Approaches to the assessment of quantitative composition of drugs based on natural peptides containing glycosaminoglycan-peptide complex

Full Text

СОКРАЩЕНИЯ:

ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография.

Лекарственные средства на основе пептидов известны в фармакологии достаточно давно, а пептиды природного происхождения использовали еще в период до становления фармакологии как науки [1]. Несмотря на то, что пептидные препараты составляют сравнительно небольшую часть рынка лекарственных средств (в Соединенных Штатах Америки зарегистрировано более 60 пептидов, утвержденных управлением по контролю за продуктами и лекарствами), в настоящее время около 140 пептидных препаратов проходят клинические испытания, а доклинические – более 500 [2].

ВВЕДЕНИЕ

На сегодняшний день одну из групп подобных лекарственных средств составляют соединения на основе гликозаминогликан-пептидных комплексов. Некоторые из подобных препаратов предназначены для регенерации хрящевой и костной ткани. При этом механизмы их действия до конца не исследованы. Существует предположение, что, поступая в клетки, низкомолекулярные пептиды животного происхождения выступают в качестве структурных элементов матрикса, участвуют в образовании фибрилл коллагена и протеогликанов, восполняют недостающие компоненты, влияют на формирование тканей [3].

S. Camarero-Espinosa, J.J. Cooper-White [4] высказаны предположения о том, что лекарственные средства, содержащие гликозаминогликаны, служат триггером для запуска процессов направленной дифференциации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток. Клиническая эффективность этих препаратов доказана только на уровне неконтролируемых исследований. Единственное опубликованное рандомизированное контролируемое пятилетнее испытание румалона не выявило доказательств его влияния на прогрессирование остеоартроза тазобедренных и коленных суставов [5]. Гликозаминогликаны используют также в качестве систем доставки факторов роста в поврежденную костную ткань [6, 7] и в качестве матриц-носителей для управляемой доставки в нервную ткань [8].

В отличие от синтетических короткоцепочечных пептидов [3], препараты, выделенные из биоматериала сельскохозяйственных животных и рыб, не могут быть получены в равных соотношениях и концентрациях. Это существенным образом ограничивает исследования их эффективности, а также препятствует регистрации ввиду невозможности воспроизвести состав с достаточной точностью. Y. Pan и другими [9] предприняты попытки разложить подобные смеси на составные части, что позволило установить наиболее активные компоненты. Ими являются хондроитинсульфат (18–49 кДа), гепарансульфат, а также связанный с хондроитинсульфатом фактор роста фибробластов, что, вероятно, и обуславливает восстановление тканей, регенерацию повреждений.

На сегодняшний день исследования, посвященные разработке методик идентификации качественного состава [10] и оценки количественного состава пептидов природного происхождения [11], составляют основу для развития данного научного направления в целом.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Разработать алгоритм количественного определения компонентов пептидов природного происхождения на основе изучения модельных лекарственных средств, содержащих гликозаминогликан-пептидный комплекс.

МАТЕРИАЛЫ

В исследовании использованы следующие лекарственные препараты:

- алфлутоп, раствор для инъекций, ампула 1 мл №10, серия 3381017, годен до 09.2022 (К.О. Биотекнос С.А., Румыния);

- алфлутоп, раствор для инъекций, ампула 2 мл №5, серия 3310418, годен до 03.2021 (К.О. Биотекнос С.А., Румыния);

- румалон, раствор для внутримышечного введения, ампула 1 мл №25, серия 1717751, годен до 11.2022 (К.О. Ромфарм Компани С.Р.Л., Румыния).

Все препараты были приобретены в аптечной сети. Они зарегистрированы на территории Российской Федерации в качестве лекарственных средств и содержат в своем составе гликозаминогликан-пептидные комплексы (из мелкой морской рыбы – алфлутоп; или хрящей и костного мозга молодых телят – румалон), что позволило выбрать их для исследования.

В качестве стандартных образцов использовали:

- хондроитина сульфат натрия (стандарт Европейской Фармакопеи, 250 мг, код Y0000280, серия 2.0, идентификационный номер 000mM8);

- гиалуронат натрия (стандарт Американской Фармакопеи, 250 мг, серия FOM296);

- глюкозамина гидрохлорид (стандарт Американской Фармакопеи, 200 мг, серия GOM183);

- аминокислотный стандарт (NCl0180, Pierce, США).

Количественное определение состава лекарственных средств на основе пептидов природного происхождения было проведено с использованием комплекса методик инфракрасной спектрометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Идентификация компонентов лекарственных препаратов методом ИК-спектроскопии и их сравнение со стандартными образцами проводили с использованием ИК-спектрометра с преобразованием Фурье Cary 630 Agilent, снабженного модулем нарушенного полного внутреннего отражения в области 4000–650 см^-1. После регистрации ИК-спектров производили их обработку с помощью программного обеспечения MicroLabFTIR Software. По результатам наложения полученных спектров и их обработки формировали таблицы с указанием процента совпадения спектра стандартного образца со спектром испытуемого образца. Пробоподготовку проводили в соответствии с требованиями Общей фармакопейной статьи ОФС 1.2.1.1.0002.15 «Спектрометрия в инфракрасной области» [12].

Количественное определение хондроитина сульфата натрия проводили методом турбидиметрического титрования с цетилпиридиния хлоридом согласно требованиям методики количественного определения хондроитина сульфата натрия [13] с использованием титратора автоматического «Т50» в комплекте с фототродом «DP5» фирмы Mettler Toledo (Швейцария).

Содержание хондроитина сульфата натрия (мг/мл) в испытуемых препаратах рассчитывали по формуле:

 

,

где V– объем испытуемого препарата, мл; С – концентрация хондроитина сульфата натрия, определенная по калибровочному графику, мкг/мл.

Количественное определение содержания гиалуроновой кислоты осуществлялось в соответствии с требованиями методики количественного определения гиалуроната натрия [13] спектрофотометрически по реакции с карбазолом.

По калибровочной кривой, построенной по оптическим плотностям каждого из стандартных растворов, определяли средние концентрации D-глюкуроновой кислоты в испытуемых растворах:

 

где с_g – средняя концентрация D-глюкуроновой кислоты в испытуемых растворах, мг/мл; c_s – средняя концентрация испытуемого вещества в испытуемых растворах, мг/мл; Z – определенное процентное содержание С6Н10О7 в D-глюкуроновой кислоте; h – потеря в массе при высушивании, %; 401,3 – относительная молекулярная масса дисахаридного фрагмента; 194,1 – относительная молекулярная масса глюкуроновой кислоты.

Количественное определение содержания глюкозамина осуществлялось методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) согласно методикам, представленным в литературе [14, 15].

Хроматографические условия: колонка Waters µ Bondapak NH2 30 cм, температура колонки – 26±1 ºС; детектор – ультрафиолетовый спектрофотометрический, длина волны 195 нм, скорость потока – 1,3 мл/мин. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,026 М фосфатного буфера KH2PO4 с добавлением 0,25 мл NH4OH рН=7,5 (75:25).

Определение общего белка проводили в соответствии с требованиями Государственной Фармакопеи или Европейской Фармакопеи 8.0 [12, 13]. Использовался колориметрический метод Лоури, основанный на реакции белков с солями меди (II) в щелочном растворе и восстановлении фосфорномолибдено-вольфрамового реактива (реактив Фолина). Интенсивность окраски образовавшихся при этом продуктов определяли по оптической плотности при длине волны 750 нм.

Для расчета содержания белка (Х, мг) в 1 мл препарата с учетом его разведения применяли следующую формулу:

 

где С – концентрация белка, найденная по калибровочной кривой, мг/мл; V – объем препарата, взятого на анализ, мл.

Определение суммарного содержания аминокислот проводили согласно требованиям Европейской Фармакопеи 8.0 [13].

Содержание аминокислот в 1 мл препарата в мкмоль (Х) вычисляли по формуле:

 

где ∑Sак.пр – сумма аминокислот в пробе образца, µмоль/мл; ∑Sак.ст – сумма аминокислот в стандарте аминокислот, µмоль/мл.

Дескриптивные статистические показатели представлены как M – среднее арифметическое и SD – стандартное отклонение.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Установлено, что спектры препарата алфлутоп совпадают со стандартными образцами хондроитина сульфата натрия и гиалуроанта натрия на 73,8±3,4% и 77,5±4,1% соответственно (рис. 1 и 2). При этом совпадение спектров препарата румалон составило 92,2±3,7% и 88,3±2,9% соответственно (рис. 3 и 4). Из-за низкой концентрации хондроитина сульфата натрия в препарате алфлутоп выделение активного вещества из данной лекарственной формы стандартными способами оказалось затруднено.

Содержание хондроитина сульфата натрия в препарате алфлутоп почти в 5 раз ниже в сравнении с препаратом румалон (табл. 1).

Содержание гиалуроновой кислоты в препарате румалон с.1717751 составило 1,42±0,08 мг/мл, в препарате алфлутоп с.3381017 – 0,27±0,08 мг/мл. Заметим, что концентрация гиалуроновой кислоты в препарате румалон была достаточно низкой; при этом значение оптической плотности испытуемых растворов не превышало 0,05.

В серии предварительных исследований было установлено, что присутствующие в модельных препаратах аминокислоты затрудняют определение глюкозамина в исследуемых препаратах спектрофотометрическим методом. В связи с этим для определения истинного содержания глюкозамина использовали метод ВЭЖХ. На рис. 5 показана хроматограмма исходного стандартного раствора глюкозамина гидрохлорида.

Анализ хроматограмм исследуемых препаратов румалон и алфлутоп (рис. 6 и 7) позволил установить содержание в них глюкозамина – 3,6±0,05 и 1,51±0,04 мг/мл соответственно.

При добавлении к препарату алфлутоп 0,5 мл трихлоруксусной кислоты раствор не мутнел, что свидетельствовало об отсутствии белка в данном препарате. Концентрация белка в препарате румалон находилась в пределах 0,36–0,45 мг/мл.

Метод ВЭЖХ позволил выявить в обоих препаратах наличие свободных аминокислот (рис. 8–13)

 

Текущий образец Chondroitin Sulfate Sodium EP RS ID 00mM8

Рис. 3. ИК-спектр румалона с. 1717761 в сравнении со стандартным спектром хондроитина сульфата натрия

Fig. 3. IR spectrum of the drug rumalon s. 1717761 in comparison with the standard spectrum of chondroitin sodium sulfate

 

Текущий образец Sodium Hyaluronate USP RS LOT FOM296

Рис. 2. ИК-спектр препарата алфлутоп с. 3381017 в сравнении со стандартным спектром гиалуроната натрия

Fig. 2. IR spectrum of the drug alflutop s. 3381017 compared to the standard spectrum of sodium hyaluronate

 

Текущий образец Chondroitin Sulfate Sodium EP RS ID 00mM8

Рис. 1. ИК-спектр препарата алфлутоп с. 3381017 в сравнении со стандартным спектром хондроитина сульфата натрия

Fig. 1. IR spectrum of the drug alflutop s. 3381017 in comparison with the standard spectrum of chondroitin sodium sulfate

 

Текущий образец Sodium Hyaluronate USP RS LOT FOM296

Рис. 4. ИК-спектр румалона с. 1717761 в сравнении со стандартным спектром гиалуроната натрия

Fig. 4. IR spectrum of the drug rumalon s. 1717761 in comparison with the standard spectrum of sodium hyaluronate

 

Рис. 5. Хроматограмма исходного стандартного раствора глюкозамина гидрохлорида с временем удерживания 3,352 мин

Fig. 5. Chromatogram of the initial standard glucosamine hydrochloride standard solution with a retention time of 3.352 min

 

Румалон с.1717751		Румалон с.1717761		Алфлутоп с.3381017
Средний объем титранта, мл	Содержание ХС, мг/мл	Средний объем титранта, мл	Содержание ХС, мг/мл	Средний объем титранта, мл	Содержание ХС, мг/мл
5,59±0,21	1,904±0,024	5,62±0,36	1,914±0,041	2,44±0,13	0,402±0,029

Табл. 1.

Результаты турбидиметрического титрования по определению содержания хондроитина сульфата натрия (ХС) в исследуемых модельных препаратах, M±SD

Tabl. 1.

The results of turbidimetric titration for determination of the content of chondroitin sodium sulfate (cholesterol) in the studied model preparations, M±SD

 

Рис. 7. Хроматограмма препарата алфлутоп с. 3310418. Время удерживания глюкозамина гидрохлорида 3,307 мин

Fig. 7. Chromatogram of the drug alflutop s. 3310418. Glucosamine hydrochloride retention time 3.307 min

 

Рис. 8. Хроматограмма аминокислотного стандарта

Fig. 8. Chromatogram of the amino acid standard

 

Рис. 6. Хроматограмма препарата румалон с. 1717761. Время удерживания глюкозамина 3,353 мин

Fig. 6. Chromatogram of the drug rumalon s. 1717761. Glucosamine retention time 3.353 min

 

Рис. 9. Хроматограмма исходного препарата румалон с.1717761 после дериватизации

Fig. 9. Chromatogram of the initial drug rumalon s.1717761 following derivatization

 

Рис. 12. Хроматограмма гидролизованного препарата румалон с.1717761 после дериватизации

Fig. 12. Chromatogram of the hydrolyzed drug rumalon s.1717761 following derivatization

 

Рис. 10. Хроматограмма исходного препарата румалон с. 1717761 после дериватизации

Fig. 10. Chromatogram of the starting drug rumalon s. 1717761 following derivatization

 

Рис. 11. Хроматограмма исходного препарата алфлутоп с.3310418 после дериватизации

Fig. 11. Chromatogram of the initial drug alflutop s. 3310418 following derivatization

 

Рис. 13. Хроматограмма гидролизованного препарата алфлутоп с. 3310418 после дериватизации

Fig. 13. Chromatogram of the hydrolyzed drug alflutop s. 3310418 following derivatization

 

Установлено, что после кислотного гидролиза исследуемых образцов общее количество аминокислот увеличилось с 1,22±0,11 до 3,3±0,24 мкмоль/л для румалона и с 10,98±0,47 до 17,6±0,72 для алфлутопа. Это позволяет прийти к заключению о достаточно большом представительстве короткоцепочечных пептидов и/или свободных аминокислот в исходных образцах исследованных лекарственных препаратов (37–62%).

Количественный состав модельных лекарственных средств, содержащих гликозаминогликан-пептидный комплекс, представлен в табл. 2.

 

Препарат	Содержание аминокислот, мкмоль/мл
	Свободные аминокислоты	После гидролиза	Количество, приходящееся на пептиды
Румалон с. 1717761	1,22±0,11	3,3±0,24	2,08±0,16
Алфлутоп с.3310418	10,98±0,47	17,6±0,72	6,62±0,31

Табл. 2.

Результаты определения суммы аминокислот в испытуемых лекарственных препаратах, M±SD

Tabl. 2.

The results of determining the amount of amino acids in the tested drugs, M±SD

Показатель	Румалон	Алфлутоп
Количественное определение хондроитина сульфата натрия, мг/мл	1,904±0,024 (с.1717751)	0,402±0,029 (с.3381017)
	1,914±0,041 (с.1717761)
Количественное определение гиалуроновой кислоты, мг/мл	1,42±0,08 (с.1717751)	0,27±0,08 (с.3310418)
Количественное определение глюкозамина методом ВЭЖХ, мг/мл	3,60±0,05 (с.1717761)	1,51±0,04 (с.3310418)
Определение белка, мг/мл	0,36±0,01 (с.1717751)	Не определяется
	0,45±0,03 (с.1717761)
Определение свободных аминокислот, мкмоль/мл	1,22 (с.1717761)	10,98 (с.3310418)
Определение аминокислот, входящих в состав пептидов	2,06 (с.1717761)	6,62 (с.3310418)

 

Из табл. 2 следует, что содержание основных компонентов исследованных пептидов природного происхождения представлено в достаточно малых количествах.

Известно, что большинство зарегистрированных на территории Российской Федерации монокомпонентных лекарственных средств содержат хондроитина сульфата натрия в концентрации 100 мг/мл (артогистан, инъектран, хонсат, артравир инкамфарм, драстоп, хондроксид, хондрогард, мукосат, хондромед-лекфарм и др.). Монокомпонентные лекарственные препараты глюкозамина в качестве раствора для внутримышечного введения содержат действующее начало в концентрациях 200 мг/мл (сустагард артро, эльбона, дона). Монокомпонентные лекарственные препараты содержат гиалуроновую кислоту в концентрации 10 мг/мл (гиалган фидия).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что в исследованных препаратах (хондроитина сульфат, глюкозамин и гиалуроновая кислота) количество активных компонентов в 50, 100 и 7 раз меньше их значений в монопрепаратах.

ВЫВОДЫ

Одной из возможных гипотез, объясняющих эффективность подобных соединений, следует считать оценку взаимодействия активных компонентов в составе комбинированных средств. При этом тип взаимодействия активных компонентов, вероятнее всего, будет синергетичным.

Другим возможным объяснением эффективности подобных лекарственных средств может служить наличие в их составе факторов роста и/или компонентов, инициирующих необходимую дифференцировку мезенхимальных стромальных клеток в зоне повреждения.

Предложенный алгоритм количественного определения компонентов пептидов природного происхождения, включающего в себя последовательность распространенных и общедоступных методик (идентификация образцов методом ИК-спектроскопии в сравнении со стандартными образцами; количественное определение хондроитина сульфата натрия, гиалуроновой кислоты, глюкозамина, белка и аминокислот методами ИК-спектроскопии и ВЭЖХ), может быть использован для определения минимальных значений активных компонентов и адъювантов пептидов природного происхождения при их исследованиях и регистрации в качестве лекарственных препаратов.

About the authors

Nikolai G. Vengerovich

Saint-Petersburg State Chemical and Pharmaceutical University; Institute of Military Medicine, Russian Federation of Ministry of Defense

Author for correspondence.
Email: nickolai.vengerovich@pharminnotech.com
SPIN-code: 6690-9649
Scopus Author ID: 511722

Doctor of Medicine (MD), Professor of the Industrial Ecology Department, Deputy Head of Department State Research

Russian Federation, 197376, St. Petersburg, Professor Popov, house 14, lit. A; 195043, St. Petersburg, Lesoparkovaya, house 4

Nikolai V. Efimov

Negosudarstvennoe uchrezhdenie zdravoohraneniia "Dorozhnaia klinicheskaia bolnitca na stantcii Cheliabinsk otkrytogo aktcionernogo obshchestva "Rossiiskie zheleznye dorogi"

Email: nvef@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0002-7703-0190
ResearcherId: X-1354-2019

Doctor of Medical Sciences, Professor, head of clinical research Department

Russian Federation, 195271, St. Petersburg, Prospect Mechnikova, 27

Natalia I. Rogozhina

Peoples' Friendship University of Russia

Email: rogozhina26@gmail.com

master student

Russian Federation, 117198, Moscow, Miklukho-Maklaya str. 6

Vladimir I. Stepchenkov

Peoples' Friendship University of Russia

Email: vstepchenkov@icloud.com

master student,

Russian Federation, 117198, Moscow, Miklukho-Maklaya str. 6

References

Supplementary files