Identification of actoprotective compounds among Krebs cycle acid/aminoethanol derivatives

Full Text

СОКРАЩЕНИЯ:

ДЭАЭ – диэтиламиноэтанол;

ДМАЭ – диметиламиноэтанол;

ГАМК – гамма аминомасляная кислота;

КА – коэффициент активности;

Ксэ – коэффициент сравнительной эффективности;

ЦНС – центральная нервная система;

ANOVA – метод дисперсионного анализа;

ФДЭС – соединение «Фумарат – ДЭАЭ – Сукцинат».

ВВЕДЕНИЕ

Физическая работоспособность является одним из наиболее информативных показателей состояния организма. Патологии и нарушения в работе печени [1], сердечно-сосудистой и дыхательной систем будут приводить к ее снижению. Еще одним фактором, влияющим на работоспособность, является состояние центральной нервной системы. Так, при различных травмах центральной нервной системы зачастую происходит не только снижение физической работоспособности, но и нарушение двигательной активности в целом [2].

Таким образом, физическая работоспособность является интегративным показателем здоровья организма в целом. Это делает тесты по оценке физической работоспособности важными в мониторинге наиболее значимых и распространенных заболеваний, являющихся наиболее частой причиной смерти и инвалидизации в развитых странах.

Актуальным является поиск и внедрение в медицинскую практику препаратов для фармакологической коррекции утомления и восстановления физической работоспособности при астенических явлениях после перенесенных заболеваний, физических нагрузок у военнослужащих, спортсменов и лиц пожилого возраста.

На сегодняшний день среди препаратов с актопротекторным действием одну из самых изученных групп составляют синтетические средства различных химических классов. Наиболее изучены производные имидазола: 2-этилтиобензимидазол («эталонный» актопротектор) и производные аминоадамантана – адамонтилбромфениламин [3]. Тем не менее, номенклатура современных актопротекторных средств крайне ограниченна, несмотря на высокую потребность в них личного состава военных формирований, сотрудников спасательных служб, спортсменов, пациентов при различных астенических состояниях.

Представляет интерес поиск новых актопротекторов среди средств неистощающего характера, которые по химической структуре близки к естественным метаболитам организма и способны повышать устойчивость организма к физическим нагрузкам без увеличения потребления кислорода и теплопродукции, повышая коэффициент полезного действия [3].

В качестве потенциальных средств с актопротекторной активностью большой интерес представляют производные аминоэтанола (этаноламина), обладающие широким спектром фармакологической активности, в том числе в отношении умственной и физической работоспособности [4, 5].

Поскольку фармакологическая коррекция процессов умственного и физического утомления имеет ряд общих принципов, то соединения, обладающие ноотропным и антиоксидантным действием, перспективны для изучения в качестве актопротекторов [6].

Заметной актопротекторной активностью обладают также активаторы главного энергетического механизма клеток – цикла Кребса, к которым, в частности, относятся янтарная, яблочная, фумаровая, альфа-кетоглутаровая кислоты и препараты их солей [6–8].

В исследованиях Г.А. Фрелих и Е.И. Маевского было показано, что интермедиаты цикла трикарбоновых кислот способствуют сохранению дыхания митохондрий и поддержанию трансмембранного потенциала ионов водорода [9, 10].

Важно, что на мировом фармацевтическом рынке отсутствуют препараты с актопротекторной активностью, разработанные на основе фумаровой кислоты. В связи с этим поиск таких новых препаратов с актопротекторной активностью среди соединений, состоящих из фумарового эфира диэтиламиноэтанола с интермедиатами цикла трикарбоновых кислот, является актуальным.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение влияния производных диметиламино- и диэтиламиноэтанола с интермедиатами цикла трикарбоновых кислот на физическую работоспособность белых беспородных самцов мыши.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования проводились на 490 беспородных мышах-самцах массой 22–24 г и выполнялось в соответствии с приказом Минздрава России от 01.04.2016 г. №199н «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики», согласно утвержденному письменному протоколу. Животные были получены из питомника лабораторных животных «Рапполово», прошли необходимый карантин и содержались в стандартных условиях сертифицированного вивария на обычном пищевом рационе со свободным доступом к воде.

Объектами исследования были выбраны соединения – продукты взаимодействия диметиламино- и диэти- ламиноэтанола с некоторыми интермедиатами цикла трикарбоновых кислот (фумаровый эфир ДЭАЭ и ДМАЭ в виде солей: с фумаровой и янтарной кислотами, L-малатом, альфа-кетоглутаратам), которые синтезированы на кафедре органической химии Санкт-Петербургского государственного химико-фармацевтического университета Минздрава России.

В качестве препаратов сравнения использовали:

– производное аминоэтанола, 2-(диметиламино)этанол N-ацетил-L-глутаминовой кислоты (деанола ацеглумат, ООО «Экохим-инновации», Россия);

– этилтиобензимидазол (ЗАО «Фармпроект», Россия).

Выбор этилтиобензимидазола происходил на основании следующих критериев:

– наличие данных о применении вещества для фармакологической коррекции физической работоспособности;

– доступность на российском фармацевтическом рынке;

– возможность энтерального введения экспериментальным животным.

Деанол ацеглумат является ноотропным препаратом, по химической структуре близким к естественным метаболитам головного мозга (таким как гамма аминомасляная и глутаминовая кислота). Оказывает нейропротекторное действие, способствует улучшению памяти и процесса обучения, оказывает положительное влияние при астенических и адинамических расстройствах (повышая двигательную и психическую активность пациентов).

Выбор его для сравнения происходил на основании следующих критериев:

– сходство структуры с изучаемым веществом;

– наличие данных о применении вещества для фармакологической коррекции физической работоспособности;

– доступность на российском фармацевтическом рынке;

– возможность энтерального введения экспериментальным животным.

Оценка работоспособности лабораторных животных в данной работе осуществлялась с помощью теста «Вынужденное плавание» с грузом. Классическая методика теста «отчаяния» Порсолта («Вынужденного плавания») используется для испытания антидепрессивного действия веществ [11]. Однако она, в силу своей простоты, широко применяется для оценки эффектов стимуляторов работоспособности в условиях стресса. Тест принудительного плавания представляет собой комбинированный жесткий вид стресса, сочетающий физический и эмоциональный компоненты [12, 13, 14].

Модификация данной методики Научным центром биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства позволяет применять его для оценки актопротекторных свойств. Для проведения теста животных (мышей) с дополнительным грузом 6% (аэробная нагрузка) или 10% (аэробно-анаэробная нагрузка) от массы тела, закрепленным на уровне крестца, помещали в резервуар с водой. Емкость для плавания, имеющую форму цилиндра (диаметр – 10 см, высота – 25 см) за сутки до исследования заполняли водой (22–24 °С) на треть объема таким образом, чтобы животное не имело возможности выпрыгнуть или достать до дна хвостом.

Исследование проводили в стандартных условиях (утренние часы, обычный уровень освещения). Животных накануне исследования на ночь оставляли без корма при свободном доступе к воде.

Лабораторным животным после взвешивания, за 45–60 минут до начала тестирования работоспособности зондом перорально вводили расчетную дозу исследуемого препарата. За 15–20 минут до начала тестирования работоспособности (для сглаживания возможной стресс-реакции) на животном фиксировали подобранный груз.

При начале исследования мышь без резких движений погружали в емкость с водой. Секундомер включали при первых плавательных движениях животного. Анализируемым показателем, отражающим физическую работоспособность лабораторных животных, было время предельного плавания животных (время до полного отказа от плавания) [15]. Увеличение длительности плавания мышей в минутах расценивали как повышение физической работоспособности животных.

Оценивали специфическую активность анализируемой субстанции, которая выражается в относительных единицах (по отношению к контролю, в безразмерном варианте или в процентном исчислении), на основе среднегрупповых значений по формуле:

КА=Хпр/Хк,

где

КА – коэффициент активности;

Хпр – значение анализируемого показателя работоспособности при приеме препарата Х;

Хк – в контрольной группе.

Кроме того, определяли коэффициент сравнительной эффективности по формуле:

Ксэ = Хпр/ Хэ,

где

Хпр – значение анализируемого показателя в условиях тестирования работоспособности при приеме препарата;

Хэ – то же при приеме эталонного препарата.

Статистическую обработку полученных данных для установления различий между группами (например, опытной и контрольной) проводили, используя F-критерий дисперсионного анализа. Числовые данные, приводимые в таблице, представлены в виде:

среднее арифметическое (М) ± стандартная ошибка среднего (m).

Уровень доверительной вероятности был задан равным 95%.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В процессе разработки новых актопротекторных средств мы считаем целесообразным использовать способность кислот цикла Кребса усиливать антигипоксическую, актопротекторную и ноотропную активность базовых катионных групп в солях. Такое свойство было показано в отношении янтарнокислых солей амтизола, гутимина, этилтиобензимидазола [16], 3-оксипиридина [17], ГАМК [18] и других соединений.

Мы предполагаем, что в химической структуре разрабатываемого перспективного актопротектора должны будут присутствовать следующие фармакофорные группировки:

• катионная часть – фумаровый эфир диэтиламиноэтанола.
• анионная часть – кислотный остаток одной из солей цикла Кребса (янтарной, яблочной, фумаровой или альфа-кетоглутаровой), выбор которой будет осуществлен по результатам проведенного скрининга.

Подобные структуры, но на основе янтарного эфира диметиламиноэтанола с отчетливым позитивным влиянием на работоспособность, устойчивость к гипоксии и стрессу, воздействию низких температур известны. В медицинской литературе описано антиастеническое действие диметиламиноэтилового эфира янтарной кислоты [19]. Как средство повышения физической работоспособности, особенно при воздействии низких температур, применялся препарат яктон (янтарная соль янтарного эфира диметиламиноэтанола) [20]. Адаптогенное и стресспротективное действие описано для сукцината моно[(2-диметиламино) этилового эфира] янтарной кислоты [21]. Так, при помещении животных на шесть часов в холодовую камеру (–15/–17 °С) применение сукцинатсодержащего препарата увеличивало их выживаемость. На модели двигательного стресса с использованием методики лишения экспериментальных животных сна, пищи и воды в медленно вращающемся барабане препарат показал выраженное защитное действие в отношении как показателей функциональной активности ЦНС, так и развития целого ряда патофизиологических проявлений стресс-синдрома [21].

Известно, что биологическую активность проявляют метильные и этильные производные аминоэтанола, которые являются предшественниками или аналогами холина (триметиламиноэтанола) и ацетилхолина, а также входят в состав фосфолипидов клеточных мембран. Именно эти производные и были использованы при разработке новых соединений.

К гидроксильному остатку аминоэтанола была присоединена фумаровая кислота с образованием фумарового эфира – соответствующего аминоэтанольного производного, ставшего катионной частью будущего соединения. В последующем были получены соли фумаровых эфиров аминоэтанола и кислот цикла Кребса (янтарной, яблочной, кетоглутаровой, фумаровой). На кафедре органической химии в Санкт-Петербургском государственном химико-фармацевтическом университете были синтезированы диэтиламиноэтанол (основание) и восемь соединений, являющихся солями кислот цикла Кребса аминоэтанольных производных фумаровой кислоты (табл. 1).

Для выбора наиболее эффективного из синтезированных соединений был выполнен скрининг фармакологической активности. В качестве скрининговой модели для изучения влияния новых соединений на физическую работоспособность выбран тест предельного плавания с грузом. Результаты выполнения животными этого теста зависят от их общего состояния и работоспособности, их эмоционального статуса, активности, устойчивости к гипоксии [12], что позволяет использовать данную методику в комплексе с другими биомедицинскими методиками для оценки нескольких направлений фармакологической активности, включая актопротекторную. Она стандартизирована и широко используется в биомедицинских исследованиях [15]. Скрининговое исследование выполнено на беспородных белых мышах, температура воды в бассейне 28 ± 1 ^оС, утяжеление – 6% от массы тела.

Так как для вновь синтезированных соединений не был известен рабочий диапазон доз, то в ходе скринингового исследования оценивалась также зависимость работоспособности животных от введенной дозы соединения. Исследовался диапазон доз от 10 до 75 мг/кг при однократном пероральном введении за час до проведения тестирования. Полученные результаты сопоставлялись не только с контрольной группой животных, которым вводилось эквиобъемное количество физиологического раствора, но и с препаратом сравнения – разрешенным к клиническому применению ноотропным средством аминоэтанольного ряда деанола ацеглуматом и этилтиобензимидазола гидрохлоридом. В каждой группе было по десять животных, что позволяло корректно проводить статистическую обработку данных.

Результаты скрининговой серии исследований представлены в табл. 2.

Анализ полученных данных показывает, что максимально высокую и статистически достоверную фармакологическую активность в скрининговом тесте показывают соединения «Фумарат – ДМАЭ – Фумарат» в дозе 75 мг/кг и «Фумарат – ДЭАЭ – Сукцинат» в дозе 10 мг/кг, а также сам диэтиламиноэтанол (ДЭАЭ основание) в дозе 50 мг/кг. По своему влиянию на работоспособность животных они превосходили препарат сравнения – деанола ацеглумат – в оптимальной дозе 50 мг/кг. Последний обеспечивал повышение времени предельного плавания животных на 74%, в то время как исследуемые соединения показали результаты +175%, +162% и +121% к контролю. Актопротекторная активность соединений «Фумарат – ДМАЭ – Фумарат» и «Фумарат –- ДЭАЭ – Сукцинат» сопоставима с эффектом этилтиобензимидазола гидрохлорида (доза 25 мг/кг).

Так как фармакологическая активность соединения обратно пропорциональна его дозе, вызывающей заданную степень эффекта, то по результатам скринингового исследования более активным может считаться вещество «Фумарат – ДЭАЭ – Сукцинат» (рис. 1).

В условиях аэробно-анаэробной физической работоспособности (плавание мышей с грузом 10%) ФДЭС был изучен в широком диапазоне доз от 1 мг/кг до 300 мг/кг (рис. 2).

Кривая «Доза-Эффект» для ФДЭС при тестировании физической работоспособности животных в тесте вынужденного плавания с грузом 10% представлена на рис. 2.

Доза ФДЭС 75 мг/кг дала наибольший прирост времени плавания. Несмотря на то, что он не достиг статистической значимости различий по сравнению с показателями группы плацебо-контроля, эта доза может быть выбрана для дальнейших исследований, так как в исследованиях других авторов она показала высокую нейротропную активность [22, 23, 24]. Отсутствие статистически значимых различий может быть обусловлено особенностями актопротекторного профиля действия соединения.

ВЫВОДЫ

Результаты проведенного исследования подтвердили, что на мировом фармацевтическом рынке отсутствуют препараты с актопротекторной активностью, разработанные на основе фумаровой кислоты. В связи с этим поиск таких препаратов среди соединений, состоящих из фумарового эфира диэтиламиноэтанола с интермедиатами цикла трикарбоновых кислот, является актуальным.

В процессе разработки новых актопротекторных средств мы считаем целесообразным использовать способность кислот цикла Кребса усиливать антигипоксическую, актопротекторную и ноотропную активность базовых катионных групп в солях.

Янтарная соль фумарового эфира диэтиламиноэтанола обладает актопротекторной активностью, увеличивая выносливость экспериментальных животных при однократном пероральном введении при аэробной и аэробно-анаэробной физической нагрузке.

Выраженность актопротекторного эффекта в условиях аэробной физической нагрузки янтарной соли фумарового эфира диэтиламиноэтанола (доза 10 мг/кг) сопоставима с таковым у этилтиобензимидазола гидро- хлорида (доза 25 мг/кг), но превосходит действие деанола ацеглумат (доза 50 мг/кг).

Актопротекторный эффект янтарной соли фумарового эфира диэтиламиноэтанола реализуется в дозе 75 мг/кг в условиях аэробно-анаэробной физической нагрузки.

Новые соединения фумарового эфира диэтиламино- и диметиламиноэтанола с интермедиатами цикла Кребса по своему влиянию на физическую работоспособность превосходили препарат сравнения – деанола ацеглумат в оптимальной дозе 50 мг/кг. Последний обеспечивал повышение времени предельного плавания животных на 74%, в то время как исследуемые соединения показали результаты +175%, +162%, +121% к контролю. Актопротекторная активность соединений «Фумарат – ДМАЭ – Фумарат» (доза 75 мг/кг) и «Фумарат – ДЭАЭ – Сукцинат» (доза 10 мг/кг) сопоставима с эффектом этилтиобензимидазола гидрохлорида (доза 25 мг/кг).

 

Рис. 1. Структурная формула бис{2-[(2E)-4-гидрокси-4-оксобут-2-еноилокси]-N,N-диэтилэтанаминия} бутандиоата

Fig. 1. Structural formula bis{2-[(2E)-4-hydroxy-4-oxobut-2-enoyloxy]-N,N-diethylethanamine} butanedioate

 

№ п/п	Соединение
	Катионная часть		Анионная часть
	Кислота	Производное аминоэтанола	Кислота
1	-	Диэтиламиноэтанол	-
2	Фумаровая		Альфа-кетоглутаровая
3	Фумаровая		Фумаровая
4	Фумаровая		Янтарная
5	Фумаровая		DL-яблочная
6	Фумаровая	Диметиламиноэтанол	Альфа-кетоглутаровая
7	Фумаровая		Фумаровая
8	Фумаровая		Янтарная
9	Фумаровая		DL-яблочная

Табл.1.

Исследуемые соединения фумаровой кислоты

Table 1.

Test compounds of fumaric acid

 

Рис. 2. Кривая «Доза – Эффект» для однократного введения ФДЭС при тестировании физической работоспособности лабораторных животных

Fig. 2. Dose-Effect curve for single administration of PDES when testing the physical performance of laboratory animals

 

№ п/п	Препарат	Доза, мг/кг	Продолжительность плавания
			M±m, мин	КА,%	Ксэ1,%	Ксэ2,%
1	Контроль	-	5,41±0,21	100	57	38
2	Этилтиобензимидазола гидрохлорид	25	14,23±1,23*	272	151	100
3	ДМАЭ – ацеглумат	10	5,68±0,27	105	60	39
4	ДМАЭ – ацеглумат	25	4,03±0,34	75	43	40
5	ДМАЭ – ацеглумат	50	9,41±1,21*	174	100	66
6	ДМАЭ – ацеглумат	75	8,56±1,39	158	91	61
7	ДЭАЭ – основание	10	8,54±1,17	156	90,8	60
8	ДЭАЭ – основание	25	7,95±1.08	147	84	56
9	ДЭАЭ – основание	50	11,95±1,66*	221	127	84
10	ДЭАЭ – основание	75	7,77±0,82	144	83	55
11	Фумарат – ДЭАЭ – основание	10	7,04±1,56	130	75	49
12	Фумарат – ДЭАЭ – основание	25	6,33±0,84	117	67	44
13	Фумарат – ДЭАЭ – основание	50	4,10±0,48	76	44	29
14	Фумарат – ДЭАЭ – основание	75	7,17±0,81	133	76	50
15	Фумарат – ДЭАЭ – Кетоглутарат	10	6,86±1,45	127	73	48
16	Фумарат – ДЭАЭ – Кетоглутарат	25	8,39±0,72	155	89	60
17	Фумарат – ДЭАЭ – Кетоглутарат	50	7,92±0,55	146	84	56
18	Фумарат – ДЭАЭ – Кетоглутарат	75	8,61±1,20	159	91	61
19	Фумарат – ДЭАЭ – Фумарат	10	7,76±1,06	143	82	55
20	Фумарат – ДЭАЭ – Фумарат	25	5,83±0,42	108	62	41
21	Фумарат – ДЭАЭ – Фумарат	50	4,62±0,39	85	49	32,5
22	Фумарат – ДЭАЭ – Фумарат	75	4,50±0,42	83	48	31,6
23	Фумарат – ДЭАЭ – Сукцинат	10	14,17±4,26*	262	151	99,6
24	Фумарат – ДЭАЭ – Сукцинат	25	6,06±0,89	112	64	43
25	Фумарат – ДЭАЭ – Сукцинат	50	5,19±0,97	96	55	36,5
26	Фумарат – ДЭАЭ – Сукцинат	75	4,91±0,93	91	52	34,5
27	Фумарат – ДМАЭ – основание	10	7,76±0,85	143	82	54,5
28	Фумарат – ДМАЭ – основание	25	9,23±1,16*	171	98	64,9
29	Фумарат – ДМАЭ – основание	50	5,08±0,41	94	54	35,8
30	Фумарат – ДМАЭ – основание	75	4,72±0,28	87	51	33,2
31	Фумарат – ДМАЭ – Фумарат	10	5,13±0,74	95	55	36
32	Фумарат – ДМАЭ – Фумарат	25	5,50±0,49	102	58	39
33	Фумарат – ДМАЭ – Фумарат	50	7,33±0,80	135	78	51,5
34	Фумарат – ДМАЭ – Фумарат	75	14,85±3,60*	275	158	104
35	Фумарат – ДМАЭ – Сукцинат	10	7,84±1,37	145	83	55
36	Фумарат – ДМАЭ – Сукцинат	25	6,73±1,78	124	72	47,3
37	Фумарат – ДМАЭ – Сукцинат	50	6,14±0,58	114	65	43,1
38	Фумарат – ДМАЭ – Сукцинат	75	7,32±1,35	135	78	51,4
39	Фумарат – ДМАЭ – Кетоглутарат	10	6,24±0,73	115	66	44
40	Фумарат – ДМАЭ – Кетоглутарат	25	8,02±1,18	148	85	56,4
41	Фумарат – ДМАЭ – Кетоглутарат	50	7,25±0,93	134	77	51
42	Фумарат – ДМАЭ – Кетоглутарат	75	7,69±0,48	142	82	54

About the authors

Vera Ts. Bolotova

Saint Petersburg State Chemical and Pharmaceutical University

Author for correspondence.
Email: vera.bolotova@pharminnotech.com
SPIN-code: 5035-2066

Ph.D. in Pharmaceutical Sciences, associate professor of the Department of Pharmacology

Russian Federation, Saint Petersburg

Evgeniy B. Shustov

Saint Petersburg State Chemical and Pharmaceutical University

Email: shustov-msk@mail.ru

Doctor of  Medicine (MD), Professor of the Department of Pharmacology and Clinical Pharmacology

Russian Federation, Saint Petersburg

Sergey V. Okovityi

Saint Petersburg State Chemical and Pharmaceutical University

Email: sergey.okovity@pharminnotech.com
ORCID iD: 0000-0003-4294-5531
SPIN-code: 7922-6882
Scopus Author ID: 6603899800
ResearcherId: Q-5122-2018

Doctor of  Medicine (MD), Professor, head of the Department of Pharmacology and Clinical Pharmacology

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files