Гибридная мультиэпитопная рекомбинантная вакцина для защиты от инфекции, вызванной стрептококками группы В

Полный текст

Обоснование

Стрептококки группы B (СГВ), или Streptococcus agalactiae, — этиологические агенты разнообразных бактериальных инфекций, угрожающих жизни беременных женщин, младенцев, людей преклонного возраста и лиц с ослабленным иммунитетом [1–6]. Появление антибиотикорезистентных штаммов бактерий снижает эффективность применения антибиотиков для профилактики передачи СГВ от матери к плоду или терапии развившейся инфекции у детей и взрослых [7–9].

Назначение антибиотиков беременным женщинам перед родами может предотвратить развитие СГВ инфекции с ранним (0–6 дней) началом, но не снижает риск развития инфекции с поздним началом (7–90 дней), когда передача СГВ происходит в процессе кормления или ухода за ребенком [10, 11]. Несмотря на меры лекарственной профилактики, по данным Всемирной организации здравоохранения, СГВ-инфекция ежегодно приводит к гибели более 90 тыс. новорожденных. Риск развития дисбиотических состояний как следствие антибиотикотерапии также крайне высок.

Эффективным средством в системе профилактики СГВ-носительства у матерей и развития инфекций у новорожденных могут стать вакцины. Задача создания вакцины от СГВ-инфекции в 2021 г. выделена Всемирной организацией здравоохранения в качестве одного из приоритетных научных направлений. По некоторым расчетам, применение СГВ-вакцин помимо решения задач защиты здоровья матери и ребенка будет приносить реальную экономическую выгоду [12–14].

В 80-х годах ХХ в. была испытана на людях первая полисахаридная СГВ-вакцина [15], несколько позже были созданы и исследованы конъюгированные вакцины, в которых для повышения иммуногенности препарата полисахариды были связаны с субъединицей холерного токсина [16–20].

Несколько вакцин против СГB в настоящее время проходят клинические испытания, которые фокусируются на иммунизации матерей для защиты младенцев. Это гексавалентная полисахаридная конъюгированная вакцина, нацеленная на шесть бактериальных серотипов GBS6, от компании Pfizer [21], белковая вакцина GBS-NN компании GlaxoSmithKline [22], белковая вакцина GBS компании Minervax [23].

В отсутствие лицензированных СГВ-вакцин не прекращается поиск новых вакцинных препаратов, при этом белковые вакцины имеют хорошие перспективы, поскольку не зависят от серотиповой специфичности стрептококков [24–26].

Ранее мы показали, что комбинация пяти рекомбинантных белков-аналогов пяти поверхностных белков СГВ может стать основой для вакцины широкого спектра действия [27]. В развитие этих исследований были созданы образцы рекомбинантной мультиэпитопной вакцины — химерной молекулы, содержащей участки иммунодоминантных фрагментов пяти стрептококковых белков.

Первоначально были сконструированы четыре рекомбинантных гибридных молекулы (Su1, Su2, Su3, Su4), состоящие из иммунодоминантных участков пяти белковых факторов вирулентности СГВ. Конструкции включали в себя различные фрагменты СГB белков Вас, CspA, ScpB (С5а-пептидаза), ScaAB и SspB1. Часть гибридных молекул содержала внутренний адъювант-фрагмент сальмонеллезного белка флагеллина, обладающего адъювантными свойствами и высокой иммуногенностью [28]. Участки стрептококковых белков были выбраны на основе компьютерного анализа с помощью пакета программ The Immune Epitope Database and Analysis Resource (IEDB), ExPASy, дизайн молекул создавали с использованием алгоритма I-Tasser CASPs (Critical Assessment of protein Structure Prediction). Сравнительный анализ [29] показал, что при подкожной иммунизации мышей в присутствии экзогенного адъюванта (соли алюминия) конструкции были в различной степени иммуногенны и протективны в случае внутрибрюшинной СГВ-инфекции. Для дальнейшего исследования в качестве вакцинного кандидата был выбран химерный рекомбинантный белок Su4 (рис. 1), ранее показавший высокий уровень иммуногенности и не содержащий в свой структуре участок сальмонеллезного флагеллина.

 

Рис. 1. Схема и последовательность фрагментов Вас, CspA, ScpB (С5а пептидаза), ScaAB и SspB1 в составе гибридных молекул белков Su2 и Su4

Fig. 1. Schematic representation and sequence alignment of fragments Bac, CspA, ScpB (C5a peptidase), ScaAB, and SspB1 within the hybrid protein molecules Su2 and Su4

 

Цель — проанализировать иммуногенные свойства рекомбинантного белка Su4 при разных способах вакцинации, а также представить данные о протективной эффективности специфического иммунного ответа при интраназальной и интравагинальной СГВ-инфекции.

Материалы и методы

Бактериальные штаммы и условия роста. В качестве возбудителя СГВ-инфекции использовали клинический изолят из вагинальных мазков (штамм 6224 GBS серотип V), принадлежащий коллекции Института экспериментальной медицины (Санкт-Петербург). Согласно анализу методом полимеразной цепной реакции, этот штамм содержал гены, кодирующие все пять белков, входящих в химерный белок (неопубликованные данные). Бактерии выращивали в бульоне Тодда – Хьюитта (T1438 Sigma-Aldrich) в течение ночи в аэробных условиях при 37 °С. Концентрацию бактерий определяли методом высева разведений бактерий на колумбийский кровяной агар (BioMedia, Россия).

Полипептиды. Рекомбинантная гибридная молекула Su4 (рис. 1) была получена ранее [29] с использованием методов, аналогичных ранее описанным для синтеза рекомбинантного химерного кандидата пневмококковой вакцины [30].

Вкратце, с помощью пакета программ IEDB были отобраны консервативные фрагменты пяти белков СГВ (Вас, CspA, ScpB (С5а-пептидаза), ScaAB и SspB1), содержащие эпитопы B- и T-клеток. Аминокислотная последовательность химерных белков была разработана in silico, предсказание искусственной структуры белка было выполнено с использованием алгоритма I-Trasser. Синтез нуклеотидной последовательности химерного белка был выполнен путем удлинения перекрывающихся олигонуклеотидов [31]. Синтетический химерный ген был клонирован в векторе pET24b + (Invitrogen), в результате чего получена экспрессионная плазмида pPSPF, которая была трансформирована в Escherichia coli BL21 (Invitrogen).

Иммунизация мышей и сбор образцов. Самки беспородных мышей в возрасте 6–8 нед. были приобретены в лабораторно-племенном питомнике НИЦ «Курчатовский институт» (Рапполово, Ленинградская область, Россия). Экспериментальные процедуры соответствовали принципам, изложенным в Директиве ЕС 2010/63/EU, для экспериментов на животных и были одобрены и проведены в соответствии с руководящими принципами и под контролем локального Комитета по биомедицинской этике.

Подкожная вакцинация. Мышам (n = 12) подкожно в область шеи вводили 20 мкг раствора белка Su4 в 200 мкл физиологического буферного раствора (PBS). Иммунизацию повторяли через 21 день. Контрольным мышам (n = 12) подкожно вводили 200 мкл PBS.

Интраназальная вакцинация. Мышам (n = 12) интраназально в обе ноздри вводили 20 мкг раствора белка Su4 в 20 мкл PBS. Иммунизацию повторяли через 21 день. Контрольным мышам (n = 12) интраназально вводили 20 мкл PBS.

Вагинальная вакцинация. Мышам (n = 24) интравагинально вводили 20 мкг раствора белка Su4 в 20 мкл PBS. Иммунизацию повторяли через 21 день. Контрольным мышам (n = 24) интравагинально вводили 20 мкл PBS.

Образцы крови брали из подчелюстной вены на 20-й и 40-й день от начала вакцинации.

Анализ эффективности вакцины. На 45-й день от начала вакцинации контрольных и вакцинированных мышей заражали путем назальной инъекции СГВ 6224 в дозе 10⁸ КОЕ на одно животное в объеме 20 мкл. Инфекционный процесс контролировали путем подсчета СГВ в легких или вагинальной полости. Легкие собирали и гомогенизировали в PBS с помощью шаровой вибрационной мельницы Retsch MM-400. Серийные 10-кратные разведения гомогенатов готовили в PBS и определяли концентрацию бактерий в гомогенатах путем высева разведений на колумбийский кровяной агар (BioMedia, Россия). Бактериальную нагрузку в вагинальных смывах, полученных путем промывания вагинальной полости 50 мкл PBS, определяли таким же образом. Часть контрольных (n = 12) и иммунизированных мышей (n = 12) заражали СГВ, штамм 6224, путем вагинального введения бактерий в дозе 10⁸ КОЕ на одно животное в 20 мкл PBS.

Определение специфических иммуноглобулинов. Уровни специфических IgG, IgG1, IgG2a, IgG3 определяли методом иммуноферментного анализа в 96-луночных планшетах (Nunc), покрытых белком Su4 или рекомбинантными пептидными аналогами составных фрагментов Su4 (2 мкг/мл), в течение ночи при 4 °С. В дублирующие лунки добавляли серию двукратных разведений образца (100 мкл) и инкубировали в течение 1 ч при температуре 37 °С. Добавляли меченые пероксидазой хрена козьи антимышиные антитела IgG (Sigma), разведенные в блокирующем буфере в соответствии с инструкциями производителя (100 мкл на лунку). После инкубации при 37 °С в течение 1 ч планшеты обрабатывали 3,3ʹ,5,5ʹ-тетраметилбензидином (BD Bioscience) в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию Ig вычисляли по стандартным кривым, как это было сделано ранее [30].

Статистический анализ. Данные обрабатывали с помощью программного обеспечения Statistica версии 8.0. (StatSoft, США). Средние значения и стандартные ошибки средних значений рассчитывали при определении концентрации IgG и количества бактерий. Статистически значимые различия между группами определяли с помощью ANOVA или при ненормально распределенных данных непараметрическим U-критерием Манна – Уитни. Значения p < 0,05 считали статистически значимыми.

Результаты

Иммуногенные свойства гибридного белка Su4 исследовали при подкожном, интраназальном и интравагинальном путях иммунизации. Экспериментальным мышам всеми указанными способами по единому протоколу вводили одинаковое количество белка без какого-либо экзогенного адъюванта. На 20-й день в сыворотках крови иммунизированных мышей во всех экспериментальных группах был зарегистрирован достоверный уровень специфических IgG (рис. 2, а). Максимальный иммунный ответ отмечен при подкожном, минимальный — при вагинальном способе введения.

 

Рис. 2. Уровень IgG в сыворотке крови на 20-й день после однократного введения белка Su4 (а); после повторного введения белка Su4 (b). * Cтатистически достоверные отличия, p < 0,05

Fig. 2. IgG levels in blood serum: on day 20 following a single injection of Su4 protein (а); after repeated administration of Su4 protein (b). * Statistically significant differences, p < 0.05

 

Повторная иммунизация вызвала дальнейшее накопление специфических антител в циркуляции. Подкожная иммунизация обеспечивала достоверный по отношению к контролю и обоим мукозальным способам вакцинации прирост уровня специфических антител класса G (рис. 2, b). При интраназальном и интравагинальном способах введения также было выявлено превышение титра специфических антител у вакцинированных животных, хотя при имеющемся численном основании отличия между контрольными и иммунными сыворотками не достигали уровня достоверности.

В сыворотках, полученных после подкожной иммунизации мышей, был определен состав пула IgG антител оценки соотношения IgG1 и IgG2a. Количественную оценку уровня антител давали с помощью калибровочных кривых, построенных с использованием стандартов мышиных IgG1 и IgG2a. Основная доля Su4 специфических антител была представлена подклассом IgG1 (рис. 3).

 

Рис. 3. Соотношение уровня антител подклассов IgG1 и IgG2a после подкожной иммунизации мышей белком Su4

Fig. 3. Ratio of IgG1 to IgG2a subclass antibody levels following subcutaneous immunization of mice with the Su4 protein

 

Белок Su4 представляет собой искусственно сконструированный гибридный полипептид, в состав которого входят линейные антигенные детерминанты белков, принадлежащих СГВ. Мы показали, что в пуле Su4-специфических IgG присутствовали антитела к белкам СГВ, фрагменты которых вошли в состав химерной молекулы. На рис. 4 представлены результаты иммуноферментного анализа, в котором титрование одних и тех же сывороток вели на планшетах с сорбированными рекомбинантными полипептидами P6, CspA, ScpB, ScaAB, StV, соответствующими рекомбинантным белкам Вас, CspA, ScpB (С5а-пептидаза), ScaAB и SspB1 GBS.

 

Рис. 4. Уровень антител к рекомбинантным белкам, входящим в состав химерного белка Su4. * Cтатистически достоверные отличия, p < 0,05

Fig. 4. Antibody levels against recombinant proteins incorporated into the chimeric protein Su4. * Statistically significant differences, p < 0.05

 

Иммунизированные белком Su4 мыши демонстрировали устойчивость к заражению СГВ (рис. 5). Через 45 дней от начала вакцинации мышей, иммунизированных подкожно, интравагинально и интраназально, инфицировали путем введения в нос СГВ 6224 в дозе 10⁸ КОЕ на одно животное. В легких определяли концентрацию СГВ в динамике инфекции. Во всех иммунных группах наблюдалось ускоренное по сравнению с контролем снижение содержания бактерий. Через 3 или 24 ч после заражения наблюдали достоверные отличия или тенденцию к ускоренному выведению СГВ из ткани легких во всех исследованных группах.

 

Рис. 5. Содержание стрептококков группы В в легких после интраназального заражения в группах мышей, иммунизированных подкожно (а), интраназально (b) и интравагинально (с) . * Cтатистически достоверные отличия, p < 0,05

Fig. 5. Quantification of group B streptococcus GBS in the lungs after intranasal challenge in groups of mice immunized via subcutaneous (a), intranasal (b), and intravaginal (c) routes. * Statistically significant differences, p < 0.05

 

СГВ представляют основную угрозу для новорожденных, матери которых страдают бессимптомной вагинальной СГВ-инфекцией. Нами была исследована эффективность вагинального пути вакцинации исследуемым белком Su4 для ограничения вагинальной формы СГВ-инфекции. С этой целью на мышах, получивших курс вагинальной иммунизации белком Su4, была смоделирована вагинальная СГВ-инфекция с последующим контролем скорости выведения бактерий.

Через 3 ч после вагинального заражения было отмечено достоверное снижение количества бактерий в смывах из вагинальной полости иммунизированных мышей по сравнению с контролем. Через 24 и 48 ч после заражения часть мышей в иммунизированной и контрольной группе полностью очистилась от инфекции, однако у носителей инфекции средний показатель инфицированности вагинальной полости был ниже у вакцинированных мышей. В контрольной группе через 48 ч у 2 мышей этот показатель был близок к максимальному значению инфицированности, наблюдавшемуся в контроле через 3 ч после заражения (рис. 6).

 

Рис. 6. Содержание стрептококков группы В в вагинальных смывах через 3, 24 и 48 ч после вагинального заражения. * Cтатистически достоверные отличия, p < 0,05

Fig. 6. Quantification of group B streptococcus in vaginal lavages at 3, 24, and 48 hours post-vaginal infection. * Statistically significant differences, p < 0.05

 

Таким образом, вагинальная вакцинация мышей рекомбинантным химерным белком Su4 стимулировала иммунный ответ, который обеспечивал ускоренное по сравнению с контролем выведение СГВ из вагинальной полости мышей после вагинального заражения.

Резюмируя результаты исследований на мышах иммуногенных и протективных свойств химерного рекомбинантного белка Su4, можно заключить, что:

• рекомбинантный химерный белок Su4 иммуногенен при подкожном, интраназальном, вагинальном способах введения даже без использования адъюванта;
• все способы вакцинации приводят к индукции циркулирующих специфических IgG антител;
• максимальную иммуногенность обеспечивает подкожный способ введения;
• в пуле IgG антител, специфичных к многосоставному химерному белку, присутствовали антитела к антигенным детерминантам его отдельных компонентов;
• иммунный ответ, сформированный после подкожной, интраназальной и вагинальной иммунизации белком Su4, обеспечивает ускоренное очищение легких мышей от СГВ после интраназальной инфекции;
• иммунный ответ, сформированный после вагинальной иммунизации белком Su4, обеспечивает ускоренное очищение вагинальной полости мышей от СГВ после вагинальной инфекции.

Обсуждение

Streptococcus agalactiae — основная причина неонатального сепсиса и менингита. Антибиотикотерапия позволяет снизить частоту инфекций новорожденных с ранним началом, но не может оказать влияния на позднюю стадию инфицирования [10, 11, 31]. Быстрый рост антибиотикорезистентных штаммов дополнительно снижает эффективность применения антибиотиков [7–9].

Поставить под более жесткий контроль СГВ-инфекции можно с помощью специфических вакцин. В настоящее время наилучшим образом разработаны и исследованы конъюгированные полисахаридные вакцины, они ближе всего находятся к стадии лицензирования [10, 21].

Начаты клинические исследования нескольких вариантов белковых СГВ-вакцин на основе консервативных участков ряда поверхностных белков СГВ [22]. Неоднозначность исхода клинических испытаний, стремление к выбору наиболее эффективных, инновационных и экономически выгодных форм вакцинных препаратов поддерживают интерес к продолжению поиска биологических молекул, обладающих вакцинным потенциалом [33–35].

Возможный вариант вакцинных антигенов — искусственно синтезированные мультиэпитопные рекомбинантные белки, эффективный состав которых определяют на основе анализа биоинформационных баз данных. Такие белки состоят из иммунодоминантных фрагментов актуальных бактериальных или вирусных белков, нередко в сочетании с иммунорегуляторными аминокислотными последовательностями [36].

Перед нами стояла задача исследовать протективную эффективность сконструированной нами полиэпитопной молекулы, соединяющей линейные детерминанты пяти белков СГВ — Вас, CspA, ScpB (С5а-пептидаза), ScaAB и SspB1 и охарактеризовать особенности иммунного ответа при различных способах иммунизации. Протективная эффективность каждого из указанных белков была продемонстрирована ранее как в наших исследованиях [29, 37, 38], так и в исследованиях других авторов [40–42].

Мы показали также, что вакцинация экспериментальных мышей комплексным препаратом, состоящим из смеси пяти рекомбинантных белков СГВ, приводит к формированию системного гуморального иммунного ответа, и это коррелирует с наличием защиты от СГВ-инфекции у вакцинированных мышей [28].

С помощью программ анализа информационных баз данных BLAST (NCBI) и ExPASy в аминокислотных последовательностях белков были выбраны фрагменты, несущие консервативные иммуногенные В- и Т-клеточные линейные детерминанты. Методом химического синтеза были получены фрагменты ДНК, соответствующие каждой выбранной аминокислотной последовательности, которые были соединены в химерные ДНК-молекулы. Каждая кодировала линейные детерминанты всех пяти белков, половина была снабжена внутренним адъювантом — С-концевым участком молекулы флагеллина. Включение в структуру белка фрагмента флагеллина [43] должно было увеличить иммуногенность рекомбинантных белков, которые по ряду данных нередко обладают недостаточной иммуногенностью [44].

Мы исследовали на мышах протективную эффективность иммунного ответа к полученным вариантам полиэпитопных рекомбинантных белков (Su1–Su4) [29]. С этой целью был использован интенсивный режим иммунизации — четырехкратное подкожное введение белков в присутствии адъюванта. Было показано, что подобный режим иммунизации приводит к синтезу и накоплению значительного количества специфических IgG в сыворотке крови, при этом иммунизированные животные демонстрируют ускоренную динамику очищения от СГВ после внутрибрюшинного заражения.

Для дальнейшего исследования был выбран один из белков Su4 с высокой степенью протективной эффективности, в состав которого не был включен внутренний адъювант-фрагмент флагеллина. Была поставлена цель — изучить его иммуногенные свойства при подкожном введении и при введении через слизистые оболочки.

Проведено сравнение иммунного ответа на белок Su4 при двукратном подкожном, интраназальном и вагинальном способе введения. При всех способах введения белок Su4 был иммуногенен и вызывал накопление специфических IgG в сыворотке крови. Как и следовало ожидать, подкожный способ иммунизации приводил к накоплению в циркуляции максимального количества антител (рис. 2). Первое однократное введение антигена Su4 через слизистые оболочки носа и вагинальной полости также достоверно стимулировало системный иммунный ответ (рис. 2). Показатели накопления специфических IgG антител после бустера не достигли уровня статистической достоверности (рис. 2, b).

Последнее может быть связано с тем, что некоторые мыши давали слабый IgG-ответ на мукозальную иммунизацию. Особенно это было заметно в группе вагинальной вакцинации. Проводя вакцинацию, мы не выравнивали фазу полового цикла у мышей исследуемых групп. Вероятно, у отдельных самок в связи с наличием слизи в вагинальной полости имелись механические препятствия для проникновения антигена через слизистую оболочку, и доза Su4 оказалось недостаточной для индукции регистрируемого системного иммунного ответа. Тем не менее на основании полученных результатов можно заключить, что белок Su4 иммуногенен при подкожном, интраназальном и вагинальном способах введения и способен стимулировать развитие специфического системного гуморального иммунного ответа.

Состав специфических IgG-антител исследован на примере сывороток, полученных после подкожной иммунизации. Системный гуморальный иммунный ответ развивался с преимущественной индукцией IgG1, что характерно для многих белков [45–47] и служит индикатором поляризации иммунного ответа по Th2-типу [48].

IgG1 способны опсонизировать бактерии, связывать комплемент [49], инициируя фагоцитоз бактерий — важнейший механизм защиты от бактериальной инфекции [50].

IgG-подклассы сывороток, полученных после вагинальной и интраназальной вакцинации, не изучены. Этот вопрос требует дополнительных исследований, однако можно предположить, что поляризация иммунного ответа также имеет Th2-направленность, поскольку считается, что профиль подклассов IgG-антител в значительной степени определяется природой антигена [48], а мукозальная иммунизация другими рекомбинантными белками инициирует иммунный ответ по Th2-типу [51].

Принцип создания полиэпитопных химерных молекул решает задачу получения ответа на ряд линейных иммунодоминантных эпитопов разной специфичности в результате иммунизации единой белковой молекулой [52]. Так, в наши задачи входило получение ответа на иммунодоминантные эпитопы пяти различных белков СГВ, объединенных в составе белка Su4. Очевидно, что химерная молекула кроме включенных в нее линейных детерминант может сформировать новые, в том числе пространственные детерминанты, не специфичные в отношении СГВ. Мы проанализировали качественный и количественный состав пула Su4-специфических антител с точки зрения их СГВ-специфичности. С этой целью сыворотки были проанализированы методом иммуноферментного анализа. Каждую сыворотку титровали на планшетах с сорбированными рекомбинантными полипептидами P6, CspA, ScpB, ScaAB, StV, соответствующими рекомбинантным белкам Вас, CspA, ScpB (С5а-пептидаза), ScaAB и SspB1 GBS. Мы показали, что во всех исследованных сыворотках содержались IgG, специфичные в отношении всех пяти полипептидов. Иммунизация полипептидом Su4 в наименьшей степени стимулировала иммунный ответ к полипептиду Р6 (аналог белка Вас). При данном численном основании статистическая достоверность отличий, полученных анти-Р6-титров в иммунных сыворотках, от аналогичного показателя в контроле составила р = 0,26. В целом, полученные данные, однако, свидетельствовали о том, что иммунная сыворотка содержала IgG, специфичные в отношении целевых белков СГВ.

Несмотря на значительные отличия в уровне циркулирующих антител, животные во всех трех экспериментальных группах были защищены от СГВ-инфекции после интраназального заражения. Нам удалось показать (рис. 5), что у всех вакцинированных животных скорость выведения СГВ из легких после интраназального заражения была выше, чем у контрольных мышей.

СГВ представляют наибольшую угрозу в качестве этиологических агентов инфекций новорожденных благодаря бессимптомному носительству у женщин. Мы исследовали способность белка Su4 индуцировать защиту против вагинальной СГВ инфекции после проведенного курса вагинальной вакцинации.

Вагинальная вакцинация мышей рекомбинантным химерным белком Su4 стимулировала иммунный ответ, который обеспечивал ускоренное по сравнению с контролем выведение СГВ из вагинальной полости мышей после вагинального заражения (рис. 6). Отличия в скорости выведения были достоверными в точке 3 ч после вагинального заражения. На более поздних сроках, через 24 и 48 ч у вакцинированных мышей тенденция к ускоренному выведению СГВ сохранилась на фоне начавшегося процесса очищения от СГВ в контроле. Следует отметить, что через 48 ч только в контрольной группе у двух мышей сохранялся высокий титр СГВ в вагинальных смывах. Этот результат соответствует нашим наблюдениям (неопубликованные данные), что после вагинальной СГВ-инфекции у 20 % интактных мышей формируется продолжительное (10–14 дней) носительство СГВ.

Таким образом, мы показали, что полиэпитопный химерный рекомбинантный белок Su4 является иммуногенным при парентеральном способе вакцинации и вакцинации через слизистые оболочки респираторного и вагинального тракта мышей. Индуцированный вакцинацией иммунный ответ обеспечивает повышение устойчивости к СГВ-инфекции, что выражается в ускоренном освобождении мышей от экспериментальной интраназальной и вагинальной СГВ-инфекции по сравнению с контролем.

Следует отметить, что картина ускоренного выведения возбудителя из легких инфицированных животных во всех трех экспериментальных группах была сходной (рис. 5), несмотря на то, что титр сывороточных специфических IgG после введения антигена через слизистые оболочки респираторного и вагинального тракта был достоверно ниже такового после парентеральной вакцинации (рис. 2). Можно представить себе несколько объяснений этому феномену. Во-первых, мы не анализировали уровень секреторных IgA в бронхоальвеолярных и вагинальных смывах. Нельзя исключить, что в группе вакцинации через слизистые оболочки продукция секреторных антител была сопоставима с парентеральным путем введения или даже превосходить его, как это отмечалось в литературе [53]. Во-вторых, протективная эффективность антителопродукции определяется свойствами антител, в частности, их способностью к опсонизации и взаимодействию с рецепторами клеток иммунной системы [54–56]. Возможно, потенциал опсонизации сывороток, полученных после вагинальной и интраназальной вакцинации, сравним с таковым для сывороток с более высоким титром после парентерального введения антигена. Этот вопрос нуждается в дополнительном исследовании.

Заключение

Изучение иммуногенности и протективной эффективности полиэпитопного рекомбинантного химерного белка Su4 позволило установить, что при подкожном, интраназальном и вагинальном способе иммунизации развивается системный IgG-ответ, специфичный в отношении белков СГВ, что повышает устойчивость вакцинированных животных к назальной и вагинальной СГВ-инфекции.

Таким образом, белок Su4 является примером конструирования перспективного мультиэпитопного варианта вакцины для защиты от инфекции, вызванной СГВ.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Исследование было поддержано финансированием Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, Соглашение № 075-15-2022-302 от 20.04.2022.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Этический комитет. Выполнение исследования одобрено Локальным этическим комитетом ФГБНУ «ИЭМ» (протокол № 1/21 от 25 января 2021 г.).

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Наибольший вклад распределен следующим образом: Г.Ф. Леонтьева — проведение экспериментов, обработка результатов, написание текста, подбор литературы; Т.А. Крамская — проведение экспериментов, обсуждение и обработка результатов; И.В. Королева, Е.В. Кулешевич, Н.В. Дуплик — проведение экспериментов; А.Н. Суворов — концепция и руководство работой.

Additional information

Funding source. This research was funded by the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation, grant number 075-15-2022-302, 20 April 2022.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Ethics approval. This study received approval from the Local Ethics Committee of the Institute of Experimental Medicine (protocol No. 1/21, dated January 25, 2021).

Author contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the study, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the article, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the study.

Personal contribution of each author: G.F. Leontieva, conducting experiments, processing results, drafting the manuscript, and selecting relevant literature; T.A. Kramskaya, conducting experiments and discussing results; I.V. Koroleva, E.V. Kuleshevich, and N.V. Duplic, conducting experiments; A.N. Suvorov, conceptual development and project management.

Об авторах

Галина Федоровна Леонтьева

Институт экспериментальной медицины

Email: galeonte@Yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-9876-6594
SPIN-код: 5204-9252

канд. биол. наук, ведущий научный сотрудник отдела молекулярной микробиологии

Россия, 197022, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12

Татьяна Анатольевна Крамская

Институт экспериментальной медицины

Автор, ответственный за переписку.
Email: Tatyana.kramskaya@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-9408-6647
SPIN-код: 4529-3260

канд. биол. наук, старший научный сотрудник отдела молекулярной микробиологии

Россия, 197022, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12

Ирина Владимировна Королева

Институт экспериментальной медицины

Email: IVKoroleva@Yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7966-5130
SPIN-код: 6456-7406

канд. биол. наук, cтарший научный сотрудник отдела молекулярной микробиологии

Россия, 197022, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12

Евгения Владимировна Кулешевич

Институт экспериментальной медицины

Email: k-zh-v@mail.ru
SPIN-код: 6514-2213

канд. биол. наук, научный сотрудник отдела молекулярной микробиологии

Россия, 197022, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12

Надежда Владиленовна Дуплик

Институт экспериментальной медицины

Email: nadezhdaduplik@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-6595-7354
SPIN-код: 6628-3532

канд. биол. наук, научный сотрудник отдела молекулярной микробиологии

Россия, 197022, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12

Александр Николаевич Суворов

Институт экспериментальной медицины

Email: alexander_suvorov1@hotmail.com
ORCID iD: 0000-0003-2312-5589
SPIN-код: 8062-5281

д-р мед. наук, профессор, чл.-корр. РАН, руководитель отдела молекулярной микробиологии

Россия, 197022, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12

Список литературы

Дополнительные файлы