 мин и хранили при –20 °C.

В работе использовали пять штаммов SARS-CoV-2, полученных из коллекции вирусов гриппа и ОРВИ ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава РФ:

• hCoV-19/Russia/StPetersburg-3524/2020 (линия B.1, Wuhan);
• hCoV-19/Russia/SPE-RII-27029S/2021 (линия1.351, Beta);
• hCoV-19/Japan/TY7-503/2021 (линия1, Gamma);
• hCoV-19/Russia/SPE-RII-32759S/2021 (линия1.617.2, Delta);
• hCoV-19/Russia/SPE-RII-6243V1/2021 (линия1.1.529, Omicron).

Очистку тотальной РНК из вируссодержащей жидкости осуществляли набором Biolabmix RNA Isolation Kit. Гены, кодирующие N-белки различных вирусов, амплифицировали набором BioMaster RT-PCR Premium Kit и клонировали в экспрессионный вектор pETDuet-1 по рестрикционным сайтам BamHI и NotI, добавляя к N-концевой части экспрессируемых белков полигистидиновый таг. Трансформированные плазмидами клетки Escherichia coli штамма BL21 (DE3) культивировали в среде LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 0,1 мМ изопропилтиогалактозида (ИПТГ). Полученную биомассу ресуспендировали в буфере, содержащем 100 мкг/мл лизоцима, и лизировали ультразвуком. Осветленный при 16 000 g лизат наносили на колонку с заряженным ионами Co²⁺ сорбентом His-Bind (Novagen, США), уравновешенную ресуспендирующим буфером с добавлением 5 мМ имидазола. Очистку белков проводили при скорости потока 0,5 мл/мин, для элюции использовали ресуспендирующий буфер, содержащий 200 мМ имидазола.

Электрофоретический анализ полученных фракций и лизатов проводили в невосстанавливающих условиях, используя 12,5 % разрешающий акриламидный гель. Результаты визуализировали стандартным окрашиванием Кумасси G-250 либо методом иммуноблоттинга, осуществляя влажный перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану с диаметром пор 0,45 мкм. После обработки 5 % сухим обезжиренным молоком в течение 1 ч при 37 °C мембрану выдерживали в растворе антиполигистидиновой пробы (1 : 10000, Thermo Fischer, США) и далее после трехкратной отмывки проявляли 0,05 % раствором диаминобензидина (Sigma, США), содержащим 1 % перекиси водорода.

Для исследования возможности использования очищенных белков как основы для создания иммуноферментных тест-систем проводили их сорбцию при концентрации 1,5 мкг/мл в течение 16–18 ч при 4 °C. Затем, после трехкратной отмывки фосфатным буфером, содержащим 0,05 % Твин-20, в лунки вносили 5 % раствор обезжиренного сухого молока. Инкубацию проводили в течение 1 ч при 37 °C, после чего вносили по 50 мкл растворов исследуемых сывороток и также проводили часовую инкубацию. После трехкратной отмывки в лунки вносили по 50 мкл антител козы против IgG человека, конъюгированных с пероксидазой хрена (1 : 3000). Спустя 1 ч проводили финальную отмывку и регистрировали иммуноферментную реакцию с использованием тетраметилбензидина и ридера для микропланшета при длине волны 450 нм. За конечный титр принимали последнее разведение сыворотки, где оптическая плотность вдвое превышала средний уровень фоновых лунок.

Статистическую обработку данных выполняли в программе GraphPad Prism 6.0. Для проверки нормальности распределения использовали тест Шапиро – Уилка. Значимость различий между группами оценивали однофакторным дисперсионным анализом по Краскелу – Уоллису с апостериорным критерием Данна. Достоверность различий признавали при p < 0.05.

Результаты

Исследование влияния различных концентраций индуктора синтеза рекомбинантных белков и времени культивирования на интенсивность синтеза N-белка коронавируса линии Wuhan (см. рисунок, а) показало, что индукция происходит при добавлении минимального количества ИПТГ (0,1 мМ). Аналогичные результаты получены при анализе влияния временного фактора на индукцию экспрессии N-белков штаммов остальных линий при добавлении 0,1 мМ ИПТГ. Добавление этанола в культуру клеток-продуцентов N-белка различных штаммов SARS-CoV-2 до конечной концентрации 3 % не повлияло на интенсивность синтеза как в течение 4 ч при добавлении 0,1 мМ ИПТГ, так и в течение 20 ч при добавлении 0,5 мМ индуктора (см. рисунок, b). Электрофоретический анализ очищенных белков пяти исследованных штаммов представлен на рисунке, c. Его результаты хорошо согласуются с данными иммуноблоттинга (см. рисунок, d).

Вирусспецифические антитела против N белков SARS-CoV-2 различных генетических линий обнаружены во всех экспериментальных группах (см. рисунок, e). Однако титры противовирусных антител у реконвалесцентов оказались в несколько раз выше по сравнению с таковыми у доноров из контрольной экспериментальной группы (p < 0,001).

 

Рисунок. Электрофоретический анализ влияния: a — концентрации индуктора и времени индукции на интенсивность экспрессии N-белка SARS-CoV-2 линии Wuhan, дорожка 1 — 0,1 мМ ИПТГ; дорожка 2 — 0,5 мМ ИПТГ; b — добавления этанола на индукцию экспрессии N-белков; c — очищенных N-белков; d — вестерн-блот анализ очищенных N-белков; e — титры противовирусных антител класса IgG, определенные с использованием тест-системы, созданной на основе рекомбинантных N-белков. Приведены средние значения ± стандартные ошибки среднего. ИПТГ — изопропилтиогалактозид; с — контрольные образцы без индукции. * p < 0,001

Figure. SDS-PAGE analysis: a — of inductor concentration and induction time effects on the intensity of N protein expression of the Wuhan strain (lane 1 — 0.1 mM IPTG, lane 2 — 0.5 mM IPTG); b — of ethanol addition effects on the induction of expression of N proteins; c — of purified N proteins; d — SARS-CoV-2 virus-specific IgG antibody titers measured in ELISA based on recombinant N proteins. The data are given as mean values ± standard error means showed by error bars. IPTG — isopropylthiogalactoside; c — control samples without induction. * p < 0.001

 

Обсуждение

В настоящее время использование серологических методов в диагностике COVID-19 — распространенный общепринятый подход, поскольку он дает возможность оценить интенсивность генерации противовирусных антител и, следовательно, степень активации гуморального противовирусного иммунитета при минимальных затратах времени и средств [10]. Этот показатель коррелирует с индивидуальной и социальной защищенностью в случае будущего заражения, поэтому может быть использован как для оценки рисков у отдельных лиц, так и для анализа выработки коллективного иммунитета [11].

С появлением новых штаммов SARS-CoV-2 требуется разработка тест-систем, пригодных для детекции антител к белкам эволюционирующих вирусов. Поскольку шиповый белок коронавируса крайне мутабельный [12], хорошей альтернативой представляется разработка диагностических инструментов на основе более консервативного антигена.

Качество и выход антигена во многом обусловливает экономичность, специфичность и чувствительность разработанных на его основе тест-систем. В этой связи после получения продуцентов N-белков мы провели анализ влияния различных факторов (температуры, концентрации индуктора, продолжительности индукции, присутствия этанола) на интенсивность синтеза антигенов. Эффективная индукция была достигнута при использовании 0,1 мМ ИПТГ уже через 1 ч культивирования при 37 °C (см. рисунок, а). Значительного влияния присутствия 3 % этанола (что способствует увеличению выхода некоторых рекомбинантных белков [13]) при различных концентрациях индуктора при 20 или 37 °C на интенсивность экспрессии выявлено не было (см. рисунок, b). Используя 100 мл бактериальных культур, выращенных в присутствии 0,1 мМ ИПТГ в течение 2 ч при 37 °C, мы получили 1 мг высокоочищенных N-белков (см. рисунок, c), идентифицированных методом иммуноблоттинга (см. рисунок, d). Эти данные отражают экономичность получения антигенов, распознавание которых противовирусными антителами свидетельствует о корректности фолдинга белков и о возможности создания на их основе релевантных иммуноферментных тест-систем (см. рисунок, e).

Анализ сывороток доноров позволил выявить не только кросс-реактивность противовирусных антител по отношению к антигенам SARS-CoV-2 различных генетических линий, но и наличие низкого титра у добровольцев контрольной группы, не имевших COVID-19 в анамнезе и у которых не выявлялись антитела к шиповому белку коронавируса. Эти явления объяснимы с учетом консервативности структуры и последовательности бетакоронавирусных N-белков [5], контакт с которыми в последнем случае мог произойти в результате сезонной инфекции. Для детальной характеристики предложенных тест-систем будут проведены дополнительные исследования с расширенными экспериментальными группами.

Выводы

1. Оптимизированы условия получения рекомбинантных N белков SARS-CoV-2 различных генетических линий.
2. Показана возможность создания на основе очищенных рекомбинантных N белков иммуноферментных тест-систем.
3. Обнаружена кросс-реактивность противовирусных антител по отношению к антигенам различных генетических линий нового коронавируса.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Исследование выполнено при поддержке Российского научного фонда в рамках проекта № 21-75-30003.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, связанных с подготовкой и публикации статьи.

Соблюдение этических норм. Выполнение исследования одобрено этическим комитетом Института экспериментальной медицины (протокол № 2/20 от 07.04.2020).

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Наибольший вклад распределен следующим образом: А.Я. Рак, С.А. Донина — проведение экспериментальных исследований, обработка и анализ результатов; И.Н. Исакова-Сивак — анализ полученных результатов; Л.Г. Руденко — общая координация исследований.

Additional information

Funding. The study was performed with the financial support of the Russian Science Foundation (Project No. 21-75-30003).

Competing interests. The authors have no interest conflict related to this article publication to declare.

Compliance with ethical standards. The study was approved of the Ethics Committee of the Institute of Experimental Medicine (Protocol No. 2/20 by April 7, 2020).

Authors̕ contribution. All authors made a significant contribution to the development of the concept and preparation of the article, read and approved the final version before publication. The largest contribution is distributed as follows: A.Ya. Rak, S.A. Donina — experimental work, processing and analysis of the results; I.N. Isakova-Sivak — analysis of the results; L.G. Rudenko — general coordination of research.

About the authors

Alexandra Ya. Rak

Institute of Experimental Medicine

Author for correspondence.
Email: rak.ay@iemspb.ru
ORCID iD: 0000-0001-5552-9874

Cand. Sci. (Biol.), Senior Research Associate of Laboratory of Immunology and Prophylaxis of Viral Infections of Department of Virology

Russian Federation, Saint Petersburg

Svetlana A. Donina

Institute of Experimental Medicine

Email: sveta.donina@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-6502-8341
Scopus Author ID: 6602276916

MD, Cand. Sci. (Med.), Senior Research Associate of Laboratory of Immunology and Prophylaxis of Viral Infections of Department of Virology

Russian Federation, Saint Petersburg

Irina N. Isakova-Sivak

Institute of Experimental Medicine

Email: isakova.sivak@iemspb.ru
ORCID iD: 0000-0002-2801-1508
SPIN-code: 3469-3600
Scopus Author ID: 23973026600

Dr. Sci. (Biol.), Head of Laboratory of Immunology and Prevention of Viral Infections, A.A. Smorodintsev Department of Virology

Russian Federation, Saint Petersburg

Larisa G. Rudenko

Institute of Experimental Medicine

Email: vaccine@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0107-9959
SPIN-code: 4181-1372
Scopus Author ID: 7005033248

MD, Dr. Sci. (Med.), Professor, Head of the A.A. Smorodintsev Department of Virology

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files