Изменение экспрессии DNMT1 как маркер нарушения эпигенетической регуляции у пациентов с рассеянным склерозом

Полный текст

Список сокращений

DNMTs — ДНК-метилтрансферазы; РС — рассеянный склероз; MTHFR — метилентетрагидрофолатредуктаза; MTR — метионин синтаза; MTRR — метионин синтаза-редуктаза; ПЦР — полимеразная цепная реакция; MS-HRM (Methyl-sensitive High-Resolution Melting) — метил-чувствительный анализ кривых плавления с высоким разрешением; EDSS (Expanded Disability Status Scale) — расширенная шкала оценки степени инвалидизации.

Обоснование

Нарушение эпигенетической регуляции является важным звеном патогенеза мультифакториальных заболеваний, опосредуя взаимодействие факторов внешней среды и факторов генетической предрасположенности [1, 2]. Метилирование ДНК — процесс, осуществляемый посредством передачи метильной группы от универсального метильного донора S-аденозинметионина на цитозин, входящий в состав CpG-динуклеотидов, — первый из открытых и наиболее изученный механизм эпигенетического контроля [3]. Эта реакция осуществляется ферментами семейства ДНК-метилтрансфераз (DNMTs) [4, 5]. Продукт гена DNMT1 обеспечивает стабильность паттернов метилирования в процессе клеточного деления, обладая сродством преимущественно к полуметилированной ДНК. Метилтрансферазы DNMT3a и DNMT3b осуществляют метилирование de novo и экспрессируются в основном в недифференцированных эмбриональных клетках [6].

Изменения активности метилтрансфераз обнаруживаются при различных патологических процессах — при опухолевом росте, нейродегенеративных заболеваниях, аутоиммунной патологии. Для многих типов злокачественных новообразований показана связь между подавлением продукции генов — онкосупрессоров и гиперэкспрессией DNMTs на транскрипционном и трансляционном уровнях [7–9]. Изменение активности ДНК-метилтрансфераз, а также изменения уровня общегеномного метилирования в сочетании с активацией/инактивацией специфических генов, участвующих в патогенезе, показаны и для ряда заболеваний ЦНС. В частности, снижение экспрессии DNMT1 у пациентов с болезнью Альцгеймера коррелирует с повышением продукции пресинилина, при болезни Паркинсона выявлена связь дизрегуляции экспрессии α-синуклеина, транслокации DNMT1 и гиперпродукции генов, вовлеченных в ее патогенез [10–12]. Продемонстрирована связь между формированием патологических белковых агрегатов, сниженной экспрессией гена FUS и гиперэкспрессией DNMT1 у пациентов с одним из вариантов семейной формы бокового амиотрофического склероза [13].

Рассеянный склероз (РС) — прогрессирующее демиелинизирующее заболевание аутоиммунной природы, для которого характерно хроническое течение с нарастанием неврологического дефицита [14]. Согласно опубликованным данным, при РС обнаруживаются значительные изменения профилей метилирования ДНК, в том числе гипометилирование промоторов генов, связанных с контролем миелинизации, дифференцировки Т-лимфоцитов, воспалительных реакций (PAD2, FOXP3, IL-17A) [15–18]. Поскольку у больных рассеянным склерозом наблюдается значительное снижение экспрессии мРНК DNMT1 [19], логично предположить, что именно подавление активности DNMT1 способствует формированию аберрантных паттернов метилирования и дизрегуляции экспрессии генов. В этой связи вызывает интерес сопоставление уровней экспрессии гена DNMT1 у пациентов в стадии дебюта РС и при продолжительном течении заболевания. Представлялось целесообразным также определить, коррелирует ли подавление экспрессии DNMT1 с изменением степени метилирования промоторной области гена, или же это снижение обусловлено другими механизмами. Известно, в частности, что регуляция процессов метилирования тесно связана с функционированием фолатного цикла и активностью ферментов, контролирующих обмен гомоцистеина и метионина и образование метильных доноров [20, 21]. Избыточному накоплению гомоцистеина вследствие его замедленного превращения в метионин сопутствует снижение продукции S-аденозинметионина, возникновение дефицита метильных групп и снижение соотношения S-аденозинметионин/S-аденозингомоцистеин [22]. S-Аденозингомоцистеин, образующийся как побочный продукт в реакции метилирования, является конкурентным ингибитором DNMTs [23]. В свою очередь, на особенности обмена фолатов и, соответственно, на метаболизм гомоцистеина могут оказывать влияние как недостаточное поступление микронутриентов, в особенности витаминов группы В, являющихся коферментами цикла фолиевой кислоты, так и генетически обусловленное снижение активности ключевых генов фолатного цикла — метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR), метионин синтазы (MTR) и метионин синтазы-редуктазы (MTRR).

Целью представленного исследования была оценка уровня экспрессии мРНК DNMT1, степени метилирования промотора DNMT1 у пациентов с РС с разной продолжительностью заболевания и выявление взаимосвязи между активностью гена DNMT1 и наличием полиморфизмов генов фолатного цикла.

Материалы и методы

Для выполнения исследования была создана выборка из 98 пациентов с подтвержденным согласно критериям Макдональда [24] диагнозом РС, а также сформирована контрольная группа, в которую вошли 32 здоровых добровольца без неврологической патологии (табл. 1). Пациенты, включенные в исследование, находились на амбулаторном наблюдении в клинике ФГБНУ «ИЭМ» и ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова». Образцы венозной крови для проведения молекулярно-биологических исследований получали от пациентов и здоровых добровольцев после подписания добровольного информированного согласия.

 

Таблица 1. Демографические характеристики контрольной группы и пациентов с рассеянным склерозом. Данные представлены в виде: медиана [1-й квартиль; 3-й квартиль]

Table 1. Demographic characteristics of controls subjects and multiple sclerosis patients. Data are presented as: median [1rd quartile; 3rd quartile]

Показатель	Контрольная группа, n = 32	Пациенты с рассеянным склерозом, n = 99
Пол (Ж : М)	24 : 8	71 : 28
Возраст, лет	37,0 [31, 5; 47, 0]	40,0 [32, 0; 48, 0]
Возраст дебюта рассеянного склероза, лет	–	31,0 [24, 0; 37, 0]
Балл по шкале EDSS	–	3,8 [2, 0; 5, 1]

Примечание: EDSS (Expanded Disability Status Scale) — расширенная шкала оценки степени инвалидизации.

 

Генетическое тестирование для выявления полиморфизмов генов фолатного цикла — MTHFR, MTR и MTRR было выполнено для всех участников. Исследование экспрессии DNMT1 выполнено на 30 образцах, отобранных из общей выборки.

Генотипирование по полиморфизмам C677T и A1298C гена MTHFR, A2756G гена MTR и A66G гена MTRR

Для проведения молекулярно-биологических и генетических исследований использовали образцы венозной крови, взятой в вакуумные пробирки с антикоагулянтом (ЭДТА). Тотальную ядерную ДНК для генотипирования выделяли из цельной крови по стандартной методике с применением набора реагентов ДНК-сорб Б (ООО «Некст-Био», Санкт-Петербург). Генотипы по полиморфизмам C677T и А1298С гена MTHFR (SNP rs1801133 и rs1801131), A2756G гена MTR (SNP rs1805087) и A66G гена MTRR (SNP rs1801394) определяли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием специфических олигонуклеотидных праймеров и аллель-специфических LNA-модифицированных флуоресцентных зондов. Использовали праймеры и зонды, синтезированные ООО «ДНК-Синтез».

Анализ уровня экспрессии и оценка метилирования промотора гена DNMT1

Для анализа экспрессии DNMT1 была сформирована группа из числа общей выборки, состоящая из 10 пациентов с диагнозом РС и длительностью заболевания более 1 года, 10 пациентов в стадии дебюта РС (длительность заболевания не более полугода) и 10 здоровых добровольцев соответствующего возраста.

Оценку уровней экспрессии мРНК и степени метилирования промоторной области гена DNMT1 проводили с использованием мононуклеарных клеток периферической крови, которые выделяли методом градиентного центрифугирования с использованием набора реагентов Проба-Фиколл (OOO «ДНК-Технология», Россия) согласно инструкции производителя.

Экстракция мРНК и оценка уровня экспрессии гена DNMT1

Тотальную мРНК выделяли из периферических мононуклеарных клеток крови с использованием реагента Extract-RNA (ЗАО «Евроген», Россия). Уровень экспрессии мРНК гена DNMT1 оценивали методом обратной транскрипции с последующей ПЦР с использованием специфических олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов Taqman и регистрацией результатов в режиме реального времени. Относительный уровень экспрессии DNMT1 рассчитывали по методу ΔΔCt относительно уровня экспрессии гена β-глюкуронидазы (Glucuronidase beta, GUSB), стабильность уровня экспрессии которого и валидность использования в качестве внутреннего контроля при исследовании экспрессии генов в периферических мононуклеарных клетках крови человека показана ранее [25].

Экстракция геномной ДНК и определение степени метилирования промоторной области гена DNMT1

Для экстракции геномной ДНК из образцов периферических мононуклеарных клеток использовали комплект реагентов Проба ГС-генетика (OOO «ДНК-Технология») в соответствии с инструкцией производителя. Количественную и качественную оценку получаемых образцов геномной ДНК осуществляли с помощью спектрофотометрического измерения концентрации на длине волны 260 нм на приборе NanoDrop LITE (ThermoFisher Scientific, США) в соответствии с инструкцией производителя. Отношение поглощения на длинах волн 260 и 280 нм (A260/280) использовали для оценки чистоты препарата.

Полученные образцы ДНК подвергали бисульфитной конверсии с использованием набора реагентов BisQuick (ЗАО «Евроген», Москва) для превращения неметилированных цитозинов в урацил. Из каждого образца на бисульфитную конверсию было взято не менее 100 нг ДНК. Все образцы (включая образцы метилированной и неметилированной контрольной ДНК, алгоритм изготовления которых описан ниже) обрабатывали одновременно, чтобы избежать возможных эффектов партии.

Эффективность бисульфитной конверсии оценивали с использованием искусственного образца полностью неметилированной ДНК человека. В качестве образца полностью неметилированной ДНК был использован амплифицированный ПЦР-продукт, включающий исследуемый участок в промоторной области гена DNMT1, протяженностью 638 пн. Для амплификации использовали праймеры: прямой (638_F): 5՛-GGGAATCCACGGTCCATTT-3՛, и обратный (638_R): 5՛-GGGCTTCTCGCTGCTTTAT-3՛.

Оценка метилирования промоторной области гена DNMT1

Для определения степени метилирования промотора DNMT1 использовали метод флуоресцентной ПЦР с последующим метил-чувствительным анализом кривых плавления с высоким разрешением (Methyl-sensitive High-Resolution Melting, MS-HRM). Технология анализа кривых плавления с высоким разрешением, первоначально разработанная для генотипирования, впоследствии была адаптирована для оценки сайт-специфического метилирования. Данные, получаемые при количественной оценке метилирования с использованием MS-HRM анализа, сопоставимы с результатами пиросеквенирования, что доказывает валидность метода [26].

Для выбора участков промоторной области гена DNMT1 с высоким содержанием CpG-динуклеотидов и подбора специфических праймеров использовали ресурс https://www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_cpgplot/. При подборе праймеров для оценки степени метилирования с использованием метода HRM-анализа учитывали рекомендации, позволяющие избежать ошибок, связанных с преимущественной амплификацией неметилированной и/или не полностью конвертированной ДНК [27, 28]. Также учитывали изменения, происходящие при бисульфитной конверсии в соответствии с критериями, описанными в руководстве, доступном по ссылке: https://zymoresearch.eu/pages/bisulfite-beginner-guide. Были подобраны два варианта независимых от метилирования праймеров, а также использованы праймеры, предложенные F. Coppedè и соавт. [29] для анализа уровня метилирования промоторной области гена DNMT1. Последовательности праймеров приведены в табл. 2, положение праймеров на последовательности схематически изображено на рис. 1.

 

Таблица 2. Последовательности олигонуклеотидных праймеров для конвертированной бисульфитом ДНК, использованные для анализа уровня метилирования промоторной области гена DNMT1 методом MS-HRM

Table 2. The sequences of oligonucleotide primers for bisulfite-converted DNA used to analyze the level of methylation of the DNMT1 promoter region using the MS-HRM method

Последовательность 5´–3´	Длина фрагмента	CpG сайты (n)	Регион относительно TSS	Позиции на хромосоме
DNMT1_F GCGTTTTGTTTGTTTTTT	106	9	47–151	10194773–10194878 NC_000019.10
DNMT1_R CCCAAATACCCACACTAA
DNMT1_F2 ACGGTTAGTGTGGGTATT	155	21	–87–67	10194857–10195012 NC_000019.10
DNMT1_R2 CCAAACTAAAATAATAAA
DNMT1_F3 GGTATCGTGTTTATTTTTTAGTAA	114	9	–263÷–149	10195084–10195187 NC_000019.10
DNMT1_R3 ACGAAACCAACCATACCCAA

 

Рис. 1. Схематическое изображение промоторной области DNMT1 и положение праймеров, использованных для амплификации участков промотора. Поперечные линии показывают положение CpG-динуклеотидов (двойные линии соответствуют участкам CGCG). Цифрами обозначены позиции на хромосоме для размещенной в банке данных NCBI последовательности NC_000019.10

Fig. 1. Schematic representation of the DNMT1 promoter region and the positions of the primers used to amplify the promoter region. Cross lines indicate the position of CpG dinucleotides (double lines correspond to CGCG regions). The numbers indicate positions on the chromosome for the sequence NC_000019.10 located in the NCBI

 

Амплификацию участков промоторной области DNMT1 проводили с использованием платформы Roche LightCycler 96 (Roche AppliedScience, Laval, PQ, Канада). Для ПЦР и последующего анализа кривых плавления использовали ранее описанный протокол [30]. Параметры протокола для всех постановок были следующие: 1 цикл 95 °С в течение 12 мин, 60 циклов 95 °С в течение 30 с, 63 °С в течение 30 с и 72 °С в течение 45 с; с последующим шагом HRM 95 °С в течение 10 с и 50 °С в течение 1 мин, 65 °С в течение 15 с и непрерывным измерением до 95 °С с одним измерением на 0,2 °С. ПЦР проводили в конечном объеме 50 мкл с использованием hot-start TaqM полимеразы (OOO «АлкорБио»), 20 пмоль каждого праймера и 10 нг модифицированной бисульфитом матрицы ДНК. Все реакции проводили в трехкратной повторности.

В качестве калибраторов использовали образцы с заданным процентом метилирования, изготовленные из 100 % метилированной и неметилированной контрольной ДНК человека в соответствующих соотношениях. Полностью метилированную ДНК получали в реакции с использованием фермента CpG-метилазы M.SSI (ООО «СибЭнзим») из геномной ДНК клеточной линии человека Raji (ЗАО «Евроген»). В качестве образца полностью неметилированной ДНК использовали амплифицированный ПЦР-продукт, соответствующий исследуемому участку промотора DNMT1.

Контрольные образцы ДНК подвергали бисульфитной конверсии (одновременно с исследуемыми образцами) и проводили процедуру нормализации эффективной концентрации ДНК с помощью предварительной ПЦР таким образом, чтобы разница пороговых циклов Ct для метилированной и неметилированной ДНК не превышала двух циклов. После этой процедуры готовили стандартные образцы (калибраторы) с заданным процентом метилирования — от 0 до 100 %. Калибраторы включали в каждую постановку и использовали полученные для них значения для построения стандартных кривых и определения уровня метилирования для каждого из исследуемых образцов.

Постобработка данных MS-HRM

Выбор метода постобработки данных MS-HRM осуществляли на основании анализа литературных источников. Метод расчета, основанный на вычислении величины AUC (Area Under Curve — площадь под кривой), являющейся производной кривой HRM, и на сравнении показателей AUC для калибраторов с известным уровнем метилирования и уровнем метилирования исследуемых образцов, был выбран как соответствующий задачам исследования [31].

Нормализацию кривых плавления проводили с использованием программного обеспечения Roche LightCycler 96. Графики различий (Difference Plot) строили для каждой нормализованной кривой плавления относительно кривой плавления, выбранной в качестве базовой линии (Baseline sample) и соответствующей графику для 100 % метилированного контрольного образца. При выборе более одного образца для базовой линии данные этих кривых были усреднены, и полученные показатели использовали в качестве опорных значений для вычитания. После нормализации на графике различий каждая кривая отображалась в том виде, в котором она появляется при вычитании значения AUC для базовой линии.

Полученные графики различий для калибраторов и исследуемых образцов импортировали в Excel (Microsoft Office 2021) в виде текстового файла, содержащего данные измерений флуоресцентного сигнала от каждой точки по градиенту температуры. Дальнейший расчет проводили с использованием протокола, предложенного в работе [31] и доступного по ссылке https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.n2bvj6yjxlk5/v1.

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ Statistica 10.0. Частоты аллелей и генотипов по исследуемым полиморфным вариантам определяли прямым подсчетом и проводили сравнение между группами с использованием метода χ² и точного критерия Фишера (для групп численностью менее 5). Коэффициент корреляции Пирсена рассчитывали для анализа взаимосвязи между уровнем экспрессии мРНК DNMT1 и содержанием гомоцистеина в крови. Однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) применяли для обнаружения различий в уровне мРНК DNMT1 между исследованными группами и определения влияния генотипов по исследованным полиморфизмам на экспрессию DNMT1. Для выявления сочетанного влияния нескольких независимых факторов применяли многофакторный дисперсионный анализ. Для оценки адекватности применения статистических критериев данные проверяли на соответствие закону нормального распределения с использованием критерия Колмогорова – Смирнова.

Результаты

Анализ уровня экспрессии мРНК DNMT1 выявил достоверные различия между экспериментальными группами (ANOVA, F = 17,5935, p = 0,0003) (рис. 2). По данным апостериорного анализа достоверное снижение уровня мРНК DNMT1 по сравнению с группой контроля было выявлено как у пациентов в дебюте РС (р = 0,001), так и у пациентов с продолжительным течением заболевания (р = 0,013).

 

Рис. 2. Изменение уровня экспрессии мРНК DNMT1 в периферических мононуклеарных клетках крови у пациентов с рассеянным склерозом (РС). Данные представлены в виде средних и ошибки среднего; * достоверные различия между группами по результатам апостериорного анализа, р < 0,05 (критерий Тьюки для неравных выборок)

Fig. 2. The changes in the DNMT1 mRNA expression level in peripheral blood mononuclear cells in patients with multiple sclerosis (MS). Data are presented as means and the error of the mean; * significant differences between groups according to the results of post-hoc analysis, p < 0.05 (Tukey’s test for unequal samples)

 

Полученные данные согласуются с данными ранее опубликованного исследования, в котором продемонстрировано 2-кратное снижение уровня экспрессии мРНК DNMT1 в периферических мононуклеарных клетках крови пациентов с РС [19]. Кроме того, в проведенном нами исследовании выявлено, что значимое подавление экспрессии DNMT1 отмечается уже на стадии дебюта заболевания.

Оценка степени метилирования промоторной области гена DNMT1 не выявила достоверных различий между образцами, полученными от здоровых участников исследования (контроль), и образцами от пациентов с РС. При количественном расчете процента метилирования для образцов из группы контроля были получены значения от 0 до 2 %, для образцов пациентов с РС — от 0 до 3,5 %. Однако наблюдалась тенденция к увеличению процента метилирования у пациентов с РС по сравнению со здоровыми участниками (медиана 1,94 против 1,20). На рис. 3 изображены кривые плавления для калибровочных образцов в диапазоне от 0 до 100 %, образца из клеток опухолевой линии HeLa с метилированием около 5 % (использованного в качестве стандарта с неизвестным процентом метилирования) и одного из исследуемых образцов.

 

Рис. 3. Нормализованные кривые плавления для амплифицированных фрагментов промотора DNMT1. Синие линии соответствуют кривым плавления для калибровочных образцов с известным процентом метилирования; зеленая линия — кривая плавления для образца, полученного из опухолевой клеточной линии HeLa (рассчитанный процент метилирования 5,5 %); оранжевая линия — кривая плавления образца, полученного из мононуклеарных клеток периферической крови пациента с рассеянным склерозом (рассчитанный процент метилирования 1,15 %)

Fig. 3. Normalized melting curves for amplified DNMT1 promoter fragments. Blue lines correspond to melting curves for calibration samples with known percentage of methylation; green line — melting curve for a sample obtained from the HeLa tumor cell line (calculated percentage of methylation 5.5%); orange line — sample obtained from peripheral blood mononuclear cells of a patient with multiple sclerosis (calculated percentage of methylation 1.15%)

 

При проведении корреляционного анализа выявлено наличие достоверной сильной положительной взаимосвязи между уровнем экспрессии мРНК DNMT1 и содержанием гомоцистеина в сыворотке крови у пациентов с длительностью заболевания более 1 года (табл. 3). У пациентов в стадии дебюта РС и у здоровых добровольцев контрольной группы корреляции между этими показателями обнаружено не было. В группе пациентов с длительностью заболевания более 1 года продолжительность заболевания составила от 4 до 15 лет (медиана и межквартильный размах 9 [7; 12]). Необходимо отметить, что корреляции уровня экспрессии мРНК DNMT1 с длительностью заболевания у пациентов этой группы не зафиксировано (r = –0,034; p = 0,931). Обнаруженные закономерности могут отражать взаимосвязь нарушений регуляции процессов метилирования и изменений в функционировании метаболизма фолиевой кислоты и цикла метионин – гомоцистеин при развитии заболевания.

 

Таблица 3. Данные корреляционного анализа для оценки взаимосвязи между уровнем относительной экспрессии мРНК DNMT1 и содержанием гомоцистеина в крови

Table 3. The data of correlation analysis to assess the relationship between the level of relative expression of DNMT1 mRNA and the content of homocysteine in the blood

Группа	Гомоцистеин / мРНК DNMT1
Контрольная группа (n = 10)	r = 0,294; p = 0,442
Рассеянный склероз, дебют (n = 10)	r = 0,388; p = 0,268
Рассеянный склероз (n = 10)	r = 0,733; p = 0,025

Примечание: r — коэффициент корреляции Пирсена; p — значение для 95 % уровня значимости.

 

Для выявления возможного вклада полиморфных вариантов генов фолатного цикла в механизмы эпигенетических нарушений при РС был проведен анализ влияния генотипов по полиморфизмам генов MTHFR, MTR и MTRR на уровень экспрессии DNMT1. Ни для одного из 4 исследованных полиморфных вариантов (C677T, А1298С, A2756G, A66G) не было установлено изолированного влияния генотипа на экспрессию DNMT1. Однако было обнаружено сочетанное влияние генотипов по полиморфизмам A2756G гена MTR и C677T гена MTHFR на уровень экспрессии мРНК DNMT1 (ANOVA, F = 4,516; p = 0,044) (рис. 4). Попарные сравнения при проведении апостериорного анализа продемонстрировали наличие достоверных различий в уровне экспрессии мРНК DNMT1 между участниками с генотипами CC_C677T/AA_A2756G и CC_C677T/AG,GG_A2756G (p = 0,017, критерий Фишера), при этом для сочетания генотипов CC_C677T/AA_A2756G были характерны наиболее низкие значения экспрессии DNMT1.

 

Рис. 4. Сочетанное влияние генотипов по полиморфизмам C677T гена MTHFR и A2756G гена MTR на уровень экспрессии DNMT1 у участников контрольной группы и пациентов с рассеянным склерозом

Fig. 4. The combined effect of genotypes for polymorphisms C677T of the MTHFR gene and A2756G of the MTR gene on the level of DNMT1 expression in control group subjects and patients with multiple sclerosis

 

При сравнении распределения генотипов по этим полиморфным вариантам в контрольной группе и в группе пациентов с РС (независимо от длительности заболевания) также были выявлены достоверные различия (χ² = 10,73; р = 0,014). Оказалось, что среди пациентов с РС комбинация генотипов CC_C677T/AG,GG_A2756G встречается достоверно реже, чем в группе контроля (15 и 35 % соответственно). То есть доля сочетаний полиморфных вариантов, при которых отмечались наиболее высокие значения относительной экспрессии DNMT1, была снижена у пациентов с РС. Кроме того, в группе пациентов с РС частота аллеля А по полиморфизму A2756G гена MTR была достоверно выше, чем в контрольной группе (χ² = 4,655; р = 0,031).

Выявленные закономерности указывают на то, что риск развития нарушений, связанных со снижением экспрессии DNMT1, может определяться, по крайней мере частично, генотипом по полиморфизмам A2756G гена MTR и C677T гена MTHFR.

Обсуждение

РС — наиболее распространенное из группы демиелинизирующих заболеваний. При полногеномном анализе у пациентов с РС выявлены значительные отличия профилей метилирования ДНК по сравнению со здоровыми людьми [32]. Эти отличия затрагивают большой спектр генов, участвующих в регуляции активности иммунных клеток, в процессах созревания и дифференцировки олигодендроцитов, в формировании структуры миелина [33–35]. Важным для понимания механизмов эпигенетических нарушений при РС является обнаружение сниженной экспрессии (как на уровне мРНК, так и на уровне белков) DNMT1 и TET2, ферментов, контролирующих метилирование и деметилирование ДНК. Двукратное снижение экспрессии мРНК DNMT1 в периферических мононуклеарных клетках пациентов с РС продемонстрировано в одном опубликованном исследовании [19]. Полученные нами данные согласуются с опубликованными ранее и кроме того демонстрируют, что изменения экспрессии DNMT1 характерны в том числе для пациентов в стадии дебюта РС.

Направленное влияние на активность метилтрансфераз с применением деметилирующих препаратов обсуждается в литературе как один из возможных новых подходов к терапии РС и других нейродегенеративных заболеваний [36, 37]. В связи с обнаружением эпигенетических изменений, специфических для патогенеза ряда нейродегенеративных заболеваний, исследуются и возможности точечного редактирования паттернов метилирования [38]. В качестве альтернативного и, возможно, более безопасного способа может рассматриваться модификация фолатного обмена, непосредственно связанного с регуляцией процессов метилирования. Фолатный цикл и цикл метионин – гомоцистеин — сопряженные метаболические пути, обеспечивающие образование одноуглеродных фрагментов (метильных групп), необходимых для синтеза ДНК, аминокислот, реакций метилирования [21]. Данные экспериментальных исследований демонстрируют, что искусственно создаваемый дефицит нутриентов, прежде всего, витаминов группы В, приводит к накоплению гомоцистеина, снижению скорости его трансформации в метионин, дефициту S-аденозинметионина и изменению активности ДНК-метилтранфераз [39, 40]. Показано также, что наличие полиморфизмов в генах, кодирующих метионинсинтазу (MTR) и метилентетрагидрофолатредуктазу (MTHFR), связано с глобальными, либо с ген-специфическими изменениями метилирования ДНК [41, 42]. Согласно данным выполненного на группе здоровых людей исследования, наличие полиморфизмов в ключевых генах фолатного цикла может влиять на степень метилирования промоторной области гена DNMT1 в периферических мононуклеарных клетках крови [29]. В частности, в этой работе было показано увеличение уровня метилирования промотора DNMT1 у носителей минорной аллели G по полиморфизму A2756G гена MTR (rs1805087).

В представленном нами исследовании не выявлено изолированного влияния полиморфных вариантов генов фолатного цикла на уровень экспрессии DNMT1, однако показано наличие сочетанного действия генотипов по полиморфизмам C677T гена MTHFR и A2756G гена MTR. При сочетании генотипов CC_C677T/AG, GG_A2756G значения экспрессии DNMT1 были наиболее высокими. Эти данные согласуются с данными литературы, показывающими, что аллель Т полиморфизма C677T сопряжена с гипометилированием ДНК, а аллель G варианта A2756G гена MTR — с гиперметилированием [41]. Интересно отметить также, что наличие кумулятивного действия полиморфных вариантов генов фолатного цикла ранее уже было показано [43]. Для дальнейших исследований представляет интерес проверка предположения о том, что сочетание генотипов CC_C677T/AA_A2756G, при котором наблюдается наибольшее снижение уровня экспрессии DNMT1, будет сопряжено с большим риском развития и/или прогрессирования заболевания.

Известно, что оба полиморфных варианта — C677T и A2756G — связаны с увеличением риска развития гипергомоцистеинемии. Замена С-T (C677T гена MTHFR) приводит к образованию термолабильной формы фермента, к снижению его активности до 70 % у носителей генотипа СТ и до 30 % от исходного уровня у носителей генотипа ТТ, что снижает эффективность образования активной формы фолиевой кислоты — 5-метилтетрагидрофолата — кофермента в реакции реметилирования гомоцистеина [44]. Полиморфизм A2756G нарушает функции и стабильность кодируемой геном MTR метионинсинтазы — фермента, катализирующего реметилирование Hcy в метионин [45]. Выявленная в представленном исследовании и обнаруживаемая только у пациентов с РС с большой длительностью заболевания корреляционная взаимосвязь между экспрессией DNMT1 и содержанием маркера фолатного обмена — гомоцистеина — подтверждает, что нарушения обмена фолиевой кислоты вносят вклад в дизрегуляцию эпигенетических процессов при РС. Интересно отметить, что ранее на когорте здоровых добровольцев была показана слабая достоверная обратная корреляционная зависимость между уровнем метилирования промотора DNMT1 и содержанием гомоцистеина [29]. Поскольку нарушения обмена фолатов потенциально обратимы, изучение взаимосвязи эпигенетических перестроек и особенностей метаболизма фолиевой кислоты — очевидно, перспективное направление поиска новых маркеров и новых мишеней для терапии РС.

Заключение

В представленном исследовании впервые показано, что снижение уровня экспрессии DNMT1 при рассеянном склерозе наблюдается уже на стадии дебюта заболевания. Наличие взаимосвязи между уровнем экспрессии мРНК DNMT1, содержанием гомоцистеина в крови и генотипом по полиморфизмам генов MTHFR и MTR согласуется с гипотезой о том, что изменения метаболизма одноуглеродных фрагментов, обусловленные наличием полиморфных вариантов генов фолатного цикла, вовлечены в патогенез РС и могут способствовать нарушению эпигенетической регуляции.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 23-25-00312).

Соблюдение этических норм. Выполнение исследования одобрено Локальным этическим комитетом ФГБНУ «ИЭМ» (протокол № 3/23 от 20.09.2023). От всех участников эксперимента, данные которых приведены в публикации, до проведения исследования было получено добровольное информированное согласие.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Наибольший вклад распределен следующим образом: Е.А. Цымбалова — проведение экспериментов, обработка результатов; Е.А. Чернявская — проведение экспериментов, подбор литературы, обработка результатов; Д.Е. Рыжкова — проведение экспериментов, описание, обработка результатов; Г.Н. Бисага, И.Н. Абдурасулова — обсуждение результатов; В.И. Людыно — концепция и руководство работой, обработка результатов, написание текста.

Об авторах

Евгения Антоновна Цымбалова

Институт экспериментальной медицины

Email: evgesha.tsymbalova@mail.ru

лаборант-исследователь Физиологического отдела им. И.П. Павлова

Россия, Санкт-Петербург

Екатерина Александровна Чернявская

Институт экспериментальной медицины

Email: kate-chernjavskaja@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0003-0421-9819

лаборант-исследователь Физиологического отдела им. И.П. Павлова

Россия, Санкт-Петербург

Дарья Евгеньевна Рыжкова

Институт экспериментальной медицины

Email: dashstepanova@gmail.com
ORCID iD: 0009-0004-3745-3203

специалист Физиологического отдела им. И.П. Павлова

Россия, Санкт-Петербург

Геннадий Николаевич Бисага

Национальный медицинский исследовательский центр им. В.А. Алмазова

Email: bisaga@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-1848-8775
SPIN-код: 9121-7071

д-р мед. наук, профессор кафедры неврологии с клиникой

Россия, Санкт-Петербург

Ирина Николаевна Абдурасулова

Институт экспериментальной медицины

Email: i_abdurasulova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1010-6768
SPIN-код: 5019-3940

канд. биол. наук, руководитель Физиологического отдела им. И.П. Павлова

Россия, Санкт-Петербург

Виктория Иосифовна Людыно

Институт экспериментальной медицины

Автор, ответственный за переписку.
Email: vlioudyno@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1449-7754
SPIN-код: 8980-8497

канд. биол. наук, старший научный сотрудник Физиологического отдела им. И.П. Павлова

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы