Influence of different hypoxia types on p-glycoprotein functional activity and expression

Full Text

Гипоксия - типовой патологический процесс, осложняющий течение различных заболеваний, определяющий в той или иной степени их тяжесть и исход [1]. Повышение возраста пациентов в клинической практике привело к увеличению вероятности полиморбидности, в том числе наличия у них нозологий, для патогенеза которых характерна гипоксия (сердечная и дыхательная недостаточность, нарушение мозгового кровообращения и др.) [3]. В настоящее время лечение больных фармакологическими препаратами проводится в соответствии с принципами персонифицированной медицины, которая предполагает избирательный подход к каждому пациенту с назначением конкретного лекарственного средства в определенной дозе с учетом его индивидуальных генетических и фенотипических особенностей [2]. Эффективность и безопасность применения лекарственного препарата во многом зависит от его фармакокинетики, в регуляции которой принимают участие ферментные и транспортные системы организма, в частности микросомальные ферменты печени и белки-транспортеры, среди которых особая роль принадлежит гликопротеину P (Pgp). Pgp, или белок АВСВ1, - энергозависимый белок-транспортер, локализованный на апикальной поверхности клеточных мембран в различных тканях, функционирующий как эффлюксный насос, который препятствует проникновению в клетки широкого спектра эндогенных веществ и ксенобиотиков [7, 9]. Функциональная активность Pgp различается у представителей одного вида в результате генетических особенностей организма, а также варьирует под действием лекарственных веществ и факторов внешней и внутренней среды. При этом повышенная функциональная активность Pgp может привести к неэффективности фармакотерапии в связи со снижением всасывания лекарственных веществ в желудочно-кишечном тракте и их интенсивным выведением. С другой стороны, при ингибировании активности белка-транспортера может проявиться токсичность лекарственного средства вследствие уменьшения его экскреции [7, 9]. Учитывая вышеизложенное, для обеспечения рациональной фармакотерапии целесообразно изучение функциональной активности Pgp в условиях гипоксии. Оценить функционирование данного белка-транспортера можно путем исследования эффлюкса его субстратов на культуре клеток, гиперэкспрессирующих Pgp, определения количества иРНК гена MDR1 человека и mdr1 грызунов, кодирующих Pgp, анализа количества белка-транспортера и оценки фармакокинетики его маркерных субстратов (фексофенадина, дигоксина, домперидона) [7, 9]. В ряде работ проводились исследования функционирования Pgp в гипоксических условиях на культурах клеток. Так, в культуре эпителиальных и эндотелиальных клеток человека, подвергнутой гипоксическому воздействию (инкубирование при парциальном давлении кислорода 20 мм рт. ст., углекислого газа - 35 мм рт. ст.), отмечалось зависимое от продолжительности гипоксии увеличение содержания иРНК гена MDR1 (в 2,2 и 7,1 раза по сравнению с контролем после 6 и 18 ч соответственно) и возрастание количества самого транспортера. Максимальный уровень Pgp наблюдался после 48 ч гипоксического воздействия, дальнейшего возрастания содержания белка-транспортера после увеличения продолжительности гипоксии до 72 и 96 ч не происходило. После влияния умеренной гипоксии в течение 48 и 24 ч в культурах клеток наблюдалось повышение активности Pgp, выявленное путем анализа изменений степени ингибирования верапамилом эффлюкса субстратов белка-транспортера - дигоксина и родамина-123 и оценки устойчивости клеток к доксорубицину [23]. Выявлено, что 24-часовое воздействие гипоксии (инкубирование при парциальном давлении кислорода менее 0,5 мм рт. ст.) на культуру опухолевых клеток линии LS513 при физиологическом значении pH не приводило к достоверному изменению активности, оцененной по интенсивности эффлюкса даунорубицина и степени экспрессии Pgp, в то время как экстрацеллюлярный ацидоз (pH = 6,6) стимулировал Pgp-опосредованный эффлюкс субстрата белка-транспортера. При этом экспрессия Pgp также не претерпевала изменений, что свидетельствовало о непосредственной модуляции функциональной активности транспортера [13]. При инкубировании культуры опухолевых клеток (small normoxic multicellular tumor spheroids) в гипоксических условиях (содержание кислорода в воздухе 1 %) в течение 72 ч наблюдалась интенсификация экспрессии Pgp, ассоциированная с увеличением количества гипоксия-индуцируемого фактора - 1α (hypoxia inducible factor 1α - HIF-1α). Аналогичная картина наблюдалась и при инкубировании клеток в среде, содержащей 100 мкмоль хлорида кобальта или 130 мкмоль DFA-компонентов, вызывающих цитотоксический тип гипоксии. Авторами показано, что добавление в среду инкубации акцепторов свободных радикалов, таких как витамин Е (30 мкмоль), APDC (0,2 µM), DHA (2,5 mM) и NAC (20 мкмоль) - веществ, снижающих внутриклеточную концентрацию активных форм кислорода, приводило к росту уровня HIF-1α и Pgp, а 24-часовое инкубирование клеток с перекисью водорода (200 мкмоль) и BSO (50 мкмоль) - к его снижению, что может свидетельствовать о зависимости экспрессии белка-транспортера от окислительно-восстановительного статуса клеток. При этом в условиях гипоксии количество активных форм кислорода также сниженно, что, возможно, повышает стабильность белка-транспортера [36]. Введение в культуру клеток молочной кислоты или воздействие на нее гипоксических условий (8 % O2) приводило к линейному возрастанию активности Pgp [32]. При ацидификации клеток опухоли предстательной железы крыс, а также при снижении pH путем интенсификации анаэробного метаболизма у крыс in vivo получены аналогичные результаты [28]. С другой стороны, в работе по изучению устойчивости культуры опухолевых клеток EMT6/R к ряду цитостатиков в условиях гипоксии (12-часовое влияние газовой смеси, содержащей менее 10 ppm кислорода) не выявлено корреляции между содержанием в клетках адриамицина - субстрата Pgp - и резистентностью к нему, которая была достоверно выше, чем в нормоксических условиях. При этом в течение 10 ч гипоксии не наблюдалось изменений клеточных циклов, однако к 12 ч было выявлено снижение количества клеток, находящихся на стадии S, на 10 %. Кроме того, интенсивность эффлюкса адриамицина в условиях нормо- и гипоксии не отличалась. Это может служить доказательством того, что индуцированная гипоксией лекарственная устойчивость отлична от Pgp-модулируемой химиорезистентности. Следует отметить, что в данном исследовании гипоксия приводила к повышению устойчивости клеток к адриамицину, 5-флюороурацилу и актиномицину D, но не к колхицину, винкристину и цисплатину, хотя все лекарственные средства, за исключением 5-флюороцистеина и цисплатина, принадлежат к числу субстратов Pgp. При помещении клеток в среду с нормальным содержанием кислорода резистентность к химиотерапии исчезала [27]. В исследованиях устойчивости злокачественных опухолевых клеток к 5-флюороурацилу в условиях гипоксии показано, что она объясняется задержкой клеточного цикла на стадии G1 из-за активации экспрессии ингибиторов митотического цикла p21 и p27 и стимуляции экспрессии циклина D; при этом активации Pgp не наблюдалось [39]. В другой работе выявлено формирование резистентности культуры клеток фибробластов легкого китайских хомячков к адриамицину и этопозиду после гипоксического воздействия (менее 0,1 % кислорода в культуральной среде в течение 30 мин), причем чувствительность полностью восстанавливалась через 24 ч реоксигенации. Следует отметить, что ингибитор Pgp верапамил не модулировал резистентности клеток к адриамицину - субстрату белка-транспортера, что свидетельствует об отличном от Pgp-индуцированного механизма формирования устойчивости. С другой стороны, не исключается роль модификации структуры цитоплазматической мембраны, в связи с тем что подвергнутые гипоксии клетки приобретали также устойчивость к супероксидным радикалам. Аналогичные исследования на культурах человеческих опухолевых клеток молочной железы с различными уровнями экспрессии рецепторов к эпидермальному ростовому фактору и эстрогенам не выявили подобных изменений, подтверждая видо- и тканеспецифичность формирования лекарственной устойчивости в условиях дефицита кислорода [19]. Ряд исследований в изученной нами литературе был посвящен оценке экспрессии и функциональной активности Pgp в условиях гипоксии на животных. В эксперименте на 30 половозрелых крысах (две группы из 12 опытных и 18 контрольных животных) с использованием методов Western blotting и ПЦР показано повышение экспрессии Pgp в миокарде, а также увеличение количества миокардиальной и печеночной иРНК гена mdr1a и миокардиальной иРНК гена mdr1b в результате воздействия на животных интермиттирующей дыхательной гипоксии в течение двух недель [14]. В исследовании in vivo 48-часовое воздействие на крыс нормобарической нормокапнической гипоксической гипоксии (содержание кислорода во вдыхаемом воздухе - 8 %, парциальное давление кислорода в артериальной крови - 35 мм рт. ст.) приводило к возрастанию уровня иРНК гена mdr1b и количества Pgp в гепатоцитах [16]. Моделирование печеночной портальной гипертензии у крыс путем частичной перевязки портальной вены приводило к стимуляции экспрессии HIF-1α и Pgp в нейронах коры. Подобные изменения предположительно связаны с гипераммониемией и стабилизацией HIF-1α [31]. Исследование экспрессии Pgp у 3-месячных крыс со спонтанной гипертензией, предрасположенных к инсульту (3-month-old stroke-prone spontaneously hypertensive rats), показало более интенсивную экспрессию белка-транспортера и его иРНК в сосудах гиппокампа, чем у контрольных животных, а также по сравнению с сосудами коры [34]. Моделирование на кроликах породы Шиншилла подострой гипобарической гипоксической гипоксии средней тяжести путем помещения животных в барокамеру и подъема «на высоту» 6000 м над уровнем моря приводило к увеличению функциональной активности Pgp в печени, почках и слизистой оболочке кишечника, что было выявлено по анализу фармакокинетики маркерного субстрата белка-транспортера - фексофенадина [6]. Двусторонняя окклюзия общих сонных артерий у крыс wistar приводила к возрастанию экспрессии Pgp в гематоэнцефалическом барьере в лобном, височном и теменном отделах коры головного мозга к 4-му часу ишемии в среднем на 134,8 % (p < 0,01). Более длительная двусторонняя окклюзия общих сонных артерий крыс вызывала летальный исход. Односторонняя окклюзия общей сонной артерии сопровождалась снижением экспрессии Pgp через 12 ч от момента окклюзии на 59,2 % (p < 0,05) и ее возрастанием на 5-е сутки на 65,9 % (p < 0,05). При окклюзии общей сонной артерии в течение 30 мин с последующей реперфузией в течение 30 мин, 60 мин, 1,5 ч, 4 ч, 12 ч, 24 ч, 5 суток и 14 суток наблюдалось снижение экспрессии Pgp в гематоэнцефалическом барьере через 4 и 12 ч после реперфузии на 61,3 и 74,8 % (p < 0,05) [5, 8]. Перманентная окклюзия средней мозговой артерии у крыс-самцов в течение 4 ч приводила к стимуляции экспрессии Pgp в гематоэнцефалическом барьере и нейронах головного мозга, что было выявлено методом Western blotting, а также росту функциональной активности данного белка-транспортера и снижению внутриклеточного содержания его субстратов (родамина-123, флюоресцеина натрия и нимодипина). Однако через 6 ч в зоне ишемии содержание субстратов начинало возрастать, несмотря на все еще повышенную экспрессию Pgp, что может быть связано со значительным ростом проницаемости гематоэнцефалического барьера в зоне ишемии в данный период наблюдения [11]. Аналогичные результаты получены в результате помещения монослоя культуры эндотелиальных клеток мозговых микрососудов и астроцитов крыс в среду, не содержащую глюкозы, а также воздействия на них бескислородной газовой смеси (5 % СО2, 95 % N2): внутриклеточное накопление родамина-123 - субстрата Pgp было снижено в первые 3 ч экспериментального воздействия из-за увеличения экспрессии и функциональной активности белка-транспортера, однако начиная с 4 ч оно постепенно увеличивалось в связи с ростом проницаемости монослоя клеток. Интенсификацию экспрессии Pgp авторы связывают с сигнальными механизмами, включающими фактор некроза опухолей - α, эндотелин-1, синтазу оксида азота и протеинкиназу С [17]. В настоящее время известно, что основная роль в индукции экспрессии гена MDR1, кодирующего Pgp, и повышении функциональной активности белка-транспортера в гипоксических условиях принадлежит транскрипционным факторам HIF-1 [7, 12, 13, 20, 36, 37] и specificity protein 1 (Sp1) [12]. Наиболее изучено влияние фактора HIF-1 на функционирование Pgp при гипоксии. HIF-1 - это полипептид, содержащийся в клетках всех типов, который ответственен за компенсаторно-приспособительные изменения транскрипционной активности организма в гипоксических условиях, проявляющиеся в модуляции синтеза некоторых транспортеров глюкозы, эритропоэтина, сосудистого эндотелиального ростового фактора, ряда ферментов цикла Кребса и гликолиза, а также изменении неоангиогенеза и тонуса кровеносных сосудов. Кроме того, HIF-1 в определенных условиях может вызывать апоптоз, индуцируемый гипоксией [24, 21]. HIF-1 функционирует в форме белкового гетеродимера, состоящего из двух субъединиц: HIF-1α (молекулярная масса 120 кДа) и HIF-1β (известной также как ARNT - aryl hydrocarbon nuclear translocator; молекулярная масса 91-94 кДа), каждая из которых на N-конце имеет домен типа «спираль-петля-спираль» (basic helix-loop-helix, или bHLH-домен) и зоны гомологии PER-ARNT-SIM (или PAS-домен), необходимые для димеризации и связывания с ДНК. HIF-1α на C-конце содержит два трансактивационных домена, которые связывают коактиваторы, такие как CBP, p300, SRC-1 и TIF-2, активность которых угнетается внутриклеточным кислородом, а также ряд доменов, ответственных за гипоксия-индуцированную локализацию и стабилизацию полипептида [13, 24, 29]. В то время как HIF-1β-субъединица постоянно присутствует в клетке и способна образовывать гетеродимеры с различными молекулами, содержащими домен bHLH-PAS (basic helix-loop-helix PER-ARNT-SIM), HIF-1α-субъединица является обязательным кислородчувствительным компонентом HIF-1: экспрессия ее иРНК, период полужизни молекулы и активность трансактивационного домена определяются клеточным содержанием кислорода. В условиях нормоксии она находится в форме, доступной для убиквитирования (по последовательности аминокислот 429-608) и протеосомальной деградации комплекса с убиквитинлигазой von Hippel-Lindau (VHL). Для связывания с VHL необходимо предварительное посттрансляционное гидроксилирование двух остатков пролина в положении 564 HIF-1α и ацетилирование остатка пролина в ODDD-домене (oxygen dependent degradation domain) с помощью ферментативных реакций, требующих наличия кислорода и железа [24, 26]. Показано, что воздействие на культуру клеток гепатомы человека Hep 3B газовой смесью, содержащей 1 % кислорода, в течение 4 ч приводило к нарастанию количества иРНК субъединиц HIF-1α и HIF-1β с достижением максимума через 1-2 ч гипоксического воздействия. Через 4 ч уровень иРНК обеих субъединиц возвращался к исходному, а через 16 ч гипоксии наблюдался очередной подъем ее содержания. При последующем помещении культуры клеток в газовую смесь, содержащую 20 % кислорода, уровень иРНК HIF-1α и HIF-1β становился ниже первоначального в течение 5 минут. Добавление в клеточную культуру 75 ммоль хлорида кобальта приводило к возрастанию количества иРНК обеих субъединиц через 4 ч, снижению - через 8 ч и повторному возрастанию через 16 ч экспозиции. Добавление в среду 130 ммоль дефероксамина приводило к достижению пика концентрации иРНК через 1-2 ч [35]. В условиях кислородного дефицита субъединица HIF-1α стабилизируется, транспортируется в ядро и образует димер с ARNT, после чего связывается с областями ДНК, ответственными за гипоксический ответ организма, содержащими так называемые гипоксия-реактивные элементы - hypoxia response element (HRE), а также cis-активные элементы - регуляторы транскрипции (cis-acting transcriptional-regulatory element) более чем 60 генов [29], в том числе гена MDR1. Данная область представляет собой последовательность нуклеотидов 5’-GCGTG-3’, расположенную на расстоянии от -49 до -45 пар нуклеотидов от сайта старта транскрипции [12, 14]. Снижение внутриклеточного содержания HIF-1α приводит к угнетению экспрессии гена MDR1 в условиях нормоксии и почти полностью устраняет индуцирующее влияние гипоксии на экспрессию данного гена. Делеция зоны промотора гена MDR1, включающего HIF-1α-связывающий сайт, приводит к аналогичным результатам [12]. Стабильность HIF-1, интенсивность его экспрессии и связывания с ДНК регулируются посредством различных механизмов. Показано угнетение способности HIF-1 взаимодействовать с соответствующими областями ДНК у животных с возрастом [29]. Выявлен полиморфизм кодирующей области гена Pro582-Ser, экспрессирующего кислородчувствительную субъединицу HIF-1α 1772C > T, которая определяет различный сосудистый ответ на гипоксию. Установлено, что сочетание курения и носительства аллели 1772 Т статистически значимо повышает вероятность возникновения у ее носителей аневризмы брюшной аорты [30]. HIF-1α взаимодействует с белком p53, который модулирует его стабильность в гипоксических условиях [24]. Выявлено влияние NF-kB (nuclear factor kappa-B), функционирующего в форме гетeродимера субъединиц p50 или p52 с субъединицей p65, на базальную экспрессию HIF-1α с увеличением количества его иРНК и уровня самого белка, а также на его активацию в условиях нормоксии [4]. В неактивном состоянии транскрипционный фактор NF-kB находится в цитоплазме в комплексе с ингибитором Ikb (inhibitor of NF-kB). Фактор некроза опухолей - α, онкогены, цитокины, активные формы кислорода и УФ-излучение приводят к фосфорилированию Ikb, его протеосомальной деградации, транспортировке активного димера NF-kB в ядро и его связыванию с генами-мишенями, в том числе с промотором гена, кодирующего HIF-1α [33]. Выявлено, что трансфекция microRNA-21 в клетки рака яичников A2780 приводила к индукции экспрессии HIF-1α [38]. Обнаружен полипептид FIH-1 (factor inhibiting HIF-1) - негативный регулятор функциональной активности трансактивационных доменов HIF-1α субъединицы, связывающийся в положении 757-826 с ее С-терминальным концом в условиях нормоксии [24]. Негативное влияние на экспрессию и активность HIF-1α оказывает транскрипционная корепрессор-гомеодомен-взаимодействующая протеинкиназа-2 (Homeodomain-interacting proteinkinase-2 - HIPK2), что приводит к снижению транскрипционной активности HIF-1 и угнетению экспрессии Pgp с последующим увеличением чувствительности опухолевых клеток к адриамицину - субстрату данного белка-транспортера. Причем данное влияние выявлено в условиях как нормо-, так и гипоксии [25]. HIF-1-связывающий сайт на промоторе гена MDR1 включает также область контакта с транскрипционным фактором Sp1. Транскрипционный фактор Sp1 является наиболее активным индуктором экспрессии и относится к I подгруппе Sp/KLF-семейства [18]. Представители семейства Sp-белков (называемые также krüppel-like factors - KLF) связываются с так называемыми Sp1-сайтами (GC-бокс, GT-бокс, CACCC-бокс) промоторов или энхансеров различных генов и регулируют их экспрессию, участвуя в клеточной пролиферации, ангиогенезе, апоптозе и опухолевой прогрессии. Их молекулы включают три высококонсервативных ДНК-связывающих домена (65 % сходства нуклеотидной последовательности у различных членов семейства), каждый из которых формирует структуру типа «цинковый палец» на С-конце и способствует связыванию транскрипционного фактора с соответствующими участками генома и межбелковым взаимодействиям, вариантный N-концевой домен, ответственный за трансактивационную или ингибирующую активность и способность связываться с корепрессорами и коактиваторами, а также структуру, регулирующую ядерную локализацию фактора [10, 15, 18, 22]. В активации и ингибировании экспрессии генов под влиянием членов Sp1/KLF-семейства ведущая роль отводится деацетилированию и ацетилированию гистонов [18]. Установлено, что угнетение экспрессии транскрипционного фактора Sp1 с помощью антисмысловых нуклеотидов приводило к снижению активности промотора гена MDR1, однако в меньшей степени, чем при ингибировании экспрессии HIF-1α. Это свидетельствует о том, что Sp1 совместно с HIF-1 способствует индукции экспрессии Pgp в условиях кислородного дефицита [12]. Заключение Таким образом, в исследованиях in vitro и in vivo продемонстрировано изменение функционирования Pgp под воздействием гипоксии различных видов. В большинстве научных работ показано усиление экспрессии и функциональной активности транспортера, что авторы связывают с активацией транкрипционных факторов HIF-1 и Sp1. Однако ряд исследований опровергает заключение об однозначной индукции активности Pgp в условиях гипоксии, что свидетельствует о сложных, характеризующихся видо- и тканеспецифичностью механизмах, вовлеченных в регуляцию работы Pgp, их зависимости от вида гипоксии, уровня кислородного дефицита и его продолжительности, окислительно-восстановительного статуса и других параметров. Более детальное изучение экспрессии и функциональной активности белка-транспортера в гипоксических условиях и выявление механизмов их изменения будет способствовать уточнению фармакокинетики лекарственных средств - субстратов Pgp у пациентов с заболеваниями, в развитии которых существенную роль играет гипоксия.

About the authors

Elena N Yakusheva

Ryazan State Medical University

Email: e.yakusheva@rzgmu.ru
M.D., professor, head of the chair of pharmacology with a course of pharmacy of faculty of additional professional education

Ivan V Chernykh

Ryazan State Medical University

Email: ivchernykh88@mail.ru
M.D., Ph.D., assistant of the chair of the general chemistry with a course of bioorganic and organic chemistry

Aleksey V Shulkin

Ryazan State Medical University

Email: alekseyshulkin@rambler.ru
Ph.D., assistant of the chair of pharmacology with a course of pharmacy of faculty of additional professional education

Natalia M Popova

Ryazan State Medical University

Email: p34-66@yandex.ru
Ph.D., assistant of the chair of pharmacology with a course of pharmacy of faculty of additional professional education

References