Approaches to assessing the sexual behavior of male rats in the study of the effects of compounds that have a stimulating effect on sexual function

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

В последние годы отмечается высокий уровень нарушений репродуктивного здоровья людей [1, 2]. Сохраняющаяся тенденция роста половых расстройств актуализирует необходимость поиска новых средств и методов фармакологической коррекции изменений в сексуальной сфере [3, 4].

Для оценки нейротропных свойств соединений, обладающих выраженной специфической активностью и влияющих на состояние центральной нервной и эндокринной систем, в рамках доклинических исследований следует проводить изучение полового поведения [5–7]. С учетом этого выбор адекватной методики оценки является одной из важных задач, определяющей положительный исход эксперимента. Правильный подбор и применение методов исследования поведенческих реакций экспериментальных животных (в том числе реакций, связанных с особенностями полового поведения) позволят минимизировать трудности при интерпретации полученных результатов и обеспечат высокую вероятность обнаружения как активирующего, так и угнетающего действия фармакологических средств на половую активность животных [8]. В пользу необходимости правильного выбора наиболее чувствительной и в то же время простой в исполнении методики свидетельствует зачастую низкая информативность методов ограниченной длительности, чаще всего используемых в эксперименте [9].

В этой связи целью настоящего исследования являлось проведение сравнительного анализа информативности методов оценки копулятивного поведения самцов крыс при введении им соединений различного механизма действия, оказывающих стимулирующее влияние на половую активность.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Половое поведение самцов крыс изучали с использованием теста парного взаимодействия самца с рецептивной самкой при различной длительности тестирования:

– тест 1: оценка половой активности самца при парном взаимодействии с самкой в течение 15 мин;

– тест 2: оценка половой активности самца при парном взаимодействии с самкой в течение 30 мин;

– тест 3: оценка половой активности самца при парном взаимодействии с самкой до достижения самцом состояния «полового истощения».

Критериями достижения состояния «полового истощения» считали отсутствие активности у самца в течение 30 мин после последней эякуляции (критерий насыщения), отсутствие копуляции в течение 60 мин после предъявления рецептивной самки (критерий инертности) или отсутствие эякуляции при сохранении копулятивной активности более 60 мин (критерий несостоятельности).

Проводили оценку следующих параметров полового поведения:

– общее количество интромиссий;

– общее время копулятивной активности самца (мин);

– количество копулятивных серий;

– количество эякуляций;

– длительность рефрактерных периодов между копулятивными сериями (мин);

– скорость копуляции – количество интромиссий в минуту;

– относительное время отдыха (%).

Инструментом анализа информативности тестов различной длительности являлась сравнительная оценка полового поведения самцов крыс на фоне введения следующих фармакологических соединений:

1. Галантамина гидробромид (субстанция Sigma Aldrich, США) в дозе 1 мг/кг. Обратимый ингибитор холинэстеразы. Преимущественно центрального механизма действия. Реализация стимулирующих эффектов обеспечивается повышением активности холинергической системы, усилением процессов возбуждения в рефлекторных зонах спинного и головного мозга.
2. Локсидан (таблетки «Усолье-Сибирский Химфармзавод», Россия) в дозе 1,7 мг/кг. Психостимулирующее средство. Активирующее центральное действие обеспечивается через стимуляцию катехоламинергических, в т. ч. норадрен- и дофаминергических систем.
3. Йохимбина гидрохлорид (субстанция Sigma Aldrich, США) в дозе 2,6 мг/кг. Антагонист α2-адренорецепторов и агонист имидазолиновых рецепторов. Реализация стимулирующих эффектов обеспечивается влиянием на центральные (повышение либидо, антидепрессивные эффекты) и периферические α2-адренорецепторы. Периферическое действие выражается в усилении притока крови к органам малого таза, повышении потенции.
4. Варденафила гидрохлорид (субстанция Sigma Aldrich, США) в дозе 1,7 мг/кг. Ингибитор фосфодиэстеразы 5-го типа. Оказывает преимущественно периферическое стимулирующее действие, проявляющееся в улучшении эректильной функции.

Рабочие растворы соединений вводили самцам внутрижелудочно, за 30 мин до тестирования, из расчета 1 мл на 100 г веса животного. Контрольной группе животных вводили растворитель (воду для инъекций) в том же объеме.

Исследования проводили на белых беспородных крысах, полученных из питомника «Рапполово» (Ленинградская область). Все опытные и контрольные животные были взяты из одного привоза и прошли карантин в течение 14 суток.

Подготовка самок состояла в предварительном, за 14 дней до эксперимента, проведении овариэктомии. Рецептивность самок достигали путем последовательного подкожного введения масляного раствора β эстрадиола (Sigma Aldrich, США) в дозе 50 мкг на крысу (первый день цикла) и масляного раствора прогестерона (Дальхимфарм, Россия) в дозе 500 мкг на крысу (третий день цикла).

Подготовка самцов заключалась в проведении последовательных (каждые три дня в течение двух недель) тренировок взаимодействия с рецептивными самками. Целью тренировок являлось формирование у самцов полового опыта.

Контрольную и опытные группы формировали из животных с близкими средними значениями показателей полового поведения. Каждая экспериментальная группа включала шесть самцов.

При проведении эксперимента учитывали видоспецифические особенности полового поведения крыс. Предварительно в течение двух недель в условиях вивария формировали новые циркадные ритмы крыс: с 22.00 до 10.00 – светлая фаза, с 10.00 до 22.00 – темная фаза суточного цикла. Опыты проводили в течение темной фазы суточного цикла при тусклом красном освещении.

Статистический анализ полученных результатов проводили с помощью пакета программ Statistica 2010 с использованием непараметрического критерия Краскела-Уоллиса.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты исследования представлены в табл. 1. Данные представлены в виде медианы и процентилей [25; 75].

Показано, что однократное введение галантамина способствует усилению половой активности самцов крыс.

В тесте 1 отмечали высокую скорость копуляции, увеличение числа совершенных копулятивных серий и эякуляций за относительно короткий период копулятивной активности. Статистически значимые отличия от аналогичных показателей контрольной группы свидетельствовали о высоком уровне возбуждения самцов.

В тесте 2 регистрировали высокие значения количества совершенных интромиссий и, как следствие, высокие значения скорости копуляции.

В тесте 3 у самцов отмечали увеличение общего времени копулятивной активности. Количество выполненных копулятивных серий и эякуляций превышало значения контроля и составило 9,0 [7, 0; 10, 0] и 8,0 [7, 0; 9, 0] (в контроле 6,5 [6, 0; 8, 0] и 6,0 [5, 0; 7, 5]), соответственно.

Оценка полового поведения самцов после однократного введения локсидана позволила выявить стимулирующие эффекты образца в тестах ограниченной длительности (тест 1 и тест 2) только по показателям «относительное время отдыха» и «длительность постэякуляторного рефрактерного периода» (рис. 1). Статистически значимое увеличение показателей относительно контрольных значений свидетельствовало о высоком уровне половой мотивации у самцов.

В тесте 3 регистрировали увеличение более чем на 20% количества совершенных копулятивных серий и эякуляций. При этом продолжительность копулятивной активности снижалась до 57,3 [42, 8; 66, 8] мин против 82,6 [39, 6; 89, 2] мин в контроле.

Таким образом показано, что изучение стимулирующих эффектов соединений центрального механизма действия возможно при использовании методов с различной продолжительностью тестирования.

Анализ эффективности варденафила при различных вариантах тестирования показал низкую информативность тестов ограниченной длительности.

В тесте 1 показатели полового поведения самцов не отличались от аналогичных показателей контрольной группы. В тесте 2 статистически значимое увеличение общего количества совершенных интромиссий свидетельствовало о достаточно высоком уровне генитальной стимуляции, необходимой для завершения копулятивной серии эякуляцией. Стимулирующее действие соединения в тесте 2 отмечали только по показателю «длительность постэякуляторного рефрактерного периода». Достоверное снижение значений показателя после первой и второй копулятивных серий и низкие значения после четвертой копулятивной серии отражали высокий уровень половой мотивации и возбуждения самцов.

Наиболее информативным в отношении стимулирующего действия варденафила на половое поведение самцов крыс являлся тест 3. Отмечали статистически значимое увеличение количества копулятивных серий и эякуляций, совершенных самцами до достижения состояния «полового истощения». При этом общее время копулятивной активности – более чем в 1,7 раза ниже, чем в группе контрольных животных, а скорость копуляции соответствовала контрольной.

Схожие результаты были получены при анализе эффективности применения йохимбина. Активирующее действие α2-адреноблокатора на половую активность самцов отмечали в тестах 2 и 3. Оно про- являлось в статистически значимом повышении значений показателей «количество копулятивных серий» и «количество эякуляций», а также снижении длительности постэякуляторных рефрактерных периодов, отражающих ингибирующее действие эякуляций на механизм возбуждения. Так, регистрировали более быстрое восстановление копулятивной активности самцов после первой и второй копулятивной серии в тесте 2 и после первых пяти серий в тесте 3.

Полученные результаты свидетельствуют о высоком уровне возбуждения животных, которым вводили соединения периферического действия. Однако выявление их эффективности стало возможным только при использовании методов с продолжительностью тестирования 30 мин и более.

ВЫВОДЫ

Определение стимулирующих эффектов соединений центрального механизма действия возможно при использовании методов с различной продолжительностью тестирования.

Несомненно, что наиболее информативными являются тесты, отражающие завершенный половой цикл самцов. Однако применение тестов ограниченной длительности также позволит по отдельно взятым показателям выявить активирующее действие фармакологических соединений.

Напротив, при исследовании эффектов образцов преимущественно периферического действия целесообразно использование методов, отражающих функциональное состояние копуляторно-эякуляторного механизма самцов и уровень половой мотивации в середине и на заключительных стадиях цикла полового поведения, когда активность самцов снижена. Одним из таких методов является тест 3, длительность тестирования при использовании которого в ряде случаев превышает 180 мин. Трудоемкость метода оправдывается его высокой информативностью, которая обеспечивает большую вероятность обнаружения активирующего действия соединений на половую функцию самцов крыс.

 

* – отличия от контрольных значений статистически значимы при p <0,05 (критерий Краскела-Уоллиса).

* – differences from control values are statistically significant at p <0,05 (Kruskal-Wallis test).

Табл. 1.

Влияние соединений, стимулирующих половую функцию, на показатели

копуляторного поведения самцов крыс в тестах 1-3

Table 1.

The influence of compounds that stimulate sexual function

on indicators of copulatory behavior of male rats in tests 1-3

Показатели полового поведения	Экспериментальная группа	Тест 1	Тест 2	Тест 3
Общее количество интромиссий	Контроль	27,5 [22, 5; 30, 0]	33,5 [27, 5; 45, 5]	73,0 [55, 5; 122, 5]
	Галантамин	24,0 [20, 0; 27, 0]	40,0 [32, 0; 45, 0]	53,0 [48, 0; 69, 0]
	Локсидан	43,0 [29, 0; 47, 0]	59,5 [48, 0; 65, 0]*	75,0 [67, 0; 89, 0]
	Варденафил	22,5 [16, 0; 28, 0]	53,5 [52, 0; 70, 0]*	54,5 [37, 0; 88, 0]
	Йохимбин	27,5 [17, 0; 37, 0]	36,5 [35, 0; 40, 0]	62,5 [58, 0; 68, 0]
Общее время копулятивной активности, мин	Контроль	6,4 [5, 3; 9, 5]	10,6 [8, 4; 14, 3]	82,6 [39, 6; 89, 2]
	Галантамин	4,9 [4, 5; 5, 5]	9,5 [8, 5; 13, 2]	103,8 [39, 2; 147, 2]
	Локсидан	10,5 [8, 3; 12, 8]*	16,5 [14, 7; 21, 0]	57,3 [42, 8; 66, 8]
	Варденафил	6,8 [6, 1; 7, 4]	13,2 [11, 6; 20, 9]	48,1 [18, 2; 78, 6]
	Йохимбин	10,8 [8, 4; 11, 9]*	14,2 [13, 4; 14, 5]	93,1 [46, 6; 113, 0]
Количество копулятивных серий	Контроль	2,0 [1, 5; 3, 0]	4,0 [3, 0; 4, 0]	6,5 [6, 0; 8, 0]
	Галантамин	3,0 [3, 0;3, 0]	4,0 [3, 0; 4, 0]	9,0 [7, 0; 10, 0]*
	Локсидан	1,5 [1, 0; 2, 0]	3,0 [2, 0; 4, 0]	8,0 [6, 0; 9, 0]
	Варденафил	2,0 [2, 0; 3, 0]	4,0 [3, 0; 4, 0]	8,5 [8, 0; 10, 0]*
	Йохимбин	2,0 [2, 0; 3, 0]	4,0 [4, 0;5, 0]*	9,0 [9, 0; 10, 0]*
Количество эякуляций	Контроль	2,0 [1, 0; 2, 0]	3,0 [2, 5; 4, 0]	6,0 [5, 0; 7, 5]
	Галантамин	3,0 [2, 0; 3, 0]*	3,0 [3, 0; 4, 0]	8,0 [7, 0; 9, 0]
	Локсидан	1,0 [1, 0; 2, 0]	2,5 [2, 0; 4, 0]	8,0 [6, 0; 9, 0]
	Варденафил	2,0 [1, 0; 2, 0]	4,0 [2, 0; 4, 0]	8,5 [8, 0; 10, 0]*
	Йохимбин	2,0 [1, 0; 2, 0]	4,0 [4, 0; 4, 0]	9,0 [8, 0; 9, 0]*
Скорость копуляции ед/мин	Контроль	3,8 [3, 1; 4, 6]	3,4 [2, 6; 4, 0]	1,3 [0, 9; 1, 7]
	Галантамин	4,8 [4, 6; 5, 1]*	4,0 [2, 9; 5, 3]	0,7 [0, 4; 1, 3]
	Локсидан	4,2 [2, 8; 5, 8]	3,7 [2, 8; 4, 8]	1,3 [0, 9; 1, 8]
	Варденафил	3,3 [1, 6; 4, 3]	4,2 [4, 2; 4, 5]	1,4 [1, 1; 2, 3]
	Йохимбин	2,8 [2, 2; 3, 3]	2,8 [2, 4; 3, 4]	0,7 [0, 5; 1, 2]
Относительное время отдыха, мин	Контроль	49,0 [15, 9; 60, 3]	61,9 [45, 1; 69, 5]	45,4 [36, 0; 55, 4]
	Галантамин	61,0 [56, 4; 65, 1]	61,6 [49, 3; 71, 8]	45,9 [45, 2; 62, 8]
	Локсидан	13,4 [0, 2; 30, 9]*	37,1 [22, 7; 51, 2]	56,1 [53, 6; 63, 5]
	Варденафил	42,9 [34, 6; 56, 2]	54,7 [30, 5; 55, 9]	64,5 [48, 4; 82, 4]
	Йохимбин	25,8 [21, 0; 27, 4]	49,0 [43, 4; 55, 3]	42,5 [39, 9; 61, 3]

 

Рис. 1 – Длительность постэякуляторных рефрактерных периодов (РП). Данные представлены в виде медианы

* – отличия от контрольных значений статистически значимы при p <0,05 (критерий Краскела-Уоллиса)

Fig. 1 – Duration of postovulatory refractory periods (RP). Data is presented as median

* – differences from control values are statistically significant at p <0,05 (Kruskal-Wallis test)

*

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

About the authors

Svetlana N. Subbotina

State Research Testing Institute of Military Medicine» Ministry of Defense of the Russian Federation

Author for correspondence.
Email: gniiivm_15@mil.ru
SPIN-code: 7249-8174

Candidate of Biological Sciences

Russian Federation, Saint Petersburg

Anastasiya A. Kryazhevskikh

State Scientific Research Test Institute of the Military Medicine Defense Ministry of the Russian Federation; Saint Petersburg State Chemical and Pharmaceutical University

Email: gniiivm_15@mil.ru

laboratory assistant-researcher of the research Department; master student 

Russian Federation, Saint Petersburg

Aleksey A. Kryazhevskikh

State Scientific Research Test Institute of the Military Medicine Defense Ministry of the Russian Federation; Saint Petersburg State Chemical and Pharmaceutical University

Email: gniiivm_15@mil.ru

laboratory assistant-researcher of the research Department; master student 

Russian Federation, Saint Petersburg

Mikhail A. Yudin

State Scientific Research Test Institute of the military medicine Defense Ministry of the Russian Federation

Email: gniiivm_15@mil.ru

Doctor of Medicine (MD), Docent

Russian Federation, Saint Petersburg

Elizaveta I. Eletskaya

Saint Petersburg State Chemical and Pharmaceutical University

Email: eletckaya_l95@mail.ru

Junior researcher at the Center for experimental pharmacology 

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files