Влияние нистатина на инвазию бактерий Serratia grimesii и Serratiaproteamaculans в эпителиальные клетки

Полный текст

Список сокращений

ИЛ (IL) — интерлейкин; КОЕ (CFU) — колониеобразующая единица; ЛПС — липополисахарид; CTxB — субъединица В холерного токсина; ОТ-ПЦР — обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция; цАМФ — циклический аденозинмонофосфат; DAPI — 4,6-диамино-2-фенилиндол; DMEM — Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium; DPBS — фосфатно-солевой раствор Дульбекко; LB — среда Луриа – Бертани; MOI — множественность заражения; PBS — фосфатно-солевой буфер; TLR — Toll-подобный рецептор.

Обоснование

В современном мире несмотря на большое разнообразие антимикробных препаратов вероятность возникновения бактериальной инфекции остается на высоком уровне. По данным Всемирной организации здравоохранения (доклад от 01.2022) показатели, полученные за последнее десятилетие, свидетельствуют о значительной распространенности внутрибольничных инфекций, многие из которых вызваны микроорганизмами с множественной лекарственной устойчивостью. При этом развитие патологического процесса может включать как тканевую (межклеточную) инвазию микроорганизмов, так и проникновение внутрь клеток, не являющихся профессиональными фагоцитами. Попадание микроорганизмов в клетки организма-хозяина обеспечивает им защиту не только от антибактериальных препаратов, но и от иммунной системы макроорганизма. После интернализации микроорганизмы могут оставаться неактивными и персистировать, вызывая рецидивирующие инфекции и хронические заболевания [1].

Способность проникать в эпителиальные клетки организма-хозяина является важным фактором вирулентности многих патогенных бактерий. Однако инвазировать могут не только патогенные, но и условно-патогенные бактерии, например, Serratia marcescens (при внутрибольничных инфекциях главным образом поражает мочевыводящие пути) [2]. Было показано, что и другие представители рода Serratia — S. grimesii и S. proteamaculans — также способны к инвазии в эпителиальные клетки [3, 4]. Исследование механизмов инвазии важно не только для понимания фундаментальных процессов взаимодействия бактериальных и эукариотических клеток, но и для оценки эффективности уже существующих и разработки новых противомикробных препаратов.

Плазматическая мембрана клетки представляет собой первый барьер на пути проникновения бактерии в эпителиальную клетку, микроорганизмы активно используют ее для осуществления процессов адгезии и инвазии в клетку-хозяина. На плазматической мембране эукариотических клеток выделяют микродомены, обогащенные сфинголипидами и холестерином (и, следовательно, менее текучие, чем остальная часть мембраны), — кавеолы и липидные рафты. Кавеолы имеют инвагинированную структуру (за счет белка кавеолина-1), а липидные рафты представляют собой плоские участки мембраны. Как правило, в этих микродоменах могут быть заякорены различные белки, участвующие в передаче клеточных сигналов [5]. Интересно, что бактериальные инфекционные агенты могут являться индукторами образования липидных рафтов [6, 7]. Для некоторых бактерий было показано участие кавеол/липидных рафтов в проникновении в эпителиальные клетки [6, 8, 9]. Так, в процессе интернализации Pseudomonas aeruginosa было доказано участие липидных рафтов в активации сигнальных путей, приводящих к инвагинации мембраны эпителиоподобных нефагоцитирующих клеток, а также показано непосредственное участие гликосфинголипидов — основных компонентов липидных рафтов — в лектин(LecA)-индуцированной инвазии P. aeruginosa [10].

Сообщалось, что нистатин (полиеновый антибиотик, за счет наличия двойных связей имеет высокую тропность к стеролам клеточной мембраны) ингибирует кавеолин-зависимый эндоцитоз [11, 12], но не влияет на клатрин-зависимый эндоцитоз [13]. Нистатин способен связываться с холестерином и извлекать его из плазматических мембран эукариотических клеток, что приводит к уплощению кавеол и разрушению липидных рафтов [14].

Цель исследования — с помощью нистатина проверить, участвуют ли кавеолы/липидные рафты в инвазии бактерий S. grimesii и S. proteamaculans в нефагоцитирующие эпителиоподобные клетки Caco-2 и M-HeLa.

Материалы и методы

1. Бактериальные штаммы и условия культивирования.

S. grimesii штамм 30063 был получен из Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSM 30063). S. proteamaculans штамм 94 был любезно предоставлен И.В. Демидюком (Институт молекулярной генетики РАН). Бактерии выращивали в среде Луриа – Бертани (LB, Диаэм, Россия) в течение 24 ± 2 ч при интенсивном перемешивании и температуре культивирования 37 °C (S. grimesii) или 30 °C (S. proteamaculans). Для оценки количества колониеобразующих единиц (КОЕ/мл) спектрофотометрически измеряли оптическую плотность бактериальной суспензии при длине волны 600 нм с последующим разведением и высевом на чашки Петри с LB-агаром по Miller (Диаэм, Россия). Объем бактериальной суспензии, соответствующий множественности заражения (MOI) 100 КОЕ на клетку, центрифугировали в течение 10 мин при скорости 13 000 об/мин, супернатант удаляли, бактериальный осадок ресуспендировали в DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, Биолот, Россия).

2. Культуры клеток и условия культивирования.

Клеточные линии M-HeLa (эпителиоидная карцинома шейки матки человека) и Caco-2 (аденокарцинома ободочной кишки человека) были получены из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН). Клетки растили в среде DMEM в присутствии 10 % фетальной бычьей сыворотки (Gibco, Австралия) без добавления антибиотиков при температуре 37 °C, 5 % СО₂. Для проведения экспериментов клетки трипсинизировали (раствор Трипсина – Версена, Биолот, Россия), рассевали в 24-луночные планшеты в количестве 100–200 тыс. клеток на лунку и инкубировали в течение 24–48 ч до 70–95 % конфлюэнтности. Подсчет клеток осуществляли в камере Горяева с помощью трипанового синего (Биолот, Россия).

Перед инкубацией с нистатином (суспензия в DPBS — фосфатно-солевом растворе Дульбекко, Sigma-Aldrich, США) эпителиальные клетки дважды отмывали фосфатно-солевым буфером (PBS) pH 7.4 (Биолот, Россия), а затем добавляли 50 мкМ (205 Ед) нистатина в среде DMEM (без сыворотки и антибиотиков) или аналогичное количество раствора Дульбекко (DPBS, Биолот, Россия) и инкубировали в течение 1 ч при 37 °C и 5 % СО₂. После этого клетки 2 раза отмывали PBS и вносили 500 мкл DMEM (без сыворотки и антибиотиков) или 0,05 % Tween20 (Sigma-Aldrich, США) в среде DMEM (без сыворотки и антибиотиков). Далее добавляли бактерии, как описано в методе количественной инвазии.

3. Метод количественной оценки инвазии.

В каждую лунку с эукариотическими клетками добавляли по 100 мкл бактериальной суспензии в среде DMEM в соответствии с MOI 100 КОЕ на клетку. Планшет центрифугировали в течение 5 мин при скорости 2000 об/мин, а затем инкубировали в течение 2 ч при 37 °C, 5 % СО₂. После этого клетки трижды отмывали PBS, трипсинизировали и добавляли равный объем среды DMEM, содержащей 100 мкг/мл гентамицина (Биолот, Россия), и инкубировали в течение 1,0–1,5 ч — для элиминации неинвазировавших внеклеточных бактерий. Затем клетки лизировали добавлением 4,5 % раствора дезоксихолата натрия (Applichem, Германия) к клеточной суспензии в соотношении 1 : 2. Далее делали 10-кратные разведения аликвот лизатов в среде LB и высевали на LB-агар. Чашки с высевами инкубировали в течение 48 ч при комнатной температуре, после чего осуществляли подсчет выросших колоний. Полученное значение КОЕ (с учетом разведений) соответствует числу инвазировавших бактерий.

Все эксперименты проводили не менее 4 раз, по 3 повторности в каждом эксперименте. Значения, полученные в контрольных образцах, принимали за 100 %. Статистическую обработку проводили в программах SigmaPlot 12.0 (США) и Microsoft Excel 2010 (США). Данные представлены в виде M ± SE (средние значения и стандартные отклонения). Для оценки различий применяли t-критерий Стьюдента, различия считали достоверными при p < 0,05.

4. Конфокальная микроскопия.

Клетки Caco-2 и M-HeLa, выращенные на стеклах, инкубировали с нистатином в течение 1 ч при 37 °C и 5 % СО₂. Затем клетки на стеклах отмывали раствором PBS, фиксировали в 4 % растворе формальдегида (Sigma-Aldrich, США) в течение 15 мин при комнатной температуре. Окраску липидных рафтов с использованием субъединицы В холерного токсина, конъюгированной с флуоресцентной меткой Alexa488 (Sigma-Aldrich, Германия), проводили без предварительной пермеабилизации в течение 15 мин при температуре 4 °C. Для окраски клеток антителами проводили пермеабилизацию клеточной мембраны 0,1 % раствором Triton X-100 (Helicon, Россия) в течение 10 мин при комнатной температуре. Неспецифическое связывание антител блокировали с помощью 1 % раствора бычьего сывороточного альбумина (Helicon, Россия) в течение 1 ч при комнатной температуре. Далее добавляли антитела к α-тубулину в разведении 1 : 1000 (#T5168, Sigma-Aldrich, США) или кавеолину-1 в разведении 1 : 1000 (#GB11409, Servicebio, Китай) и инкубировали препараты клеток при 4 °C в течение 16–18 ч после чего добавляли антивидовые антитела, конъюгированные с AlexaFluor488 1 : 500 (#sc-2010, Santa Cruz Biotechnology, США) или AlexaFluor555 1 : 1000 (#ab150078, Abcam, США) и инкубировали в темноте в течение 1 ч при комнатной температуре. В качестве отрицательного контроля использовали клетки, окрашенные только антивидовыми антителами. F-актин цитоскелета окрашивали раствором родамин-фаллоидина (Invitrogen, США) в течение 15 мин при 37 °C, для визуализации клеточных ядер препараты окрашивали раствором 4,6-диамино-2-фенилиндол дигидрохлорида (DAPI, Sigma-Aldrich, Германия). Препараты анализировали с помощью микроскопа Olympus FV3000 (Olympus, Япония) при длинах волн 405, 488 и 561 нм.

5. Вестерн-блоттинг.

Эукариотические клетки прединкубировали с 50 мкмоль/л нистатина или DPBS в течение 1 ч при 37 °C и 5 % СО₂. Затем удаляли среду и добавляли краску для подготовки проб, содержащую 2-меркаптоэтанол, прогревали в течение 5 мин при 56 °C. После этого пробы прогревали в течение 5 мин при 98 °C.

Белки разделяли при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях, в качестве маркеров молекулярной массы использовали предокрашенные белки (#26619, BioRad, США). Затем белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану 0,45 мкм (Bio-Rad, Германия) полусухим методом. Неспецифическое связывание блокировали 3 % раствором сухого обезжиренного молока (Serva, Германия) в 0,05 % растворе Tween20 в PBS. После переноса мембрану разрезали и соответствующие части инкубировали либо с кроличьими антителами к кавеолину-1 (#GB11409, Servicebio, Китай) в разведении 1 : 800, либо с мышиными антителами к β-актину (#GB15001, Servicebio, Китай) в разведении 1 : 1000. Разведения в течение 2 ч при комнатной температуре. Мембраны отмывали 0,05 % раствором Tween20 в PBS и инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, против иммуноглобулина мыши (#ab97023, Abcam, США) или кролика (#31460, Thermo Fisher Scientific, США) в разведении 1 : 20 000 в течение 1 ч при комнатной температуре. Сигнал детектировали с помощью реагентов для хемилюминесценции SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Scientific, США) на приборе ChemiDoc Imaging Systems (Bio-Rad, США).

6. Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР) в реальном времени.

После предварительной инкубации с 50 мкмоль/л нистатина или DPBS и бактериями эпителиальные клетки 3 раза отмывали PBS и трипсинизировали 0,25 % раствором Трипсина – Версена. Затем клетки осаждали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 мин, супернатант удаляли. Тотальную РНК выделяли из полученного осадка с использованием набора для выделения РНК из культур клеток diaGene (Диаэм, Россия). Обратную транскрипцию и амплификацию проводили с помощью BioMaster ОТ-ПЦР SYBR Blue (Биолабмикс, Россия) на приборе CFX96 Touch (Bio-Rad, США). Этапы включали первоначальный синтез кДНК при 45 °C в течение 30 мин, денатурацию при 95 °C в течение 5 мин и 40 циклов амплификации (95 °C в течение 30 с, 60 °C в течение 30 с, 72 °C в течение 30 с). Каждый образец анализировали в четырех повторностях не менее 2 раз. Праймеры (прямой и обратный соответственно) к tlr2: CTGGACAATGCCACATAC, CTAATGTAGGTGATCCTG; tlr4: CAGAACTG CAGGTGCTGG, GTTCTCTAGAGATGCTAG; beta-actin: GCCGGGACCTGACTGACTAC, TTTC CTTAATGTCACGCACGAT. Результаты ПЦР-анализа интерпретировали методом ΔΔCT, основанным на оценке уровня экспрессии целевого гена по отношению к референсному (β-актин).

Результаты

1. Секвестрация холестерина с помощью нистатина приводит к уменьшению инвазии бактерий за счет увеличения экспрессии кавеолина-1.

Поскольку было обнаружено, что кавеолы/липидные рафты участвуют в инвазии и межклеточном распространении многих патогенных и условно-патогенных бактерий [15, 16], мы задались вопросом, участвуют ли кавеолы/липидные рафты в интернализации бактерий S. grimesii и S. proteamaculans в эпителиальные клетки. Предварительная часовая инкубация клеток Сасо-2 с 50 мкмоль нистатина не влияла на инвазию обоих видов бактерий Serratia в данные клетки (рис. 1).

Рис. 1. Количество внутриклеточных бактерий в клетках Caco-2 и M-HeLa, предварительно инкубированных с 50 мкмоль/л нистатина в течение 1 ч, относительно контрольных клеток, прединкубированных с фосфатно-солевым раствором Дульбекко (контроль). Показаны средние значения и стандартные отклонения. * p < 0,05

Fig. 1. The number of intracellular bacteria in Caco-2 and M-HeLa cells preincubated with 50 μM nystatin for 1 h relative to control cells preincubated with DPBS (control). Means and standard deviations are shown. * p < 0.05

При этом увеличение концентрации нистатина в 4 раза также не оказывало влияния на инвазию исследуемых бактерий в клетки аденокарциномы ободочной кишки (данные не представлены). При обработке нистатином клеток M-HeLa наблюдалось ингибирование инвазии исследуемых бактерий примерно на 30 %. Данные результаты могут говорить о том, что при проникновении в клетки M-HeLa бактерии S. grimesii и S. proteamaculans используют кавеолы и/или липидные рафты.

Рис. 2. Конфокальная флуоресцентная микроскопия клеток M-HeLa без бактерий и после двухчасовой инкубации с S. grimesii и S. proteamaculans. Ядра окрашены 4,6-диамино-2-фенилиндолом (черный), кавеолин — непрямая иммунофлуоресценция (белый)

Fig. 2. Confocal fluorescence microscopy of M-HeLa cells without bacteria and after 2-h incubation with S. grimesii or S. proteamaculans. Nuclei are stained with DAPI (black), caveolin — indirect immunofluorescence (white)

Экспрессия кавеолина-1 может модулировать подвижность белков, связанных с кавеолами, приводя к изменению текучести плазматической мембраны [17]. Поскольку на конфокальных микрофотографиях не была обнаружена однозначная колокализация бактерий и кавеолина-1 (рис. 2), мы исследовали, связан ли ингибирующий инвазию эффект нистатина с изменением экспрессии кавеолина-1 и текучести плазматической мембраны клеток M-HeLa. Методом вестерн-блоттинга (рис. 3, а) мы показали, что в клетках Caco-2 кавеолин-1 не экспрессируется, что соответствует литературным данным [18], в то время как цитоплазмалическая мембрана клеток M-HeLa содержит кавеолы, и количество кавеолина-1 после инкубации с нистатином увеличивается в 1,5 раза.

Рис. 3. Экспрессия кавеолина-1 в клетках Caco-2 и M-HeLa, предварительно инкубированных с 50 мкмоль/л нистатина (+) или фосфатно-солевым раствором Дульбекко (–), детектирована с помощью вестерн-блоттинга (a). Количество внутриклеточных бактерий, приходящихся на 1 клетку M-HeLa, которые предварительно инкубировали с 50 мкмоль/л нистатина или фосфатно-солевым раствором Дульбекко (контроль), после чего к ним добавляли бактерии в среде DMEM или DMEM, содержащей 0,05 % Tween20. Показаны средние значения и стандартные отклонения. * p < 0,05 (относительно соответствующих контрольных образцов) (b).

Fig. 3. The protein level of caveolin-1 in Caco-2 and M-HeLa cells treated with 50 µM nystatin (+) or DPBS (–) was detected by western blot analysis assays (a). The number of intracellular bacteria per M-HeLa cell preincubated with 50 μM nystatin or DPBS (control), after that bacteria were added in DMEM or DMEM containing 0,05% Tween20. Means and standard deviations are shown. * p < 0.05 (relative to corresponding control samples) (b)

Таким образом, можно предположить, что обработка клеток M-HeLa нистатином приводит к изменению (вероятно, уменьшению) текучести клеточной мембраны за счет увеличения экспрессии кавеолина-1. Чтобы увеличить текучесть мембраны, клетки сначала прединкубировали с 50 мкмоль/л нистатина в течение 1 ч, а затем добавляли среду, содержащую 0,05 % Tween20 [19]. После этого клетки инфицировали исследуемыми бактериями и измеряли инвазию. Добавление детергента не влияло на жизнеспособность эукариотических клеток, а также на жизнеспособность и скорость роста бактерий. Как показано на рис. 3, b, в присутствии Tween20 инвазия в контрольные клетки, прединкубированные с DPBS, не менялась, а количество внутриклеточных бактерий в клетках, обработанных нистатином, увеличивалось в 1,6 раза (по сравнению с контролем). Данные результаты позволяют предположить, что различия в эффективности инвазии бактерий S. grimesii и S. proteamaculans в клетки Caco-2 и M-HeLa связаны с разницей в свойствах плазматических мембран клеток карцином.

2. Нистатин не влияет на сборку липидных рафтов, а также не приводит к перестройкам цитоскелета.

Как известно, нистатин имеет бóльшую тропность к эргостеролу, чем к холестерину, однако было показано, что он может изолировать или удалять холестерин из липидных рафтов [20–22]. Чтобы оценить влияние нистатина на состояние липидных рафтов, клетки окрашивали субъединицей В холерного токсина, конъюгированного с флуоресцентной меткой Alexa488 (CTxB-FITC), поскольку связывание CTxB с ганглиозидом GM1 является маркером для идентификации липидных рафтов. На рис. 4 показано, что обработка клеток 50 мкмоль/л нистатина не ингибировала клеточное поглощение маркера (в контрольные образцы добавляли соответствующее количество DPBS).

Рис. 4. Конфокальная флуоресцентная микроскопия липидных рафтов. Изображение клеток Caco-2 (a) и M-HeLa (b), инкубированных с 50 мкмоль/л нистатина при 37 °C в течение 1 ч. GM1 окрашивали CTxB-FITC (белый), ядра клеток окрашены 4,6-диамино-2-фенилиндолом (черный)

Fig. 4. Confocal fluorescence microscopy: monitoring of lipid rafts distribution. Caco-2 (a) and M-HeLa (b) cells incubated with 50 μM nystatin at 37 °C for 1 hour. GM1 was stained with CTxB-FITC (white), cell nuclei were stained with DAPI (black)

Ранее нами было показано, что предварительная двухчасовая обработка клеток M-HeLa и Caco-2 метил-β-циклодекстрином, который специфически удаляет холестерин из плазматической мембаны и нарушает формирование липидных рафтов, приводила к увеличению количества стресс-фибрилл в клетках [23]. Поэтому мы проверили влияние нистатина на реорганизацию цитоскелета клеток карцином (рис. 5).

Рис. 5. Конфокальная флуоресцентная микроскопия клеток Caco-2 (a) и M-HeLa (b), визуализирующая цитоскелет эпителиальных клеток, обработанных 50 мкмоль/л нистатина или фосфатно-солевого раствора Дульбекко в течение 1 ч. Ядра окрашены 4,6-диамино-2-фенилиндолом (синий), F-актин окрашен RF (красный), α-тубулин — непрямая иммунофлуоресценция (зеленый)

Fig. 5. Visualization the cytoskeleton of Caco-2 (a) and M-HeLa (b) cells treated with 50 μM nystatin or DPBS for 1 h by confocal fluorescence microscopy. Nuclei are stained with DAPI (blue), F-actin is stained with RF (red), α-tubulin is indirect immunofluorescence (green)

3. Агонистическая и антагонистическая активность нистатина в отношении Toll-подобных рецепторов является клеточно-специфической.

В плазматической мембране эпителиальных клеток, в том числе HeLa и Caco-2 [24, 25], присутствуют рецепторы распознавая паттернов, например, Toll-подобные рецепторы (TLR), которые распознают различные микробные структурные компоненты. Так, TLR2 реагирует на липопротеины и пептидогликан, а TLR4 активируется липополисахаридами (ЛПС) наружной мембраны грамотрицательных бактерий. Молекулы ЛПС распознаются CD14 и переносятся в комплекс MD2–TLR4 перед активацией TLR4, и часть комплекса ЛПС–MD2–TLR4 попадает в клетку путем эндоцитоза [26]. Установлено, что как TLR2, так и TLR4 и вспомогательные белки, а также стимулированный комплекс ЛПС–MD2–TLR4 ассоциируются с липидными рафтами/кавеолами [27, 28]. И вероятно, это необходимое условие для опосредованной TLR передачи сигнала и экспрессии генов-мишеней [29, 30].

Рис. 6. Относительная продукция цитокинов — интерлейкинов-6 и -8 клетками M-HeLa и Caco-2 после часовой инкубации с 50 мкмоль/л нистатина. К контрольным клеткам добавляли соответствующее количество фосфатно-солевого раствора Дульбекко. Показаны средние значения и стандартные отклонения. Статистически значимые различия между контрольной и обработанной группами отмечены звездочками: * p < 0,05, *** p < 0,005

Fig. 6. Relative production of cytokines IL-6 and IL-8 by M-HeLa and Caco-2 cells after one-hour incubation with 50 μM nystatin, DPBS was added to control cells. Means and standard deviations are shown. Statistically significant differences between the control and treated groups are indicated by asterisks: * p < 0.05, *** p < 0.005

Сообщалось, что нистатин ингибирует индуцированную ЛПС активацию NF-êB и экспрессию генов, кодирующих иммуномодулирующие цитокины [29]. В то же время имеются работы, согласно которым нистатин проявляет TLR2- и TLR4-агонистическую активность [31] и стимулирует секрецию интерлейкина-8 (ИЛ-8) в TLR2 экспрессирующих клетках [32]. В связи с этим мы решили исследовать влияние нистатина на продукцию провоспалительных цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-8 клетками M-HeLa и Caco-2. Как показано на рис. 6, добавление 50 мкмоль/л нистатина приводило к увеличению продукции цитокинов в 1,5 раза (в клетках Сасо-2 ИЛ-6 не детектируется).

Поскольку нистатин может проявлять как агонистическую, так и антагонистическую активность в отношении TLR2 и TLR4, мы сравнили его влияние на экспрессию генов, кодирующих данные рецепторы (рис. 7, a). В зависимости от клеточной линии нистатин либо увеличивал (Caco-2), либо уменьшал (M-HeLa) экспрессию tlr2 и tlr4.

TLR4 активируется ЛПС грамотрицательных бактерий, чтобы индуцировать выработку провоспалительных медиаторов, направленных на уничтожение бактерий. Для уропатогенных Escherichia coli было показано, что уменьшение их интернализации связано с увеличением экспрессии TLR4, что приводит к уменьшению количества фосфорилированной формы малой ГТФазы Rac-1, участвующей в инвазии данных бактерий [33]. В нашей работе обработка клеток M-HeLa нистатином привела к уменьшению инвазии S. grimesii и S. proteamaculans, и можно было ожидать, что это будет сопровождаться увеличением экспрессии tlr4.

Рис. 7. Относительная нормализованная (на β-актин) экспрессия генов, кодирующих TLR2 и TLR4. Клетки Caco-2 и M-HeLa инкубировали с 50 мкмоль/л нистатина или DPBS (контроль) в течение 1 ч (a). Клетки M-HeLa инкубировали с 50 мкмоль/л нистатина или фосфатно-солевым раствором Дульбекко (контроль) в течение 1 ч, а затем проводили бактериальную инвазию (множественность заражения 100) (b)

Fig. 7. Relative normalized (to β-actin) expression of tlr2 and tlr4 genes. Caco-2 and M-HeLa cells were incubated with 50 μM nystatin or DPBS (control) for 1 h (a). M-HeLa cells were incubated with 50 µM nystatin or DPBS (control) for 1 h, and then bacterial invasion was performed (MOI 100) (b)

Инкубация клеток с нистатином не приводит к реорганизации актиновых микрофиламентов и микротрубочек цитоскелета ни в клетках Caco-2, ни в клетках M-HeLa.

Однако экспрессия как tlr4, так и tlr2 уменьшилась после добавления антибиотика. В связи с этим мы проверили влияние S. grimesii и S. proteamaculans на экспрессию tlr4 и tlr2 в контрольных и обработанных нистатином клетках M-HeLa (рис. 7, b). Инвазия бактерий повышала уровень экспрессии генов в обработанных клетках до уровня в контрольных образцах. Полученные результаты говорят о том, что TLR4, TLR2 и нижестоящие сигнальные молекулы не принимают активного участия в инвазии исследуемых бактерий.

Обсуждение

Плазматическая мембрана клетки задействована во многих биохимических процессах, и от ее состава зависит не только структура, но и функции клетки. Так, изменение в распределении фосфолипидов в липидном бислое может быть сигналом таких процессов, как агрегация клеток, адгезия и апоптоз. Холестерин является важным структурным компонентом клеточной мембраны и участвует в обеспечении ее целостности и текучести, а также компартментализации и сигнализации [34].

Многие бактерии, способные к инвазии, используют липидные рафты для проникновения в клетку-хозяина. При этом мембранный холестерин играет важную роль во взаимодействии хозяин – патоген. Истощение или секвестрация холестерина снижает адгезию и интернализацию микроорганизмов в эукариотические клетки. Таким образом, холестерин плазматической мембраны может играть двойную роль в процессе бактериальной инвазии: как место связывания бактерий и как интегрирующий компонент липидных рафтов, обеспечивающий платформу для эффективной инициации сигнальных каскадов [35].

Соотношение фосфолипидов и холестерина в клеточной мембране зависит от типа клеток. Ранее мы показали, что истощение холестерина метил-β-циклодекстрином способствует более эффективному уменьшению инвазии бактерий S. grimesii и S. proteamaculans в клетки M-HeLa, чем в клетки Caco-2 [23]. Такой эффект в том числе может быть связан с тем, что в цитоплазматической мембране клеток Сасо-2 содержится холестерина меньше, чем в HeLa, а также не экспрессируется кавеолин-1, который играет важную роль в гомеостазе холестерина, связывая его и транспортируя к мембране [18].

Патогенные бактерии и вирусы используют различные эндоцитарные пути и рецепторы для проникновения в клетку-хозяина. Отрицательно заряженные частицы, в том числе бактерии, могут проникать в клетку с помощью кавеолин-зависимого эндоцитоза [36]. Одним из ингибиторов кавеолин-зависимого эндоцитоза является нистатин. Нистатин способен формировать поры в клеточной мембране, количество которых находится в прямой корреляции с концентрацией нистатина, при этом низкие концентрации антибиотика (50 мкмоль/л) не оказывают существенного влияния на размер и форму клеток [37]. Нистатин также может связывать холестерин, расположенный на плазматической мембране эукариотических клеток, и изменять микроструктуру липидных рафтов, которые играют важную роль не только в интернализации патогенов, но и в регуляции как врожденных, так и адаптивных иммунных реакций [38]. В данной работе мы показали, что нистатин не влияет на распределение холестерина в клетках, но увеличивает продукцию цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-8 в клетках M-HeLa и Сасо-2. Антибиотик индуцирует секрецию провоспалительных цитокинов посредством TLR2-зависимого механизма [32]. Синтез цитокинов эпителиальными клетками в ответ на бактериальное заражение также опосредован сигнальными путями, запускаемыми Toll-подобными рецепторами, в том числе TLR2 и TLR4. Передача сигнала от TLR4 может приводить к активации транскрипционного фактора NF-êB, или запускать альтернативный сигнальный путь, который приводит к увеличению продукции вторичного мессенджера — циклического аденозинмонофосфата. Накопление циклического аденозинмонофосфата способствует инактивации малой Rho-ГТФазы Rac1, которая участвует в проникновении бактерий через липидные рафты. Таким образом, увеличение экспрессии TLR4 приводит к уменьшению бактериальной инвазии [33]. Мы показали, что заражение предварительно обработанных нистатином клеток M-HeLa бактериями S. grimesii и S. proteamaculans приводит к увеличению экспрессии как tlr2, так и tlr4. Однако уровень экспрессии данных генов в обработанных антибиотиком клетках не превосходит уровень в контрольных образцах. Поэтому мы не можем однозначно говорить об участии Toll-подобных рецепторов в инвазии исследуемых бактерий.

Интернализация бактерий в эукариотические клетки зависит от текучести плазматической мембраны, которая зависит от содержания в ней холестерина [10]. При этом в одних работах говорится о том, что уменьшение уровня холестерина в клеточной мембране за счет сверхэкспрессии кавеолина-1 приводит к увеличению текучести мембраны [39], в других, наоборот, нокдаун кавеолина-1 увеличивает текучесть плазматической мембраны и подвижность белков мембранных микродоменов [40]. Дефицит кавеолина-1 в эукариотических клетках может способствовать как увеличению, так и уменьшению количества внутриклеточных бактерий. Это связано с перераспределением различных компонентов липидных рафтов в процессе кластеризации задействованных в интернализации бактерий рецепторов. Так, во время инвазии L. monocytogenes нокдаун кавеолина-1 нарушает рекрутирование E-кадгерина в места прикрепления бактерий [41]. При адгезии на поверхности эукариотических клеток бактерий S. aureus наблюдается перераспределение компонентов мембранных микродоменов и рекрутирование ганглиозида GM1 к местам прикрепления бактерий, зависящее от β1-интегрина клетки-хозяина, при этом кластеризация самого рецептора не зависит от мембранных микродоменов. Однако инвазия бактерий зависит от состава микродоменов, и дефицит кавеолина-1 увеличивает опосредованное β1-интегрином поглощение S. aureus [40]. Ранее мы показали, что S. proteamaculans также задействуют β1-интегрин при инвазии в эпителиальные клетки [42]. Таким образом, можно предположить, что кавеолин-1 способен ограничивать интернализацию бактерий, связывающихся с β1-интегрином, а модуляция подвижности компонентов мембранных микродоменов является важным аспектом взаимодействия патоген – хозяин во время инвазии бактерий.

Выводы

Полученные результаты позволяют предположить, что уменьшение инвазии бактерий S. grimesii и S. proteamaculans в эпителиальные клетки, предварительно обработанные нистатином, связано с изменением (вероятно, уменьшением) текучести плазматической мембраны. Данный эффект может быть характерен для бактерий, в интернализации которых участвует β1-интегрин.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Исследовательская работа не имела спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.

Additional information

Funding source. The research had no sponsorship.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Об авторах

Юлия Михайловна Берсон

Автор, ответственный за переписку.
Email: juletschka.ber@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-0548-3745
SPIN-код: 5562-1057
Scopus Author ID: 57224308883

аспирант группы молекулярной цитологии прокариот и бактериальной инвазии

Список литературы

Дополнительные файлы

Доп. файлы

Действие

1. JATS XML

Скачать

2. Рис. 1. Количество внутриклеточных бактерий в клетках Caco-2 и M-HeLa, предварительно инкубированных с 50 мкмоль/л нистатина в течение 1 ч, относительно контрольных клеток, прединкубированных с фосфатно-солевым раствором Дульбекко (контроль). Показаны средние значения и стандартные отклонения. * p < 0,05

Скачать (86KB)

Метаданные

3. Рис. 2. Конфокальная флуоресцентная микроскопия клеток M-HeLa без бактерий и после двухчасовой инкубации с S. grimesii и S. proteamaculans. Ядра окрашены 4,6-диамино-2-фенилиндолом (черный), кавеолин — непрямая иммунофлуоресценция (белый)

Скачать (403KB)

Метаданные

4. Рис. 3. Экспрессия кавеолина-1 в клетках Caco-2 и M-HeLa, предварительно инкубированных с 50 мкмоль/л нистатина (+) или фосфатно-солевым раствором Дульбекко (–), детектирована с помощью вестерн-блоттинга (a). Количество внутриклеточных бактерий, приходящихся на 1 клетку M-HeLa, которые предварительно инкубировали с 50 мкмоль/л нистатина или фосфатно-солевым раствором Дульбекко (контроль), после чего к ним добавляли бактерии в среде DMEM или DMEM, содержащей 0,05 % Tween20. Показаны средние значения и стандартные отклонения. * p < 0,05 (относительно соответствующих контрольных образцов) (b).

Скачать (135KB)

Метаданные

5. Рис. 4. Конфокальная флуоресцентная микроскопия липидных рафтов. Изображение клеток Caco-2 (a) и M-HeLa (b), инкубированных с 50 мкмоль/л нистатина при 37 °C в течение 1 ч. GM1 окрашивали CTxB-FITC (белый), ядра клеток окрашены 4,6-диамино-2-фенилиндолом (черный)

Скачать (305KB)

Метаданные

6. Рис. 5. Конфокальная флуоресцентная микроскопия клеток Caco-2 (a) и M-HeLa (b), визуализирующая цитоскелет эпителиальных клеток, обработанных 50 мкмоль/л нистатина или фосфатно-солевого раствора Дульбекко в течение 1 ч. Ядра окрашены 4,6-диамино-2-фенилиндолом (синий), F-актин окрашен RF (красный), α-тубулин — непрямая иммунофлуоресценция (зеленый)

Скачать (1MB)

Метаданные

7. Рис. 6. Относительная продукция цитокинов — интерлейкинов-6 и -8 клетками M-HeLa и Caco-2 после часовой инкубации с 50 мкмоль/л нистатина. К контрольным клеткам добавляли соответствующее количество фосфатно-солевого раствора Дульбекко. Показаны средние значения и стандартные отклонения. Статистически значимые различия между контрольной и обработанной группами отмечены звездочками: * p < 0,05, *** p < 0,005

Скачать (211KB)

Метаданные

8. Рис. 7. Относительная нормализованная (на β-актин) экспрессия генов, кодирующих TLR2 и TLR4. Клетки Caco-2 и M-HeLa инкубировали с 50 мкмоль/л нистатина или DPBS (контроль) в течение 1 ч (a). Клетки M-HeLa инкубировали с 50 мкмоль/л нистатина или фосфатно-солевым раствором Дульбекко (контроль) в течение 1 ч, а затем проводили бактериальную инвазию (множественность заражения 100) (b)

Скачать (190KB)

Метаданные