Delivery of a DNA vaccine encoding SARS-CoV-2 receptor-binding domain (RBD) by electroporation

Denis  N. Kisakov; Кисаков Денис Николаевич; Lyubov  A. Orlova; Орлова Любовь Александровна; Sergey V. Sharabrin; Шарабрин  Сергей Валерьевич; Andrey  P. Rudometov; Рудометов  Андрей  Павлович; Maria  B. Borgoyakova; Боргоякова Мария  Борисовна; Ekaterina  V. Starostina; Старостина  Екатерина  Владимировна; Larisa  I. Karpenko; Карпенко  Лариса  Ивановна; Alexander  A. Ilyichev; Ильичев  Александр  Алексеевич

doi:10.17816/MAJ108614

Доставка ДНК-вакцины, кодирующей рецепторсвязывающий домен (RBD) SARS-CoV-2 с использованием электропорации

Авторы: Кисаков Д.Н.¹, Орлова Л.А.¹, Шарабрин С.В.¹, Рудометов А.П.¹, Боргоякова М.Б.¹, Старостина Е.В.¹, Карпенко Л.И.¹, Ильичев А.А.¹
Учреждения:
1. Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора
Выпуск: Том 22, № 2 (2022)
Страницы: 191-196
Раздел: Материалы конференции
URL: https://journals.eco-vector.com/MAJ/article/view/108614
DOI: https://doi.org/10.17816/MAJ108614
ID: 108614

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ
Доступ закрыт

Доступ предоставлен
Доступ закрыт

Доступ платный или только для подписчиков

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Обоснование. Средства профилактики на основе нуклеиновых кислот — многообещающая платформа для создания вакцин, в том числе против COVID-19. Ранее мы разработали ДНК-вакцину рVAXrbd, кодирующую RBD — рецепторсвязывающий домен SARS-CoV-2, индуцирующую при внутримышечном введении животным относительно слабый иммунный ответ. Следующая ступень исследования — усиление этого ответа, в частности электропорацией, одним из методов повышения иммуногенности ДНК-вакцин.

Цель статьи — оценить иммунный ответ с использованием электропорации у мышей после иммунизации pVAXrbd.

Материалы и методы. Мышей линии BALB/c иммунизировали pVAXrbd электропорацией постоянным током прямоугольной формы прямой и обратной полярности тремя импульсами с напряжением 12 В в течение 30 мс и интервалом 950 мл с ограничением по силе тока 45 мА.

Результаты. Мыши BALB/c иммунизированы дважды с интервалом в три недели дозой 100 мкг ДНК. Полученные с помощью иммуноферментного анализа крови титры RBD-специфических антител в группе животных, иммунизированных рVAXrbd с применением электропорации, составили 1 : 109 350, что в 16,2 раз выше, чем в группе животных, получавших ДНК-вакцину только внутримышечно (титры 1 : 6750). Анализ IFNγ ELISpot показал, что наибольшее количество клеток (2434 спотов/спленоциты, млн), продуцирующих IFNγ в ответ на стимуляцию пептидами из белка RBD, зарегистрировано в группе животных, иммунизированных рVAXrbd с применением электропорации. Для сравнения: в контрольной группе количество клеток в 6,5 раз ниже (380 спотов/спленоциты, млн).

Заключение. Введение ДНК-вакцины рVAXrbd лабораторным животным электропорацией значительно усиливает как гуморальный, так и клеточный специфический иммунный ответ в сравнении с внутримышечным введением «голой» ДНК-вакцины.

Ключевые слова

ДНК-вакцина, RBD, SARS-CoV-2, электропорация, иммунный ответ

Полный текст

Список сокращений

рVAXrbd — ДНК-вакцина; RBD — рецепторсвязывающий домен; ИФА — иммуноферментный анализ.

Обоснование

Средства профилактики на основе нуклеиновых кислот — многообещающая платформа для создания вакцин, в том числе против COVID-19 [1]. Ряд ДНК-вакцин проходит клинические испытания, а ZyCoV-D индийской компании Zydus Cadila стала первой в мире ДНК-вакциной, одобренной для вакцинации человека [2]. Преимущества вакцин на основе нуклеиновых кислот — быстрота и простота разработки, низкая стоимость производства, безопасность, способность индуцировать гуморальный и клеточный иммунитет. Но основной недостаток ДНК-вакцин — их низкая иммуногенность при введении в виде «голой» ДНК [3], именно поэтому во всем мире идет поиск эффективных способов доставки [4].

Процедура электропорации представляет собой генерацию электрических импульсов, способных вызвать обратимую дестабилизацию липидной мембраны клеток, что позволяет эффективно доставить нуклеиновые кислоты (введенные внутримышечно) из межклеточного пространства в клетки [5]. Эта процедура позволяет избежать многих нежелательных эффектов химических и вирусных методов доставки, может использоваться повторно, относительно проста и экономична, к тому же практически не имеет ограничений по длине вводимой ДНК [6, 7].

Цель работы — выбор наиболее эффективного протокола для введения животным ДНК-вакцины pVAXrbd электропорацией и оценка ее иммуногенных свойств.

Материалы и методы

Плазмиды. Для отработки протокола электропорации использовалась плазмида phMGFP, кодирующая зеленый флуоресцентный белок GFP (Promega), и экспериментальная ДНК-вакцина рVAXrbd, сконструированная ранее M.B. Borgoyakova и соавт. [8]. Плазмиды phMGFP и рVAXrbd очищали коммерческими наборами EndoFree Plasmid Giga Kit (QIAGEN, Германия), отсутствие эндотоксинов контролировали LAL-тестом.

Животные. В работе использовали мышей BALB/c массой 16–18 г, полученных из питомника ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Животных анестезировали 2,5 % изофлурана, брили бедренную часть лапки перед внутримышечным введением (в/м) плазмид в бедренную мышцу с применением депилирующего геля.

Электропорация. Отработку протоколов электропорации проводили на модели животных, иммунизированных phMGFP в дозе 30 мкг/100 мкл PBS на животное.

Использовали электропоратор CUY21 EDIT II (BEX Со, Ltd., Япония) и электроды-пинцеты LF650P5 диаметром 5 мм (BEX Со, Ltd., Япония). Комплексное сопротивление между электродами и кожей проверяли перед каждой электропорацией. Различные по эффективности варианты протоколов представлены в таблице.

Таблица. Различные варианты протоколов электропорации

Table. Different options for electroporation protocols

Протокол, №	1	2	3	5	6	7	8	9	10
Режим импульса	Экспоненциальный		Прямоугольный
Вид импульса	+			+/–
Напряжение, В	100	40	50	40	30	15	12	12	12
Ограничение силы тока, мА	300	300	300	200	200	150	100	100	45
Время импульса, мс	50	30	50	40	40	30	30	30	30
Интервал импульсов, мс	1000	1000	1000	800	900	900	900	950	950
Количество импульсов	5	3	5	8	3	5	3	3	3
Травматичность, %	0	50	50	70	50	30	20	20	0
Качественная оценка флуоресценции GFP	–	–	–	+/–	+/–	+/–	+	+	+

Примечание. Эффективность доставки phMGFP оценивалась визуально микроскопией мышечного среза по оценке интенсивности флуоресценции GFP.

Из представленных в таблице данных следует, что наиболее эффективен протокол с параметрами: постоянный ток прямоугольной формы прямой и обратной полярности с 3 импульсами (напряжение 12 В) в течение 30 мс, интервалом 950 мл, с ограничением по силе тока 45 мА.

Иммунизация pVAXrbd. Животных разделили на две группы: первой группе вводили рVAXrbd в/м в дозе 100 мкг / 100 мкл, второй группе — рVAXrbd в дозе 100 мкг / 100 мкл PBS в/м с электропорацией с параметрами из протокола № 10 (см. таблицу).

Через три недели после иммунизации группам была проведена бустерная иммунизация с использованием той же самой процедуры, что и при первой. На 10-е сутки собирали сыворотки крови и селезенок животных для оценки иммуногенности pVAXrbd.

Иммуноферментный анализ сывороток. Антиген для иммуноферментного анализа (ИФА) — белок RBD (рецепторсвязывающий домен), полученный в эукариотических продуцентах (клетках CHO-K1) и очищенный с помощью аффинной и ионообменной хроматографии (чистота белка >98 %) [9]. Белок RBD (1 мкг/мл в 2 М мочевины) сорбировали на 96-луночные планшеты (Greiner Bio-One, Германия) и блокировали 1 % раствором казеина. Затем в лунки добавляли сыворотки в трехкратном серийном разведении, начиная с 1 : 50, и инкубировали в течение 60 мин при комнатной температуре. Планшет промывали, добавляли конъюгированные с пероксидазой хрена кроличьи антитела против IgG мыши (Sigma), инкубировали в течение 60 мин при комнатной температуре. В лунки планшета, промытого PBST, вносили субстрат 3,3ʹ,5,5ʹ-тетраметилбензидина (ТMB; Amresco, США). Оптическую плотность измеряли при длине волны 450 нм на микропланшетном ридере ChroMate-4300 (Awareness Technology Inc., США).

Выделение спленоцитов. Селезенки последовательно измельчали на нейлоновых фильтрах для клеток с диаметром пор 70 и 40 мкм (BD FalconTM, США). После лизиса эритроцитов лизирующим буфером (Sigma, США) спленоциты дважды отмывали в полной среде RPMI и помещали в 1 мл среды RPMI с 2 мМ L-глутамина, гентамицина (50 мкг/мл) и 10 % фетальной бычьей сывороткой (FBS; Thermo Fisher Scientific, США). Клетки подсчитывали с помощью автоматического счетчика клеток TC20™ (Bio-Rad, США).

IFNγ ELISpot анализ. Анализ проводили наборами Mabtech (США) в соответствии с рекомендациями производителя. Для стимуляции спленоцитов, выделенных от иммунизированных животных, использовали пул из 9 пептидов SARS-CoV-2 RBD (20 мкг/мл каждого пептида), распознаваемых главным комплексом гистосовместимости (MHC) класса I (H-2-Dd, H-2-Kd, H-2-Ld) и молекулами класса II (H2-IAd, H2-IEd) для мышей BALB/c. Пептиды синтезированы компанией AtaGenix Laboratories, Китай (чистота пептидов >80 %). Количество IFNγ-продуцирующих клеток подсчитывали с помощью ELISpot-анализатора фирмы Carl Zeiss (Германия).

Статистика. Данные анализировали GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software, Inc., Сан-Диего, Калифорния, США). Результаты выражены как медиана с диапазоном. Различия в иммунных реакциях между группами оценивали с помощью непараметрического U-критерия Манна – Уитни.

Результаты

Оптимальный протокол доставки нуклеиновых кислот. Наиболее результативной доставкой нуклеиновых кислот для мышей линии Balb/c (рис. 1) оказался следующий протокол: постоянный ток прямоугольной формы прямой и обратной полярности с 3 импульсами напряжением 12 В в течение 30 мс, интервалом 950 мл, ограничением по силе тока в 45 мА.

Рис. 1. Микроскопия мышечной ткани мышей, иммунизированной phMGFP: a — внутримышечное введение phMGFP; b — введение phMGFP электропорацией

Fig. 1. Microscopy of mouse muscle tissue injected with phMGFP: a — intramuscular injection of phMGFP; b — introduction of phMGFP by electroporation

Развитие гуморального иммунного ответа на внутримышечную иммунизацию pVAXrbd. Результаты ИФА сывороток животных, иммунизированных pVAXrbd, введенной либо в/м, либо электропорацией, приведены на рис. 2. Данные демонстрируют, что варианты индуцируют значительно больший уровень синтеза антител по сравнению с группой внутримышечного введения без электропорации.

Рис. 2. RBD-специфичный гуморальный ответ у мышей, иммунизированных pVAXrbd. ИФА — иммуноферментный анализ; ЭП — электропорация. * p < 0,05

Fig. 2. RBD-specific humoral response in mice immunized with pVAXrbd. ELISA — linked immunosorbent assay; EP — electroporation. * p < 0.05

Анализ Т-клеточного иммунного ответа на pVAXrbd. ELISpot анализ показал, что наибольшее количество клеток, продуцирующих IFNγ в ответ на стимуляцию специфическими пептидами, выявлено у мышей, иммунизированных электропорацией, тогда как в группе мышей, иммунизированных «голой» pVAXrbd, детектировано самое малое количество таких клеток среди экспериментальных групп (рис. 3). В целом результаты ELISpot свидетельствуют об усилении поствакцинального Т-клеточного ответа на иммунизацию электропорацией.

Рис. 3. Результаты анализа RBD-специфического Т-клеточного ответа у иммунизированных мышей линии BALB/c с использованием метода ELISpot. ЭП — электропорация. * p < 0,05

Fig. 3. Results of analysis of RBD-specific T-cell response in immunized BALB/c mice by ELISpot method. EP — electroporation. * p < 0.05

Обсуждение

Исходя из полученных нами данных, введение ДНК-вакцин электропорацией позволяет значительно повысить эффективность обычной инъекции. Это объясняется тем, что под действием электрического поля происходит дестабилизация липидной мембраны клетки, а это влечет большее поглощение ДНК-вакцин, соответственно увеличивается объем их доставки в ядро клетки. В результате электропорация повышает иммуногенность ДНК-вакцин.

В данной работе мы провели выбор оптимальных параметров электропорации на модельной плазмиде phMGFP, затем использовали протокол для оценки иммуногенности ДНК-вакцины рVAXrbd. При анализе гуморального ответа с помощью ИФА мы показали, что титр RBD-специфических антител в группе мышей, иммунизированных рVAXrbd с применением электропорации, составил 1 : 109 350, что в 16,2 раза выше, чем в группе животных, получавших ДНК-вакцину только в/м (титры 1 : 6750). Анализ клеточного ответа показал, что наибольшее количество клеток (2433 спотов/спленоцитов, млн), продуцирующих IFNγ в ответ на стимуляцию пептидами из белка RBD, зарегистрировано в группе животных, иммунизированных рVAXrbd с применением электропорации. Для сравнения: в группе контроля с в/м введением pVAXrbd количество клеток в 6,5 раз ниже — 380 спотов/спленоциты, млн.

Однако мы пока что ограничиваемся исследованием применения электропорации на модели мышей, но K. Modjarrad и соавт. [10] предпринимали попытки использовать этот метод для вакцинации людей, результат — формирование стойкого гуморального и клеточного иммунитета, причем о фактах серьезных нежелательных явлений, связанных с вакциной и методом доставки, не сообщалось.

Выводы

Таким образом, полученные результаты показывают, что электропорация рVAXrbd лабораторным животным значительно усиливает как гуморальный, так и клеточный специфический иммунный ответ.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Работа выполнена в рамках государственного задания ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Соблюдение этических норм. Работа с животными проводилась согласно «Руководству по уходу и использованию лабораторных животных». План эксперимента и протоколы были одобрены Биоэтическим комитетом Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» (номер разрешения: НИЦ ВБ «Вектор» / 10.09.2020).

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Наибольший вклад распределен следующим образом: Д.Н. Кисаков, Л.А. Орлова, Л.И. Карпенко, М.Б. Боргоякова, Е.В. Старостина, А.П. Рудомётов, С.В. Шарабрин, А.А. Ильичев — проведение экспериментальных исследований, обработка результатов, анализ полученных результатов.

Additional information

Funding sources. The study was conducted under the state assignment of FBRI SRC VB “Vector”, Rospotrebnadzor.

Competing interests. The authors declare the absence of obvious and potential conflicts of interest related to the publication of this article.

Compliance with ethical standards. Work with animals was carried out according to the “Guidelines for the increase and use of laboratory animals.” The experimental plan and protocols were approved by the Bioethical Committee of the State Scientific Center for Virology and Biotechnology “Vector” (permit number: SRC VB “Vector” / 10.09.2020).

Authors̕ contribution. All authors made a significant contribution to the development of the concept and preparation of the article, read and approved the final version before publication. The largest contribution is distributed as follows: D.N. Kisakov, L.A. Orlova, L.I. Karpenko, M.B. Borgoyakova, E.V. Starostina, A.P. Rudometov, S.V. Sharabrin, A.A. Ilyichev — conducting experimental studies, processing the results, analyzing the results.