Pathogenic substantiation of application of erythropoietin modified forms and peptide analogues as cytotprotectors

Full Text

Экстремальные факторы химической и радиационной этиологии вызывают структурные и функциональные изменения в клетках, приводящие к их гибели. Причем механизм повреждений в обоих случаях имеет сходный характер. В результате воздействия ионизирующего излучения образуются свободные радикалы, которые способствуют повреждению ДНК и запуску процесса апоптоза. Изменения в пуле размножающихся элементов (миелобласты, промиелоциты, миелоциты) обусловлены интерфазной гибелью клеток.

СОКРАЩЕНИЯ:

ГКСФ – гранулоцитарный колониестимулирующий фактор;

ГМ-КСФ – гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ);

ИЛ – интерлейкин;

Эпо – эритропоэтин;

asialoEPO – десиалированное производное эритропоэтина;

CEPO – карбоксилированное производное эритропоэтина;

EPOR – гемопоэтический рецептор;

GEPO – глутаральдегидное производное эритропоэтина.

ВВЕДЕНИЕ

Большинство синтетических противоопухолевых препаратов (антибиотики антрациклинового ряда, соединения алкилирующего типа действия, антиметаболиты) также оказывают влияние на активно пролиферирующие клетки и индуцируют апоптоз. Например, алкилирующие агенты (циклофосфан, циклофосфамид, сарколизин) способны ковалентно присоединять алкильные радикалы к активным группам нуклеотидов. Алкилированию подвергаются азотистые (пуриновые и пиримидиновые) основания, фосфатные группы молекулы ДНК. В результате нарушаются процессы репликации и транскрипции ДНК, возникают митотические блоки, подавляется синтез РНК и белка, что приводит к несбалансированному росту и гибели клеток.

Алкилирующие агенты поражают активно пролиферирующие клетки костного мозга, что приводит к миелосупрессии. В результате снижаются показатели лейко- и тромбоцитопоэза, абсолютное число Т- и В-лимфоцитов, подавляется пролиферация лимфоцитов, ингибируется синтез антител. Кроме того, в результате гидролитического расщепления некоторых алкилирующих агентов могут образовываться ониевые соединения, обладающие высокой реакционной способностью. При ионизации воды формируются активные свободные радикалы и перекисные соединения, воздействие которых на клетки сходно с эффектом ионизирующих излучений («радиомиметический синдром»). Нарушаются процессы пролиферации и дифференцировки клеток костного мозга, развивается атрофия лимфоидной ткани. В селезенке и лимфатических узлах отмечают резко выраженный склероз. Супрессивное действие алкилирующих агентов подавляет как клеточный, так и гуморальный компонент иммунной системы организма. Снижение иммунных свойств вследствие лейкопении и истощения организма повышает вероятность инфекционных осложнений.

В настоящее время в качестве лечебно-профилактических средств, предназначенных для терапии осложнений лучевой терапии и воздействия алкилирующих веществ, рассматриваются биополимеры микробного происхождения, антиоксиданты, стероиды и цитокиновые факторы роста. При этом наибольший практический интерес представляют колониестимулирующие факторы, которые действуют на относительно дифференцированные клетки – предшественники гемопоэза: эритропоэтин (Эпо), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (ГКСФ), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ).

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Обобщить и систематизировать фактическую информацию об эффектах Эпо и его пептидных аналогов в качестве цитопротекторов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Эритропоэтин, входящий в суперсемейство цитокинов 1-го типа, играет ключевую роль в продукции эритроцитов. Структурно Эпо состоит 4 α-спиралей (A–D), соединенных петлями. Одна молекула Эпо взаимодействует с предварительно димеризированным Эпо-рецептором через два отдельных сайта связывания: сайт-1, который локализован в области спиралей A, B, и D и части AB-петли, и сайт-2, локализованный в области петель A и C (рис. 1).

 

Рис. 1. Схема взаимодействия Эпо с EPOR и каскад внутриклеточных событий

Fig. 1. Scheme of interaction of Epo with EPOR and the cascade of intracellular events

 

Эпо оказывает действие через гемопоэтический рецептор (EPOR), представляющий собой гомодимер, состоящий из двух идентичных субъединиц и поддерживающий гемопоэз в ответ на уровень циркулирующего Эпо порядка 1–10 пМ [1].

В настоящее время применение Эпо рекомендовано при комбинированных или сочетанных радиационных поражениях, сопровождающихся длительно персистирующей анемией, а также для ускорения восстановления уровня тромбоцитов в крови. При однократном введении в дозе 7 Гр через 24 ч после облучения крыс радиозащитный эффект Эпо проявлялся в увеличении выживаемости, ослаблении выраженности миелосупрессии и панцитопении, увеличении числа лимфоцитов и лейкоцитов в периферической крови и клеточного состава костного мозга и селезенки. На фоне применения Эпо, за счет повышающей регуляции противовоспалительного подтипа α-7 Н холинорецепторов (α-7-nAChR), активации антиапоптозного внутриклеточного сигнального пути через фермент Янус-киназа-2 (JAK-2), передатчик сигнала и активатор транскрипции 3 (STAT-3), уменьшаются показатели индуцированного облучением оксидативного стресса. Также активируется ядерный фактор, связанный с ядерным эритроидным фактором-2 (Nrf-2), участвующим в цитопротекции. Таким образом, каскад внеклеточных и внутриклеточных сигнальных молекул α-7-nAChR-JAK-2/STAT-3-Nrf-2 вовлечен в реализацию лечебного эффекта Эпо при облучении.

Применение Эпо в качестве гемопоэтического фактора при облучении, а также при воздействии алкилирующими веществами представляет практический интерес. В последнее время все больше внимания в научной литературе уделяют некроветворным эффектам Эпо. В частности, его трофическому, нейропротекторному и тканезащитному действию в различных моделях повреждения клеток.

1. Негемопоэтические эффекты Эпо

В последние годы стало очевидным, что Эпо обладает рядом биологических эффектов, которые могут быть обозначены как антагонистическое действие в отношение провоспалительных цитокинов и их негативного влияния при повреждении тканей [2]. Эти эффекты проявляются трофическим и нейропротективным действием [3].

При реализации негемопоэтического эффекта Эпо продуцируется локально, в непосредственной близости от места повреждения. Перекрестное взаимодействие между циркулирующим и локальным тканезащитным пулами Эпо не происходит из-за наличия изоформ Эпо-рецептора, значительно различающихся по своему сродству к цитокину. В противоположность этому рецептор тканезащитного эффекта Эпо постулирован как гетеромер, состоящий из EPOR в комплексе с субъединицей CD131 (так называемый общий β рецептор), входящий в состав рецепторов цитокинов 1-го типа (GM-CSF, интерлейкин-3 (ИЛ-3), ИЛ-5 и др.) (рис. 2) [4].

 

Рис. 2. Схема взаимодействия Эпо с EPOR*EPOR кроветворных тканей и с гетеродимерным EPOR βcR некроветворных тканей

Fig. 2. Scheme of interaction of Epo with EPOR of hematopoietic tissues and with heterodimeric EPOR βcR of non-blood-forming tissues

 

Рецептор тканезащитного эффекта обладает меньшим сродством к Эпо (2 20 нM) и поэтому не отвечает на концентрации Эпо, присутствующие в плазме крови, а только на относительно высокие уровни локально вырабатываемого Эпо. Важное функциональное разделение между гематопоэтической и тканезащитной системой проистекает из различий в базальной экспрессии соответствующих рецепторов. Участвующий в гемопоэзе гомодимер продолжительно экспрессируется популяциями клеток-предшественников кроветворения, которые для своего выживания требуют постоянной концентрации циркулирующего Эпо. В противоположность этому тканезащитный рецептор обычно экспрессируется только в случае повреждения или выраженного метаболического стресса и требует кратковременного воздействия Эпо для запуска пролонгированного биологического эффекта [2].

Цитопротективный эффект Эпо показан на различных моделях повреждения тканей: ишемизированных кожных лоскутах [5], ишемия-реперфузии в кожно-мышечных лоскутах [6], операционных ранах и кишечных анастомозах, а также на моделях неишемизированных, инфицированных ран [7], при ишемическом поражении головного мозга и компрессионных поражениях спинного мозга. В других моделях Эпо увеличивает формирование и качество грануляционной ткани [8]. Активация Эпо-рецепторов ЦНС (EpoRs) предотвращает апоптоз, вызванный NMDA или NO посредством активации Jak-2, NF-κB-опосредованную транскрипцию нейропротективных генов, а также фосфорилирование ингибитора NF-κB (IκB) с последующей транслокацией фактора транскрипции NF-κB в ядро [9].

В экспериментах на культурах клеток и моделях неврологических заболеваний животных продемонстрирован нейропротективный эффект Эпо [10]. На модели внутричерепного кровотечения у мышей введение рекомбинантного Эпо приводило к уменьшению повреждения посредством двух механизмов. Во-первых, цитокин уменьшал гибель клеток путем апоптоза через угнетение экспрессии TNF-α, Fas и мРНК Fas-L и ингибирование активности каспазы-8, -9 и -3. Во-вторых, Эпо увеличивал экспрессию эндотелиальной NO-синтазы [9] и сигнальных модекул p-eNOS, pAkt, pSTAT3 и pERK, которые считаются факторами регенерации и выживания нейронов [11].

Доступной информации о безопасности и эффективности Эпо в терапии инсульта немного, и она противоречива. Многоцентровое рандомизированное клиническое исследование, проведенное в Германии в 2009 году, было отменено из-за влияния вмешивающегося фактора – рекомбинантного активатора плазминогена, который применялся совместно с Эпо у большинства пациентов [12].

2. Побочные эффекты эритропоэтина, ограничивающие его применение

2.1 Влияние эритропоэтина на неопластические процессы

Стимуляция эритропоэза связана с воздействием Эпо на соответствующие рецепторы клеток – предшественников эритропоэза с запуском последовательности сигнальных событий (ингибирование апоптоза, стимуляция пролиферации и дифференцировки). В то же время обнаружение Эпо-рецепторов в клетках опухолей позволяет выдвинуть предположение о возможной стимуляции роста опухолевой ткани при экзогенном введении Эпо [13].

Установлено, что множество типов опухолевых клеток экспрессирует Эпо-рецепторы, и показано, что Эпо-миметики пептидной природы EMP-1, EMP-9 способствуют выживанию трансплантированных мышам опухолевых клеток, тогда как антагонисты Эпо-рецептора блокируют их пролиферацию [14]. Также показано, что Эпо является митогеном для ряда опухолевых клеток [15].

Таким образом, применение Эпо потенциально может провоцировать развитие неопластического процесса или на фоне существующего процесса способствовать его прогрессированию.

2.2 Аутоиммунные реакции, потенциально связанные с применением эритропоэтина

Аутоиммунная истинная эритроцитарная аплазия является редким осложнением терапии препаратами Эпо и его производными, в частности конденсированными димерами с другими ростовыми факторами. Пик возникновения подобных случаев приходится на начало 2000-х годов и мог быть обусловлен появлением на рынке новых дженериков Эпо низкого качества. Эритроцитарная аплазия характеризуется тяжелой анемией (требующей гемотрансфузии), ретикулоцитопенией, пониженным содержанием либо отсутствием эритробластов в красном костном мозге, циркуляцией антиЭпо антител. Подход к терапии данной патологии заключается в применении пептидных Эпо-миметиков, не обладающих кросс-реактивностью с антиЭпо антителами [16].

Одной из возможных причин формирования представлений об аутоиммунных осложнениях при применении Эпо являются результаты экспериментов на животных, которым вводили человеческий Эпо. Было установлено, что после введения коммерческих препаратов рекомбинантного Эпо животным у них возникали соответствующие антитела, которые нейтрализовали эффект препаратов, угнетали эндогенный Эпо и приводили к тяжелой аутоиммунной анемии, которая осложняла интерпретацию результатов исследования хронической токсичности рекомбинантного Эпо у животных [17]. По сообщению T. Mennini, et al., у мышей 3–4-недельное дозирование Эпо (CEPO) приводило к формированию антител к эндогенному Эпо и снижению гематологических показателей [18].

Несмотря на то, что аутоиммунные реакции являются редкими при терапии человеческим Эпо в клинике, потенциальная тяжесть этих осложнений требует повышенного внимания к данному вопросу и определяет жесткие требования к технологии получения препарата, направленные на снижение его иммуногенности.

2.3 Влияние эритропоэтина на уровень артериального давления

Обзор сведений о воздействии препаратов Эпо на артериальную гипертензию, мозг и некоторые психофизио- логические показатели, сексуальную функцию и общую продолжительность жизни представлены в работе A.R. Nissenson [19].

3. Модификации эритропоэтина с селективным тканезащитным эффектом

Применение Эпо в тканезащитных дозах сопровождается отмеченными выше побочными эффектами, увеличением вязкости крови и повышением тромбообразования [20]. Для преодоления развития нежелательных явлений были разработаны препараты, обладающие более высокой специфичностью к тканезащитному подтипу Эпо-рецептора и лишенные эффектов, связанных со стимуляцией системы гемопоэза. Изменения структуры Эпо, включая замену аминокислотных остатков или их химическую модификацию, приводят к снижению его аффинности к гомодимерной изоформе рецептора кроветворных тканей (EPOR*EPOR) при сохранении возможности связываться с гетеродимерным рецептором некроветворных тканей, опосредующим его тканезащитное действие [4].

К числу таких препаратов относятся asialoEPO – десиалированное производное Эпо, CEPO – карбоксилированное производное Эпо [21], GEPO – глутаральдегидное производное Эпо, и пептиды, воспроизводящие отдельные участки аминокислотной последовательности цитокина. Исследования препаратов привели к пониманию еще больших различий в биологической роли эритропоэтического и тканезащитного рецептора. Гематопоэтические Эпо-рецепторы трансформируют эндотелий в протромботическое состояние, увеличивают количество и реактивность тромбоцитов, увеличивают системное артериальное давление вследствие спазма гладкой мускулатуры сосудов. Активация тканезащитного Эпо-рецептора не приводит к этим эффектам [22].

3.1. Тканезащитные эффекты модифицированного Эпо (asialoEPO, СЕРО и GЕРО)

Модифицированный эритропоэтин (asialoEPO), лишенный сиаловых кислот, при введении в организм быстро разрушается в крови, не оказывает влияния на эритроцитарное звено гемопоэза, но обладает тканезащитным действием.

Цитопротективное действие asialoEPO продемонстрировано на модели повреждения кардиомиоцитов, вызванного цитостатиком [23], на модели пневмосклероза, вызванного блеомицином [24], на модели бокового амиотрофического склероза при ишемических и компрессионных повреждениях головного и спинного мозга, на модели ишемии-реперфузии миокарда [25] и почек [26], на модели ишемии-реперфузии мозга, вызванной окклюзией среднемозговой артерии [27] и двусторонней окклюзией сонных артерий [28], на модели токсической кардиомиопатии, вызванной доксорубицином [29], а также на модели генетически обусловленной кардиомиопатии [29].

Кроме того, препарат стимулирует дифференцировку клеток – предшественников олигодендроцитов в головном мозге крыс после перинатальной гипоксии-ишемии, обладает нейропротективным, тканезащитным и противоапоптотическим эффектами за счет снижения экспрессии провоспалительных цитокинов TNF-α и IL-6 на модели грыжи поясничного отдела позвоночника [30] и ишемии-реперфузии тонкой кишки [31].

В отношении СЕРО показан нейропротективный эффект в ряде моделей нейротоксичности у животных, включая ишемический инсульт, сдавление седалищного нерва, сдавление спинного мозга, периферическую нейропатию [21]. В исследованиях на крысах и мышах показано отсутствие влияния препарата на эритропоэз даже после длительного применения в высоких дозах [21].

В дальнейшем на различных моделях поражений головного и спинного мозга было подтверждено, что нейропротективное действие СЕРО также связано с его противовоспалительным и противоапоптозным эффектом: травматическое повреждение мозга [32], множественный ишемический инсульт, частичная перерезка спинного мозга [33], повреждение спинного мозга при ишемии/реперфузии [34] и фокальная ишемия головного мозга [33, 35]. В относительно недавних исследованиях показан нейропротективный эффект СЕРО на моделях таких заболеваний ЦНС, как болезнь Альцгеймера [36], болезнь Паркинсона [37] и перивентрикулярная лейкомаляция [38].

Тканезащитный эффект СЕРО продемонстрирован при терапии инфицированных ран, язвенных пролежней (рекуррентная ишемия-реперфузия) и перитонита [7]. Цитопротективный эффект СЕРО, связанный с активацией сигнального пути PI3-K/Akt, показан на модели хронической сердечной недостаточности у крыс, вызванной введением изопротеренола [39], и на модели ишемии-реперфузии почек у крыс [40]. Нейропротективный эффект СЕРО установлен на моделях нарушений обучения и памяти у крыс, вызванных интра- гиппокампальным введением амилоидного пептида. Нейропротективные механизмы CEPO связаны с модуляцией активности факторов P38, ERK, MMP-2 и восстановлением активности сигнального пути Akt/GSK-3β [41].

На модели кардиомиопатии у крыс, вызванной богатой углеводами и жирами пищей и введением стрептозоцина, СЕРО уменьшал выраженность апопотоза миокарда и сохранял целостность внутриклеточных структур. Отмечено ингибирование экспрессии каспазы-3 и белка Bcl-xl (маркеры апоптоза), а также увеличение уровня экспрессии PI3K (p85) и Akt1 на уровне РНК и белка [42]. На модели диабетической ретинопатии, вызванной введением стрептозоцина, СЕРО уменьшал величину отека, число микроаневризмов сосудов сетчатки, а также снижал экспрессию глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) и эндотелиального фактора роста сосудов (VEGF-A) [43].

На модели диффузного повреждения мозга у крыс (модель ускорения при ударе) СЕРО снижал выраженность отека мозга, повышал порог открытия митохондриальной поры переменной проницаемости (mPTP), снижал выраженность морфологических признаков разрушения митохондрий в астроцитах и уменьшал экспрессию каспазы-3 (маркер апоптоза) [44].

Профилактическое введение крысам СЕРО приводит к ингибированию экспрессии про-апоптогенного белка CC3 в мозге и регулирует соотношение Bcl-2/Bax, что в конечном счете ограничивает апоптоз нейронов и характеризуется защитным эффектом на модели внутриматочной гипоксии-ишемии [45].

CEPO обладает и радиозащитным действием. В дозе 50 мкг/кг при курсовом внутрибрюшинном введении в течение 10 дней цитокин улучшал функциональное состояние крыс, в том числе функции высшей нервной деятельности, и ограничивал область некроза мозга после облучения отдельных областей головы животных в дозах до 100 Гр [46]. В то же время применение СЕРО после облучения мозга крысят в дозе 6 Гр не способствовало улучшению показателей, характеризующих интенсивность нейрогенеза [47], но достоверно снижало число клеток с апоптозом с 25 до 15% по сравнению с контролем [48].

Несмотря на достаточный массив экспериментальных данных, подтверждающий нейропротективный и тканезащитный эффекты СЕРО на различных моделях повреждения головного и спинного мозга, механизмы этого эффекта остаются во многом неизученными. При изучении механизмов нейропротективного действия СЕРО на модели in vitro депривации глюкозы и кислорода культуры клеток первичных нейронов и на модели in vitro гипоксии-реоксигенации у мышей было показано, что цитокин активирует протеинкиназу В (AKT) посредством глиального нейротрофического фактора (GDNF).

Рецептором СЕРО в тканях головного мозга является гетеродимерный комплекс, состоящий из субъединицы общего β-рецептора (CD131) и субъединицы Эпо-рецептора. Фармакологическая блокада CD131-рецептора и/или продукции GDNF или рецептора GDNF нивелирует нейропротективное действие СЕРО. Таким образом, цитопротективный эффект CEPO в нейрональной ткани реализуется через сигнальный путь CD131/GDNF/AKT [49]. Кроме того, эффекты Эпо и СЕРО в некроветворных тканях опосредуются гетеродимерным рецептором, состоящим из Эпо-субъединицы и общей β-субъединицы цитокиновых рецепторов (EPOR*βcR). Эта субъединица входит также в состав рецепторов цитокинов 1-го типа ГМ-КСФ, ИЛ-3, ИЛ-5 [50].

Эпо опосредует антиапоптозный эффект в дифференцированных клеточных линиях SH-SY5Y и PC-12 за счет связывания с классическим гомодимерным Эпо-рецептором [51], в которых не экспрессируется βcR. Прямое подтверждение участия тех или иных подтипов рецепторов в реализации нейропротективного эффекта Эпо получено методами фармакологического зондирования. Эффекты Эпо полностью блокировались введением антител к EPOR и ослаблялись в присутствии антител к βcR [52].

Предполагается, что как гомодимерные EPOR*EPOR, так и гетеродимерные EPOR*βcR могут быть вовлечены в реализацию нейропротективной активности Эпо в различных типах нервных клеток. Установлено, что СЕРО не связывается с классическим EPOR и может связываться только с гетеродимером EPOR*βcR [52].

В исследованиях in vitro B. Sturm, et al. [53] показал, что СЕРО увеличивает экспрессию белка фратаксина, играющего важную роль в работе митохондрий и связанного с развитием болезни наследственной атаксии Фридрейха, в культуре эритролейкемических клеток K562 и в не экспрессирующей EPOR-линии клеток моноцитарной лейкемии THP-1. Это указывает на то, что, во-первых, эффект СЕРО на уровень экспрессии фратаксина не зависит от участия классических EPOR и, во-вторых, на клетках моноцитарно-лейкоцитарного звена может присутствовать тканезащитная изоформа EPOR*βcR, с которой связывается СЕРО.

Показано, что СЕРО увеличивает уровень пролиферации клеток в культуре первичных эмбриональных нейронов мыши после депривации кислорода и глюкозы, но не обладает таким же эффектом в линии клеток Neuro-2a, в которых не экспрессируются βcR. Эти данные подтверждают участие βcR в реализации эффектов СЕРО в клетках, не относящихся к эритроцитарному звену гемопоэза.

В аспекте нейропротекции СЕРО, по-видимому, активирует те же антиапоптотические сигнальные пути, что и Эпо. В клеточной линии нейробластомы SH-SY5Y показаны сходные механизмы, опосредованные Jak-2 и PI3K, в реализации антиапоптотического действия как Эпо, так и СЕРО [52].

Действие СЕРО по усилению роста аксонов и формированию дендритных шипиков сопровождается повышением экспрессии двух известных постсинаптических белков Shank2 и Shank3 за счет повышающей регуляции CREB-связывающего белка (CBP) и E1A-связанного белка (p300), гистоновой ацетилтрансферазы, которая ацетилирует гистоны и, таким образом, регулирует функции нейрона. Сигнальный путь от СЕРО к CBP/p300 включает фосфорилирование STAT-3 (передатчик сигнала и активатор транскрипции 3), Erk (внеклеточная сигнал-регулируемая киназа) и AKT [54], тогда как в клетках линий UT-7 и TF-1 СЕРO вызывает фосфорилирование Jak-2, но не вызывает активации сигналов запуска пролиферации клеток, таких как Erk1/2, ядерный фактор-κB и STAT-5.

Отмечается, что различия в эффектах СЕРО и Эпо могут быть связаны с некоторыми критическими точками во внутриклеточных сигнальных путях. M. E. Chamorro, et al. [52] показано, что СЕРО блокирует фосфорилирование транскрипционного фактора семейства Forkhead FOXP3 и не вызывает последующей понижающей регуляции p27kip1 в клетках линий UT-7 и TF-1. В противоположность этому активация пролиферации клеток Эпо сопровождается увеличением фосфорилирования FOXO3a и снижением регуляции его мишени на пути распространения внутриклеточного сигнала p27kip1.

Все вышеперечисленные механизмы действия CEPO указывают на вовлеченность множества сигнальных путей в реализацию биологических эффектов, хотя полностью их не раскрывают.

Помимо CEPO, цитопротективным и антиапоптозным действием обладает GEPO. Разработанная модифицированная форма Эпо лишена эритропоэтической активности, но оказывает выраженное тканезащитное действие. Эффективность GEPO показана in vitro в культуре клеток линий P19 и HEK293. GEPO связывается с гетеродимерным рецептором IL3RB*EPOR, который в последующем запускает сигнальный путь Bcl-2 (маркер антиапоптозной активности). Кроме того, в реализацию эффектов GEPO может быть вовлечена сигнальная молекула Jak-2, поскольку применение ее ингибитора AG490 подавляло активацию Bcl-2.

Цитопротективное действие GEPO, которое проявлялось на гистологическом и функциональном уровне [55], а также на модели цитотоксического действия наночастиц серебра в культуре клеток почки HEK293, показано на модели повреждения почек в результате ишемии-реперфузии. GEPO увеличивает число выживших клеток, предотвращает развитие выраженных альтераций морфологии клеток и сохраняет их пролиферативную активность и, кроме того, снижает выраженность процессов оксидативного стресса (генерации реактивных форм кислорода) и повышает экспрессию антиапототического белка Bcl2 [56].

3.2 Пептидные производные эритропоэтина, обладающие тканезащитными свойствами

Наибольший интерес представляют пептидные производные Эпо, объединяющие две большие группы – Эпо-миметики и пептиды с тканезащитным действием. Первая группа пептидов не воспроизводит участков последовательности аминокислот исходного белка, однако связывается с кроветворным Эпо-рецептором и запускает каскад процессов, приводящих к стимуляции гемопоэза. Пептиды второй группы частично повторяют последовательность аминокислот участка Эпо, ответственного за связывание с тканезащитными рецепторами, и оказывают защитное действие на моделях повреждения тканей.

В настоящее время разработан и активно исследуется пептид Helix-B, представляющий собой аминокислотную последовательность участка 58–82 молекулы Эпо (QQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLV). Пептид Helix-B обладает свойствами нейропротектора in vitro и тканепротектора in vivo в различных моделях, включая ишемический инсульт, диабетический отек сетчатки, травму периферических нервов. Вероятно, пептид может выступать в качестве факторов роста. По своему нейропротективному действию на каинатной модели эффективность Helix-B была схожа с Эпо (в опытах in vitro в концентрации 5 нг/мл эффект равен 100 нг/мл Эпо). В опытах in vivo пептид в дозе 4,4 мкг/кг оказывал эффект по ограничению объема инсульта, аналогичный CEPO в дозе 44 мкг/кг, и улучшал функцию нерва при диабетической нейропатии [4].

На основе Helix-B синтезированы короткоцепочечные пептиды, состоящие из смежных аминокислот. Наибольшая активность среди производных Helix-B отмечена у препарата HBSP (peptide G). Схема взаимодействия Эпо с рецептором кроветворных тканей, объясняющая теоретические предпосылки для разработки тканезащитных пептидов, представлена на рис. 3, 4.

 

Рис. 3. Схема взаимодействия Эпо и Эпо-рецептора кроветворных тканей: А, B, C, D – «глобулы» белка; области 1 и 2 – критические области для взаимодействия с рецептором кроветворных тканей (по [4])

Fig.3. Scheme of interaction of Epo and Epo-receptor of blood-forming tissues: A – A, B, C, D – “globules” of the protein; areas 1 and 2 are critical areas for interaction with the hematopoietic tissue receptor (according to [4])

 

Рис. 4. Участок аминокислотной последовательности Helix-B, не участвующий во взаимодействии с рецептором, а также логика разработки пептида HBSP. Нижний ряд – производное с пироглутаматом вместо глутаминовой кислоты (pHBSP)

Fig.4. А portion of Helix-B protein acid that is not involved in interaction with the receptor, and also the development logic of the HBSP peptide, the bottom row is the derivative with pyroglutamate instead of glutamic acid (pHBSP) (according to [4])

 

Эффективность HBSP и его аналога pHBSP показана на моделях повреждения седалищного нерва, при заживлении ран, для усиления когнитивной функции у грызунов, в модели ренальной ишемии-реперфузии, моделях инсульта. В опытах in vitro и in vivo показано кардиопротективное действие. В то же время HBSP и pHBSP не обладали эритропоэтической активностью in vivo или in vitro.

Пептидный дериват Эпо pHBSP (ARA290) исследован в опытах на мышах:

- при костномозговой форме острой лучевой болезни (ОЛБ) – общее равномерное гамма-облучение в дозе 8 Гр;

- при кишечной форме ОЛБ – общее облучение в дозе 13 Гр или неполное облучение только желудочно-кишечного тракта в дозе 15 Гр [57].

В опытах на модели костномозговой формы ОЛБ препарат вводили однократно, курсом 10 сут или 29 сут, в дозах 30 мкг/кг или 60 мкг/кг. Лечение начинали через 24 ч после облучения. Выявлено, что только 29-дневное введение препарата оказало заметное влияние на выживаемость животных. Так, 30-дневная выживаемость мышей возросла с 8,6 в контроле до 35,7% в опытной группе. ARA290 при введении в дозе 60 мкг/кг курсом 10 сут либо однократно оказался неэффективен.

В опытах на модели кишечной формы ОЛБ препарат вводился подкожно, однократно, а также курсом в течение 10 или 20 дней, в дозах 30, 60, 120 мкг/кг. По сравнению с контрольными экземплярами, после введения ARA290 снижение смертности наблюдалось во всех диапазонах доз. При однократном введении наибольшая выживаемость отмечена после введения ARA290 в дозе 60 мкг/кг. Увеличение курса введения до 10 дней не способствовало повышению эффективности препарата. Однако введение в дозе 30 мкг/кг в течение 20 дней оказалось высокоэффективным [57, 58].

При изучении механизмов радиозащитного действия ARA290 показано, что препарат в дозе 30 мкг/кг не влияет на регенерацию кишечного эпителия, однако в дозах 60–120 мкг/кг способствует понижению уровня циркуляции TNF α, вызванного облучением.

На основе данных о третичной/четвертичной кристаллической структуре комплекса эритропоэтина с его рецептором разработан неэритрогенный нейропротектор пептидной природы Epotris (последовательность QLHVDHAVSGLRSLTTLLRA), который по химической структуре соответствует С-концевому участку региона альфа-спирали (последовательность аминокислот 92–111) Эпо человека. Взаимодействие пептида с Эпо-рецептором кроветворных тканей в 1000 раз меньше, чем у целого белка. Как и Эпо, Epotris проникает через ГЭБ, ослабляет нейротоксические эффекты каината, однако не стимулирует эритропоэз.

В литературе присутствует информация об исследованиях пептидного аналога Эпо Epopeptide-ab, представляющего собой последовательность из 17 аминокислот (AEHCSLNENITVPDTKV), соответствующую области AB-петли Эпо (последовательность аминокислот 30–47), который обладает активностью, сходной с целым белком. Нейропротективный эффект Epopeptide-ab подтвержден в опытах in vivo на модели ишемического повреждения нейронов [59]. Пептид вызывает дифференцировку и предотвращает клеточную гибель в клеточных линях нейробластомы мышей и человека. При этом Epopeptide-ab не вызывает пролиферации кроветворных клеток в препарате клеток селезенки мышей.

Биологическая активность в нервных клетках блокируется в присутствии антител к внеклеточному домену Эпо-рецептора, что указывает на опосредование биологического эффекта Epopeptide-ab в нервных клетках через Эпо-рецептор. При локальном введении мышам Epopeptide-ab отмечается увеличение спрутинга концевых пластинок мотонейронов в иннервируемых ими мышцах. Этот эффект сходен с действием цилиарного нейротрофического фактора. Таким образом, нервная и другие некроветворные ткани отвечают на сигнальное влияние пептидной последовательности из Эпо, что предполагает различия в рецепторах нейротрофического и гематопоэтическиого действия Эпо.

Разработан короткоцепочечный пептид MK-X (ISGLRSLTTLLRALGAQKELM), воспроизводящий участок Эпо с низкой афинностью связывания с рецептором и обладающий тканезащитным эффектом. Показано, что пептид MK-X ослабляет выраженность гибели нейронов в ответ на воздействие реактивных форм кислорода в условиях оксидативного стресса, аналогично Эпо. Пептид вызывает длительную активацию ERK1/2 (внеклеточная сигнал-регулирующая протеинкиназа) и AKT. Введение ингибиторов ERK1/2 и AKT нивелирует нейропротективный эффект MK-X. В отличие от Эпо, MK-X не вызывает пролиферацию нейрональных клеток [60].

В сравнительном исследовании пептида MK-X и Эпо на модели ишемического инсульта с реперфузией, вызванного у крыс окклюзией средней мозговой артерии, показан нейропротективный эффект пептида, который проявлялся в ограничении области инсульта. В подтверждающих исследованиях in vitro пептид ослаблял выраженность митохондриальной дисфункции и последующей гибели нейронов в культуре клеток в условиях глутамат-индуцированного оксидативного стресса наравне с Эпо. На биохимическом уровне отмечено, что MK-X значительно снижает расщепление каспазы-3 и транслокацию в ядро апоптоз-индуцирующего фактора. Эффект пептида полностью соответствует Эпо по выраженности активации JAK-2 и PI3K/AKT и ERK1/2 [61].

Пептид на основе последовательности сайта-1 Эпо (остатки 36–53 в структурной модели комплекса Эпо с рецептором) Epobis приводит к росту аксонов в первичной культуре гиппокампа и нейронов мозжечка. Epobis обладает свойствами цитопротектора для нейронов in vitro и вызывает активацию фактора транскрипции STAT5 [62]. Также установлено, что Epobis in vitro стимулирует аксоногенез в культуре клеток первичных мотонейронов и обладает противовоспалительными свойствами, что проявляется в снижении выброса TNF-α из активированных альвеолярных макрофагов мыши в клеточной линии AMJ2-C8 и в первичной культуре микроглии крыс. При системном введении Epobis идентифицируется в плазме и в цереброспинальной жидкости, что указывает на проникновение пептида через ГЭБ. Epobis не обладает эритропоэтической активностью. При системном введении Epobis крысам на модели аутоиммунного энцефалита пептид задерживает наступление признаков поражения. Также отмечен долговременный эффект пептида на рабочую и социальную память крыс [63].

На основе структуры Epobis разработан пептид NL100 – производное консервативного участка «C-helix» молекулы Эпо. Показано, что NL100 связывается с Эпо-рецептором, вызывает рост дендритов (нейритогенез), защищает нейроны гиппокампа от оксидативного повреждения и воздействия β-амилоида in vitro. При этом продолжительное введение NL100 не вызывает увеличение гемопоэза, в отличие от Эпо. В экспериментальных исследованиях выявлен эффект улучшения функции кратковременной памяти как у здоровых крыс, так и после центрального введения β-амилоидного пептида, а также улучшение пространственной памяти [64].

ВЫВОДЫ

На сегодняшний день не вызывает сомнений наличие цитопротекторного эффекта Эпо и его модифицированных форм. При этом к физиологически активным веществам, характеризующимся наибольшей биологической эффективностью, из числа модифицированных форм Эпо следует отнести asialoEPO, CEPO и GEPO. Из числа короткоцепочечных пептидов-миметиков – Helix B, ARA290, Eportis, Epopeptide-ab, MK-X, Epobis, NL100.

Результаты экспериментальных исследований позволяют рассматривать данные препараты не только как эффективные средства противовоспалительного и антиапоптозного действия, но и как радиозащитные и противоалкилирующие соединения. В реализацию тканезащитного действия Эпо и его производных вовлечены внутриклеточные сигнальные системы JAK-2/STAT-3, PI3K/AKT и ERK1/2, активность которых в условиях радиационного поражения оказывается скомпрометированной [65].

Применение модифицированных форм Эпо в острый период развития патологических процессов представляется сомнительным из-за высоких доз и необходимости курсового введения, в то время как использование короткоцепочечных тканезащитных пептидов позволяет избежать развития побочных явлений и снизить эффективные дозы в 10–20 раз. Это делает их перспективными для исследований в остром периоде поражений с целью предотвращения каскада патологических реакций, усиливающих тяжесть поражения и приводящих к формированию отдаленных последствий.

About the authors

Igor M. Ivanov

Institute of Military Medicine, Russian Federation of Ministry of Defense

Email: gniiivm_15@mil.ru

Ph.D. in Medicine, Deputy Head of Department State Research

Russian Federation, Saint-Petersburg

Aleksandr S. Nikiforov

Institute of Military Medicine, Russian Federation of Ministry of Defense

Email: gniiivm_15@mil.ru

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник

Russian Federation, Saint-Petersburg

Nikolai G. Vengerovich

State Research Institute of Military Medicine, Russian Federation of Ministry of Defense; Saint Petersburg State Chemical Pharmaceutical University of Ministry of Healthcare

Author for correspondence.
Email: nikolai.vengerovich@pharminnotech.com
ORCID iD: 0000-0003-3219-341X

Doctor of Medical Science, Deputy Head of Department; Professor at the Industrial Ecology Department

Russian Federation, St.-Petersburg

Vladimir V. Perelygin

Saint-Petersburg State Chemical Pharmaceutical University

Email: vladimir.pereligin@pharminnotech.com
ORCID iD: 0000-0002-0999-5644
ResearcherId: AAV-6556-2020

профессор, доктор медицинских наук, заведующий кафедрой промышленной экологии

Russian Federation, Saint-Petersburg

Ylia A. Proshina

Institute of Military Medicine Russian Federation of Ministry of Defense

Email: gniiivm_15@mil.ru

Researcher State Research

Russian Federation, Saint-Petersburg

References

Supplementary files