Сравнительное иммуногистохимическое и морфометрическое исследование интерлейкина-17 в различных атеросклеротических поражениях у человека

Полный текст

Введение

Продуцирующие интерлейкин-17 (IL-17) T-хелперы (Тh17) — недавно открытая популяция лимфоцитов, играющая ключевую роль в развитии аутоиммунных заболеваний [1]. Многие исследователи обнаружили в сосудистой стенке IL-17A-продуцирующие клетки, накапливающиеся там в процессе развития атеросклероза [2, 3].

В настоящее время образование и развитие атеросклеротической бляшки связывают с экспрессией и активностью в сосудистой стенке провоспалительных маркеров [4]. Именно к таким маркерам и может относиться IL-17. Он обладает способностью активировать макрофаги, гладкомышечные и эндотелиальные клетки и ускорять образование атеросклеротической бляшки. Однако роль Th17-клеток и продуцируемого ими IL-17 в атерогенезе однозначно не определена [5].

В отдельных работах высказано предположение о возможной защитной роли IL-17 в патогенезе атеросклероза [6]. Например, в экспериментальной модели нокаут гена, кодирующего IL-17A (Il17a–/–), у мышей Apoe–/– приводит к увеличению продукции интерферона-гамма CD4⁺-T-клетками (популяция Т-лимфоцитов-хелперов) в селезенке, тем самым способствуя развитию атеросклеротических бляшек [7].

В то же время многие исследования демонстрируют проатерогенную роль IL-17A. Так, нейтрализация IL-17A нокаутированием гена у мышей ApoE–/– приводила к снижению экспрессии молекул клеточной адгезии VCAM-1, уменьшению инфильтрации иммунных клеток в сосудистую стенку, снижению секреции провоспалительных цитокинов и хемокинов (IL-6, фактор некроза опухоли, хемокин-связывающий рецептор-5), что существенно подавляло прогрессирование заболевания [8]. В то же время введение рекомбинантного IL-17A, напротив, усиливало развитие атеросклероза [6, 9].

В исследованиях на мышиных моделях X. Tang (2019) показал, что концентрация IL-17 в крови у группы животных с нормальной сосудистой стенкой значительно снижена по сравнению с группами, имеющими нестабильные и стабильные атеросклеротические поражения [4]. Одновременно концентрация IL-17 в крови у мышей с нестабильными бляшками была значительно выше, чем в группе со стабильными атеросклеротическими поражениями. На основе этих данных было сделано предположение о возможном влиянии IL-17 на развитие и дестабилизацию атеросклеротической бляшки.

В настоящее время большинство исследований, посвященных выяснению роли Th17-клеток и продуцируемому ими IL-17 в атерогенезе, выполнено на экспериментальных моделях.

Цель нашего иммуногистохимического и морфометрического исследования заключалась в установлении клеточной и тканевой локализации IL-17 в различных атеросклеротических поражениях артерий человека и на основании полученных данных формулировании гипотезы о возможной роли Th17-клеток в дестабилизации атеросклеротической бляшки.

Материал и методы

Объектом исследования стал материал 9 аутопсий, полученных от мужчин (средний возраст — 60 ± 8 лет), умерших от острой сердечно-сосудистой недостаточности атеросклеротической этиологии. Непременным условием для отбора материала являлось отсутствие тяжелых сопутствующих заболеваний, способных воздействовать на иммунологическую реактивность.

Исследованию были подвергнуты сегменты аорты (из района дуги, грудного и брюшного отделов), коронарные артерий и a. basilaris, всего 43 образца ткани.

Иссеченные кусочки фиксировали в 4 % забуференном параформальдегиде. Иммуноморфологическое и микроскопическое исследование проводили на парафиновых и криостатных срезах толщиной 4–6 мкм. На первом этапе работы с помощью традиционных гистологических методов и окраски препаратов Oil Red O верифицировали типы атеросклеротических поражений с целью отбора нестабильных, обладающих признаками прогрессирующего роста бляшек. Иммуногистохимическое исследование IL-17 в парафиновых срезах проводили по стандартной методике с использованием моноклональных антител к IL-17 (50 мкг/мл, R&D Systems) в сочетании с высокочувствительным двухступенчатым стрептавидин-биотиновым методом (R&D Systems, Cell & Tissue Staining Kit, HRP-DAB System).

Полученные препараты исследовали в световом микроскопе Leica DM 2500. Микрофотографии получали с использованием цифровой фотокамеры Leica DFC 420 и компьютерной программы Leica Application Suite Version 3.4.0.

Морфометрический анализ эндотелиальных и мононуклеарных клеток, экспрессирующих IL-17, осуществляли в следующих зонах сосудистой стенки: в интиме нормальных участков артерий, в зонах интимы под липидным пятном, в фиброзной покрышке нестабильных и стабильных бляшек, а также в участках адвентиции, подлежащих под соответствующими атеросклеротическими поражениями. В каждой изучаемой зоне численность клеток определяли в 10 полях зрения. Подсчеты производили без морфометрической сетки при увеличении ×600 под микроскопом Olympus CX41 (Япония). Статистический анализ полученных данных выполняли при помощи компьютерной программы Statistica Version 10. Значимость различий между изучаемыми выборками определяли с помощью t-критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Нами впервые был осуществлен иммуногистохимический и морфометрический анализ эндотелиальных и мононуклеарных клеток, экспрессирующих IL-17, в интиме и адвентиции артерий на разных стадиях формирования нестабильных атеросклеротических поражений (рис. 1). Известно, что при атеросклерозе IL-17 активирует эндотелиальные клетки интимы, способствует воспалению, апоптозу, коагуляции и тромбозу. Однако наши исследования показали, что клетки эндотелия в интиме сосудистой стенки сами способны активно секретировать IL-17 при формировании атеросклеротической бляшки (рис. 1, b). При этом часто наблюдается адгезия мононуклеарных клеток — моноцитов и лимфоцитов, также экспрессирующих IL-17, на эндотелиальных клетках, выстилающих поверхность нестабильной атеросклеротической бляшки (рис. 1, а). Это может свидетельствовать об активном проникновении иммуновоспалительных Th17-клеток в интиму артерий при формировании нестабильных поражений. По мере прогрессирования процесса в выраженных нестабильных атеросклеротических бляшках, и прежде всего в районах максимальной деструкции их интимы и разрыва их покрышки, накапливаются многочисленные мононуклеарные клетки, экспрессирующие IL-17 (рис. 1, c). В то же время в интиме нормальных участков артерий и в стабильных атеросклеротических поражениях клетки, экспрессирующие IL-17, либо выявлены в незначительном количестве, либо отсутствовали совсем (рис. 1, d).

 

Рис. 1. Экспрессия интерлейкина-17 (IL-17) в атеросклеротических поражениях аорты человека. Иммуногистохимическое окрашивание с использованием моноклональных антител к IL-17: а — адгезия мононуклеарных клеток, экспрессирующих IL-17 (стрелка) на эндотелии интимы нестабильной бляшки в коронарной артерии; b — экспрессия IL-17 в цитоплазме эндотелиальных клеток (стрелки), покрывающих молодую липидно-фиброзную бляшку в аорте; c — мононуклеарные клетки, экспрессирующие IL-17 (стрелки), в районе разрыва покрышки нестабильной атеросклеротической бляшки; d — отсутствие IL-17 в интиме стабильной атеросклеротической бляшки. а, b — ×630, c, d — ×350

Fig. 1. Expression of IL-17 in atherosclerotic damages of an aorta of human. Immunohistochemical staining with use of monoclonal antibodies to IL-17: а — adhesion of the mononuclear cells expressing IL-17 (arrow) on an endothelium of an intima of an unstable plaque in a coronary artery; b — IL-17 expression in cytoplasm of the endothelial cells (arrows) covering a young lipide-fibrous plaque in an aorta; c — the mononuclear cells expressing IL-17 (arrows) around a rupture of a cap of an unstable atherosclerotic plaque; d — lack of IL-17 in an intima of a stable atherosclerotic plaque. а, b — ×630, c, d — ×350

 

При сравнительном морфометрическом анализе этих же артерий человека максимальное число эндотелиальных клеток, экспрессирующих IL-17, было выявлено на начальной стадии поражения. Так, их количество в липидном пятне оказалось выше в 1,8 раза по сравнению с нормой, в 1,5 раза по сравнению со стабильной бляшкой. Число эндотелиальных клеток, экспрессирующих IL-17, также возрастает в нестабильной атеросклеротической бляшке — в 1,7 раза по сравнению с нормой и в 1,3 раза по сравнению со стабильным поражением (рис. 2).

 

Рис. 2. Содержание эндотелиальных и мононуклеарных клеток в интиме артерий, экспрессирующих интерлейкин-17, в норме и в различных типах атеросклеротических поражений интимы артерий. По оси ординат обозначено количественное содержание клеток с интерлейкином-17 в десяти полях зрения микроскопа

Fig. 2. The quantitative maintenance of endothelial and mononuclear cells expressing IL-17 in normal also in various types of atherosclerotic lesions of an intima of arteries. On an axis of ordinates the quantitative maintenance of cells with IL-17 in 10 fields of microscope is designated

 

Одновременно с эндотелиальными клетками существенно увеличено количество мононуклеарных клеток, экспрессирующих IL-17, в интиме липидного пятна и в нестабильной атеросклеротической бляшке — в 2,6 раза (p < 0,05) по сравнению с нормальными участками сосудистой стенки. В интиме стабильного атеросклеротического поражения, напротив, количество мононуклеаров с IL-17 снижено в 1,9 раза по сравнению с липидным пятном и нестабильной бляшкой (см. рис. 2).

Таким образом, при иммуногистохимическом и морфометрическом исследовании было показано, что эндотелиальные клетки интимы способны секретировать IL-17 во всех типах атеросклеротических поражений. Одновременно было выявлено увеличение числа мононуклеарных клеток, экспрессирующих IL-17, в интиме артерий. Максимальное число клеток, экспрессирующих IL-17, наблюдалось в интиме нестабильной атеросклеротической бляшки, особенно часто в районе разрыва ее покрышки, что может свидетельствовать о провоспалительном действии Th17-клеток и секретируемого ими IL-17 и о существенном влиянии их на формирование нестабильных атеросклеротических поражений. Интерлейкин-17 можно отнести к семейству провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкины-6, -18, интерферон-гамма и фактор некроза опухоли, которые оказывают выраженное проатерогенное действие [10].

Важно, что полученные результаты полностью коррелируют с данными X. Tang (2019), который продемонстрировал исключительную роль Th17-клеток и продуцируемого ими сывороточного IL-17 в формировании нестабильных атеросклеротических поражений [4]. Однако все его исследования выполнены на экспериментальных мышиных моделях, в то время как нам впервые удалось выявить возможную роль IL-17 в дестабилизации атеросклеротической бляшки у человека.

Заключение

С помощью гистологических, иммуногистохимических и морфометрических методов исследования удалось установить, что эндотелиальные клетки интимы способны секретировать IL-17 во всех типах атеросклеротических поражений. Одновременно было выявлено увеличение числа мононуклеарных клеток, экспрессирующих IL-17, в интиме артерий. Показано, что максимальное число клеток, экспрессирующих IL-17, обнаружено в интиме нестабильной атеросклеротической бляшки, особенно в районе разрыва ее покрышки, что может свидетельствовать о провоспалительном действии Th17-клеток, секретируемого ими IL-17 и их роли в образовании нестабильных атеросклеротических поражений. Сформулирована гипотеза о возможной роли Th17-клеток в дестабилизации атеросклеротической бляшки у человека.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Список сокращений

IL-17 — интерлейкин-17; Тh17 — T-хелперы, продуцирующие интерлейкин-17.

Об авторах

Петр Валерьевич Пигаревский

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»

Автор, ответственный за переписку.
Email: pigarevsky@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5906-6771
SPIN-код: 8636-4271

д-р биол. наук, заведующий отделом общей и частной морфологии

Россия, Санкт-Петербург

Влада Андреевна Снегова

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»

Email: biolaber@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0002-9925-2886
SPIN-код: 8088-4446
Scopus Author ID: 55822129200

старший научный сотрудник отдела общей и частной морфологии

Россия, Санкт-Петербург

Светлана Владимировна Мальцева

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»

Email: pigarevsky@mail.ru
SPIN-код: 8367-9096

канд. биол. наук, старший научный сотрудник отдела общей и частной морфологии

Россия, Санкт-Петербург

Наталья Геннадиевна Давыдова

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»

Email: pigarevsky@mail.ru
SPIN-код: 4761-3575

канд. мед. наук, старший научный сотрудник отдела общей и частной морфологии

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы