Разработка протоколов генотипирования разных вариантов коронавируса SARS-CoV-2 методом пиросеквенирования

Обложка


Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Доступ платный или только для подписчиков

Аннотация

Обоснование. Стремительное распространение коронавируса SARS-CoV-2, вызвавшего пандемию COVID-19, и быстрое появление коциркулирующих антигенно отличающихся вариантов вируса, обусловливают необходимость разработки и обновления тест-систем. Перспективное направление для их создания — протоколы на основе пиросеквенирования.

Цель исследования — разработка протоколов генотипирования наиболее распространенных вариантов коронавируса SARS-CoV-2 с применением полимеразной цепной реакции с последующим определением варианта вируса в пробе методом пиросеквенирования.

Материалы и методы. Разработка протоколов основывалась на выравнивании последовательностей SARS-CoV-2. Тестирование проводилось с использованием РНК вирусов SARS-CoV-2 линий альфа, бета, гамма, дельта, омикрон и референсного варианта. Пиросеквенирование и обработка данных выполнялись системой PyroMark Q24.

Результаты. Отработаны протоколы постановки полимеразной цепной реакции и пиросеквенирования, позволяющие определять последовательности фрагментов гена S, замены в которых характеризуют отдельные варианты SARS-CoV-2. Протоколы позволяют детектировать участки, кодирующие замены в аминокислотных позициях L18F, T19R, T20N; A67V, Δ69-70; G142D, Δ143-145; Δ156-157, R158G; Δ242-244; K417N/T; L452R; S477N, T478K, E484A/K/Q; H655Y; N679K, P681H/R. Проводилась также оценка специфичности системы в реакциях с отрицательным контрольным образцом (РНК, выделенная из соскоба эпителиальных клеток человека).

Заключение. Нами произведена разработка и первичная апробация протоколов для генотипирования вариантов коронавируса (альфа, бета, гамма, дельта, омикрон) на основе методики полимеразной цепной реакции с последующим определением вариантов методом пиросеквенирования c помощью PyroMark Q24. В протоколы заложена возможность гибкой подстройки под текущую эпидемиологическую обстановку за счет возможности оперативного увеличения количества детектируемых участков. Разработанные протоколы позволяют определить подтип вируса в образце, накопленном на культуре клеток.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Анна Константиновна Чистякова

Институт экспериментальной медицины

Автор, ответственный за переписку.
Email: anna.k.chistiakova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9541-5636
SPIN-код: 8852-4103
Scopus Author ID: 57226491888

студентка

Россия, Санкт-Петербург

Екатерина Алексеевна Степанова

Институт экспериментальной медицины

Email: fedorova.iem@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-8670-8645
SPIN-код: 8010-3047

канд. биол. наук, ведущий научный сотрудник отдела вирусологии им. А.А. Смородинцева

Россия, Санкт-Петербург

Ирина Николаевна Исакова-Сивак

Институт экспериментальной медицины

Email: isakova.sivak@iemspb.ru
ORCID iD: 0000-0002-2801-1508
SPIN-код: 3469-3600
Scopus Author ID: 23973026600

д-р биол. наук, заведующая лабораторией иммунологии и профилактики вирусных инфекций отдела вирусологии им. А.А. Смородинцева

Россия, Санкт-Петербург

Лариса Георгиевна Руденко

Институт экспериментальной медицины

Email: vaccine@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0107-9959
SPIN-код: 4181-1372
Scopus Author ID: 7005033248

д-р мед. наук, профессор, заведующая отделом вирусологии им. А.А. Смородинцева

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

  1. Wu F., Zhao S., Yu B. et al. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China // Nature. 2020. Vol. 579. P. 265–269. doi: 10.1038/s41586-020-2202-3
  2. Hadfield J., Megill C., Bell S.M. et al. Nextstrain: real-time tracking of pathogen evolution // Bioinformatics. 2018. Vol. 34, No. 23. P. 4121–4123. doi: 10.1093/bioinformatics/bty407
  3. Koelle K., Martin M.A., Antia R. et al. The changing epidemiology of SARS-CoV-2 // Science. 2022. Vol. 375, No. 6585. P. 1116–1121. doi: 10.1126/science.abm4915
  4. Magazine N., Zhang T., Wu Y. et al. Mutations and Evolution of the SARS-CoV-2 Spike Protein // Viruses. 2022. Vol. 14, No. 3. P. 640. doi: 10.3390/v14030640
  5. WHO. Tracking SARS-CoV-2 variants [Электронный ресурс] // WHO. Режим доступа: https://www.who.int/emergencies/emergency-health-kits/trauma-emergency-surgery-kit-who-tesk-2019/tracking-SARS-CoV-2-variants. Дата обращения: 25.11.2021.
  6. Mengist H.M., Kombe Kombe A.J., Mekonnen D. et al. Mutations of SARS-CoV-2 spike protein: Implications on immune evasion and vaccine-induced immunity // Semin. Immunol. 2021. Vol. 55. P. 101533. doi: 10.1016/j.smim.2021.101533
  7. Vogels C.B.F., Breban M.I., Ott I.M. et al. Multiplex qPCR discriminates variants of concern to enhance global surveillance of SARS-CoV-2 // PLoS Biol. 2021. Vol. 19, No. 5. P. e3001236. doi: 10.1371/journal.pbio.3001236
  8. Kreutz M., Schock G., Kaiser J. et al. PyroMark® instruments, chemistry, and software for pyrosequencing® analysis // Methods Mol. Biol. 2015. Vol. 1315. P. 17–27. doi: 10.1007/978-1-4939-2715-9_2
  9. Levine M., Sheu T.G., Gubareva L.V., Mishin V.P. Detection of hemagglutinin variants of the pandemic influenza A (H1N1) 2009 virus by pyrosequencing // J. Clin. Microbiol. 2011. Vol. 49, No. 4. P. 1307–1312. doi: 10.1128/JCM.02424-10
  10. Couturier B.A., Bender J.M., Schwarz M.A. et al. Oseltamivir-resistant influenza A 2009 H1N1 virus in immunocompromised patients // Influenza Other Respir. Viruses. 2010. Vol. 4, No. 4. P. 199–204. doi: 10.1111/j.1750-2659.2010.00144.x
  11. Mok C.-K., Chang S.-C., Chen G.-W. et al. Pyrosequencing reveals an oseltamivir-resistant marker in the quasispecies of avian influenza A (H7N9) virus // J. Microbiol. Immunol. Infect. 2015. Vol. 48, No. 4. P. 465–469. doi: 10.1016/j.jmii.2013.09.010
  12. Porter E., Tasker S., Day M.J. et al. Amino acid changes in the spike protein of feline coronavirus correlate with systemic spread of virus from the intestine and not with feline infectious peritonitis // Vet. Res. 2014. Vol. 45, No. 1. P. 49. doi: 10.1186/1297-9716-45-49
  13. DeVries A., Wotton J., Lees C. et al. Neuraminidase H275Y and hemagglutinin D222G mutations in a fatal case of 2009 pandemic influenza A (H1N1) virus infection // Influenza Other Respir. Viruses. 2012. Vol. 6, No. 6. P. e85–e88. doi: 10.1111/j.1750-2659.2011.00329.x
  14. Hodcroft E.B. 2021. CoVariants: SARS-CoV-2 Mutations and Variants of Interest [Электронный ресурс]. Режим доступа: https://covariants.org/. Дата обращения: 25.11.2021.
  15. Corman V.M., Landt O., Kaiser M. et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR // Euro. Surveill. 2020. Vol. 25, No. 3. P. 2000045. doi: 10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.200004
  16. Duan L., Zheng Q., Zhang H. et al. The SARS-CoV-2 spike glycoprotein biosynthesis, structure, function, and antigenicity: implications for the design of spike-based vaccine immunogens // Front. Immunol. 2020. Vol. 11. P. 576622. doi: 10.3389/fimmu.2020.576622
  17. Qi Y., Fan H., Qi X. et al. A novel pyrosequencing assay for the detection of neuraminidase inhibitor resistance-conferring mutations among clinical isolates of avian H7N9 influenza virus // Virus. Res. 2014. Vol. 179. P. 119–124. doi: 10.1016/j.virusres.2013.10.026
  18. Deng Y.-M., Caldwell N., Barr I.G. Rapid detection and subtyping of human influenza A viruses and reassortants by pyrosequencing // PLoS One. 2011. Vol. 6, No. 8. P.e23400.6. doi: 10.1371/journal.pone.0023400
  19. Deng Y.-M., Iannello P., Caldwell N. et al. The use of pyrosequencer-generated sequence-signatures to identify the influenza B-lineage and the subclade of the B/Yamataga-lineage viruses from currently circulating human influenza B viruses // J. Clin. Virol. 2013. Vol. 58, No. 1. P. 94–99. doi: 10.1016/j.jcv.2013.04.018
  20. Lau H., Deng Y.-M., Xu X. et al. Rapid detection of new B/Victoria-lineage haemagglutinin variants of influenza B viruses by pyrosequencing // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2019. Vol. 93, No. 4. P. 311–317. doi: 10.1016/j.diagmicrobio.2018.11.003
  21. Tsiatis A.C., Norris-Kirby A., Rich R.G. et al. Comparison of sanger sequencing, pyrosequencing, and melting curve analysis for the detection of KRAS mutations: diagnostic and clinical implications // J. Mol. Diagn. 2010. Vol. 12. P. 425–432. doi: 10.2353/jmoldx.2010.090188
  22. Shcherbik S., Pearce N., Balish A. et al. Generation and characterization of live attenuated influenza A(H7N9) candidate vaccine virus based on Russian donor of attenuation // PLoS One. 2015. Vol. 10, No. 9. P. e0138951. doi: 10.1371/journal.pone.0138951
  23. Vogels C.B.F., Breban M.I., Alpert T. et al. PCR assay to enhance global surveillance for SARS-CoV-2 variants of concern // medRxiv. 2021. doi: 10.1101/2021.01.28.21250486
  24. Kemp S.A., Collier D.A., Datir R.P. et al. SARS-CoV-2 evolution during treatment of chronic infection // Nature. 2021. Vol. 592, No. 7853. P. 277–282. doi: 10.1038/s41586-021-03291-y
  25. McCallum M., De Marco A., Lempp F.A. et al. N-terminal domain antigenic mapping reveals a site of vulnerability for SARS-CoV-2 // Cell. 2021. Vol. 184, No. 9. P. 2332–2347.e16. doi: 10.1016/j.cell.2021.03.028
  26. Starr T.N., Greaney A.J., Hilton S.K. et al. Deep mutational scanning of SARS-CoV-2 receptor binding domain reveals constraints on folding and ACE2 binding // Cell. 2020. Vol. 182, No. 5. P. 1295–1310.e20. doi: 10.1016/j.cell.2020.08.012
  27. Liu Z., VanBlargan L.A., Bloyet L.-M. et al. Identification of SARS-CoV-2 spike mutations that attenuate monoclonal and serum antibody neutralization // Cell Host Microbe. 2021. Vol. 29, No. 3. P. 477–488.e4. doi: 10.1016/j.chom.2021.01.014
  28. Greaney A.J., Loes A.N., Crawford K.H.D. et al. Comprehensive mapping of mutations in the SARS-CoV-2 receptor-binding domain that affect recognition by polyclonal human plasma antibodies // Cell Host Microbe. 2021. Vol. 29, No. 3. P. 463–476.e6. doi: 10.1016/j.chom.2021.02.003
  29. Nonaka C.K.V., Franco M.M., Gräf T. et al. Genomic evidence of SARS-CoV-2 reinfection involving E484K spike mutation, Brazil // Emerg. Infect. Dis. 2021. Vol. 27, No. 5. P.1522–1524. doi: 10.3201/eid2705.210191
  30. Braun K.M., Moreno G.K., Halfmann P.J. et al. Transmission of SARS-CoV-2 in domestic cats imposes a narrow bottleneck // PLoS Pathog. 2021. Vol. 17, No. 2. P. e1009373. doi: 10.1371/journal.ppat.1009373
  31. Mustafa Z., Kalbacher H., Burster T. Occurrence of a novel cleavage site for cathepsin G adjacent to the polybasic sequence within the proteolytically sensitive activation loop of the SARS-CoV-2 Omicron variant: The amino acid substitution N679K and P681H of the spike protein // PLoS One. 2022. Vol. 17, No. 4. P. e0264723. doi: 10.1371/journal.pone.0264723

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Расположение амплифицируемых участков относительно участков вариабельности последовательности S гена коронавируса SARS-CoV-2 и относительно участков последовательности, кодирующих разные функциональные участки белка шипа. Гистограмма, иллюстрирующая вариабельность аминокислотной последовательности S-белка, получена с сайта Nextstrain.org [2], данные актуальны на 24.06.2022. По оси ординат — относительное значение вариабельности, по оси абсцисс — номера нуклеотидов в последовательности референсного штамма SARS-CoV-2 NC_045512. Дополнительно подписаны вариабельные аминокислотные остатки, характеризующие разные варианты вируса SARS-CoV-2. Расположение функциональных доменов белка шипа приведено по [16]. Обозначения: NTD (N-terminal domain) — N-концевой домен, RBD (receptor-binding domain) — рецепторсвязывающий домен, RBM (receptor-binding motif) — рецепторсвязывающий мотив, SD1/2 (subdomain 1, 2) — субдомен 1, 2, FP (fusion peptide) — пептид слияния, HR1 (heptad repeat 1) — гептадный повтор 1, CH (central helix) — центральная спираль, CD (connection domain) — связывающий домен, HR2 (heptad repeat 2) — гептадный повтор 2, TM (transmembrane domain) — трансмембранный домен, CT (cytoplasmic tail) — цитоплазматический хвост

Скачать (198KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Пирограммы, полученные путем пиросеквенирования генетического материала разных вариантов SARS-CoV-2 по протоколу с секвенирующим праймером F28. Слева указан подтип вируса в пробе, справа — последовательность участка (расшифровка пирограммы). ОКО — отрицательный контрольный образец, материал соскоба эпителиальных клеток человека, не содержащий генетического материала коронавируса

Скачать (429KB)
Метаданные
4. Рис. 1. Пирограммы, полученные путем пиросеквенирования генетического материала разных вариантов коронавирусов по протоколу с секвенирующим праймером F179: a — референсный штамм; b — альфа-вариант (Δ69-70); c — омикрон-вариант (A67V, Δ69-70); d — материал соскоба эпителиальных клеток человека. На каждом фрагменте рисунка сверху представлена форма распределения пиков, рассчитанная на основе генетической последовательности, внизу — полученные пирограммы

Скачать (221KB)
Метаданные
5. Рис. 2. Пирограммы, полученные путем пиросеквенирования генетического материала разных вариантов коронавирусов по протоколу с секвенирующим праймером F406: a — референсный штамм; b — альфа-вариант (Δ144); c — дельта-вариант (G142D); d — омикрон-вариант (G142D, Δ143-145); e — материал соскоба эпителиальных клеток человека. На каждом фрагменте рисунка сверху представлена форма распределения пиков, рассчитанная на основе генетической последовательности, внизу — полученные пирограммы

Скачать (307KB)
Метаданные
6. Рис. 3. Пирограммы, полученные путем пиросеквенирования генетического материала разных вариантов коронавирусов по протоколу с секвенирующим праймером F447: a — референсный штамм; b — бета-вариант (Δ156-157, R158G); c — омикрон-вариант; d — материал соскоба эпителиальных клеток человека. На каждом фрагменте рисунка сверху представлена форма распределения пиков, рассчитанная на основе генетической последовательности, внизу — полученные пирограммы

Скачать (243KB)
Метаданные
7. Рис. 4. Пирограммы, полученные путем пиросеквенирования генетического материала разных вариантов коронавирусов по протоколу с секвенирующим праймером R750: a — референсный штамм; b — бета-вариант (Δ242-244); c — омикрон-вариант; d — материал соскоба эпителиальных клеток человека. На каждом фрагменте рисунка сверху представлена форма распределения пиков, рассчитанная на основе генетической последовательности, внизу — полученные пирограммы

Скачать (269KB)
Метаданные
8. Рис. 5. Пирограммы, полученные путем пиросеквенирования генетического материала разных вариантов коронавирусов по протоколу с секвенирующим праймером F1231: a — референсный штамм; b — бета-вариант (K417N); c — гамма-вариант (K417T); d — омикрон-вариант (K417N); e — материал соскоба эпителиальных клеток человека. На каждом фрагменте рисунка сверху представлена форма распределения пиков, рассчитанная на основе генетической последовательности, внизу — полученные пирограммы. Наблюдается неспецифический отжиг праймера и неспецифические пики на пирограмме, необходима оптимизация исследования

Скачать (273KB)
Метаданные
9. Рис. 6. Пирограммы, полученные путем пиросеквенирования генетического материала разных вариантов коронавирусов по протоколу с секвенирующим праймером F1328: a — референсный штамм; b — дельта-вариант (L452R); c — омикрон-вариант; d — материал соскоба эпителиальных клеток человека. На каждом фрагменте рисунка сверху представлена форма распределения пиков, рассчитанная на основе генетической последовательности, внизу — полученные пирограммы

Скачать (222KB)
Метаданные
10. Рис. 7. Пирограммы, полученные путем пиросеквенирования генетического материала разных вариантов коронавирусов по протоколу с секвенирующим праймером F1410: a — референсный штамм; b — дельта-вариант (T478K); c — омикрон-вариант (S477N, T478K); d — материал соскоба эпителиальных клеток человека. На каждом фрагменте рисунка сверху представлена форма распределения пиков, рассчитанная на основе генетической последовательности, внизу — полученные пирограммы

Скачать (214KB)
Метаданные
11. Рис. 8. Пирограммы, полученные путем пиросеквенирования генетического материала разных вариантов коронавирусов по протоколу с секвенирующим праймером F1431: a — референсный штамм; b — гамма-вариант (E484K); c — дельта-вариант; d — омикрон-вариант (E484A); e — материал соскоба эпителиальных клеток человека. На каждом фрагменте рисунка сверху представлена форма распределения пиков, рассчитанная на основе генетической последовательности, внизу — полученные пирограммы

Скачать (282KB)
Метаданные
12. Рис. 9. Пирограммы, полученные путем пиросеквенирования генетического материала разных вариантов коронавирусов по протоколу с секвенирующим праймером R1986: a — референсный штамм; b — гамма-вариант (H655Y); c — омикрон-вариант (H655Y); d — материал соскоба эпителиальных клеток человека. На каждом фрагменте рисунка сверху представлена форма распределения пиков, рассчитанная на основе генетической последовательности, внизу — полученные пирограммы

Скачать (184KB)
Метаданные
13. Рис. 10. Пирограммы, полученные путем пиросеквенирования генетического материала разных вариантов коронавирусов по протоколу с секвенирующим праймером R2064: a — референсный штамм; b — альфа-вариант (P681H); c — дельта-вариант (P681R); d — материал соскоба эпителиальных клеток человека. На каждом фрагменте рисунка сверху представлена форма распределения пиков, рассчитанная на основе генетической последовательности, внизу — полученные пирограммы

Скачать (207KB)
Метаданные

© Эко-Вектор, 2022


СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 74760 от 29.12.2018 г.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах