Biological role of miRNA-146a at virus infections. Modern strategy of search of new safe pharmacological agents for treatment

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

В последнее время значительно возросло число работ, посвященных изучению малых некодирующих РНК или интерферирующих РНК (RNAi), модифицирующих процесс транскрипции и трансляции [1, 2]. Известны три основных класса интерферирующих РНК: короткие интерферирующие РНК (short interfering RNA — siRNA), микроРНК (miRNA), пиРНК (piinteracting RNA). Короткие РНК действуют в составе белкового комплекса RISC (RNA-induced silencing complex), который включает в себя такие важные ферменты, как хеликаза и нуклеаза. При комплементарном взаимодействии с таргетным участком информационной (матричной) (мРНК) данный комплекс вызывает расщепление мРНК на фрагменты и последующую деградацию.

МикроРНК (miRNA) как малые некодирующие РНК также участвуют в посттранскрипционной регуляции экспрессии генов. Название микроРНК происходит от их небольшого размера (размером 19–25 нуклеотидов). МикроРНК, выполняя свою ключевую функцию, влияют на различные биологические функции организма, нарушая регуляцию генов-мишеней во время патологических реакций и нормального развития. Физиологические функции микроРНК крайне разнообразны — фактически они выступают основными небелковыми регуляторами онтогенеза. МикроРНК не отменяют, а дополняют «классическую» схему регуляции генов (индукторы, супрессоры, компактизация хроматина и т. д.). Кроме того, синтез самих микроРНК регулируется сложным образом, определенные пулы микроРНК могут включаться интерферонами, интерлейкинами, фактором некроза опухолей (ФНО-α) и многими другими цитокинами. В результате вырисовывается потрясающая по своей сложности и гибкости многоуровневая сеть настройки «оркестра» из тысяч генов, но и этим дело не заканчивается.

MикроРНК более «универсальны», чем киРНК: «подопечные» гены не обязательно должны быть на 100 % комплементарны, все равно регуляция осуществляется и при частичном взаимодействии. На сегодняшний день одна из самых горячих точек в молекулярной биологии — это поиск микроРНК, которые выступают альтернативными регуляторами ключевых физиологических процессов. Например, уже описаны микроРНК, участвующие в регуляции клеточного цикла и апоптоза у растений, дрозофилы и нематоды; у человека микроРНК участвуют в регуляции иммунной системы [165, 169] и дифференцировке гематопоэтических стволовых клеток [128]. Применение технологий на основе биочипов (micro-array screening) показало, что на различных этапах жизни клеток включаются и выключаются целые пулы малых РНК. Для биологических процессов уже идентифицировали десятки специфичных микроРНК, уровень экспрессии которых при определенных условиях изменяется в тысячи раз, подчеркивая исключительную управляемость этих процессов.

Последовательные события обработки вызывают получение зрелых микроРНК из первичных транскриптов (pri-микроРНК). В ядре пре-микроРНК перерабатываются в короткую шпильку из примерно 70 нуклеотидов (пре-микроРНК) с помощью РНК-полимеразного комплекса (фермент РНК-полимеразы III, Drosha/DGCR8 и другие факторы) [93]. Этот продукт содержит несущую нить микроРНК и зрелую направляющую нить микроРНК. Нагруженный комплекс RISC (RNA-induced silencing complex — RISC) спаривается с целевыми мРНК, что приводит к снижению экспрессии целевого гена [31, 150].

Пре-микроРНК экспортируются в цитоплазму через взаимодействие с Ran-GTP и Exportin-5, где она подвергается дальнейшей обработке с помощью фермента Dicer для получения приблизительно 20–22 нуклеотидов двухцепочечной микроРНК (рис. 1).

 

Рис. 1. Схема биогенеза микроРНК в организме млекопитающих (по: [85] с изменениями)

 

Значение уровня биогенеза микроРНК в иммунной системе подчеркивается тем, что условия действия факторов, участвующих в обработке микроРНК, например белка Dicer, приводит к подавлению нормального функционирования Т- и В-клеток. Кроме того, повышенная или пониженная регуляция отдельных микроРНК приводит к глубокому нарушению целевой функции и/или полному блокированию клеток иммунной системы [75, 150].

Установлено, что различные вирусные инфекции могут по-разному влиять на уровень экспрессии определенных микроРНК в клетках человека. Отмечают также, что нарушение регуляции экспрессии микроРНК при вирусной инфекции играет существенную роль на разных этапах деятельности вирусов, включая уклонение от иммунной системы человека, стимулирование выживания клеток, регуляцию экспрессии вирусных генов и поддержание латентной и персистирующей вирусной инфекции [20].

Различные микроРНК были известны как опухоль-супрессивные или опухоль-стимулирующие биомаркеры (oncomiR), основанные на характере целевого гена. Опухолесупрессивные микроРНК могут быть нацелены на вызывающие рак гены, и уровень их экспрессии в раковых клетках снижается. И наоборот, онкомикроРНК ингибируют экспрессию генов-ингибиторов опухоли и в основном сверхэкспрессируются при патологических состояниях [3–5]. Следует отметить, что индивидуальная микроРНК (например, микроРНК-146a) может быть супрессором для одной злокачественной опухоли и онкомикроРНК — для другой. Следовательно, механизм РНК-интерференции может быть использован для разработки противовирусных средств, а также препаратов для лечения онкологических и некоторых генетических заболеваний [1, 6].

Таким образом, изучение малых регуляторных РНК в настоящее время представляется одной из наиболее перспективных и бурно развивающихся областей молекулярной биологии и фармакологии.

Общая характеристика микроРНК-146а

Несколько микроРНК, например микроРНК-146а, хотя и имеют одну и ту же последовательность нуклеотидов, кодируются через разные позиции или локусы в геноме. Установлено, что микроРНК-146a — это хорошо экспрессируемая микроРНК в различных видах клеток млекопитающих, имеет многочисленные доказательства своего участия в воспалении, дифференцировке и функционировании специализированных клеток адаптивного и врожденного иммуннитета [75, 150]. Ген микроРНК-146a расположен на хромосомах 5, 10 и 19 человека, в то время как у мышей он обнаружен только на хромосоме 11. Только по двум нуклеотидам различаются последовательности микроРНК-146b и микроРНК-146a, в то время как благодаря одной и той же последовательности нуклеотидов они должны были распознавать одни и те же мишени [95, 150]. Накопленные данные свидетельствуют, что микроРНК-146a действует как модулятор функции и дифференцировки клеток врожденного и адаптивного иммунитета [150]. Было показано, что микроРНК-146a экспрессируется по-разному в субпопуляциях Т-лимфоцитов человека. Так, уровень экспрессии микроРНК-146a повышается в Т-клетках памяти и понижается в нативных Т-лимфоцитах. Экспрессия этой микроРНК индуцируется при стимуляции Т-клеточного рецептора и, соответственно, в Т-лимфоцитах для запуска транскрипции микроРНК-146a необходимы сайты связывания С-ETS и NF-kB [30, 107, 164]. Кроме того, такая индукция регулирует гибель Т-клеток путем нацеливания fas-ассоциированного белка на домен смерти и последующего повреждения продукции ИЛ-2 и активности апоптозного белка AP-1 [30]. Регуляторные Т-клетки являются подсемейством CD4⁺ Т-клеток и играют важную роль в различных иммунных процессах, включая поддержание иммунного гомеостаза путем ограничения воспаления и предотвращения ослабления аутоиммунных реакций. Их ингибирующая функция необходима для выживания организмов и поддержания иммунного гомеостаза. L.-F. Lu и соавт. [107] сообщили, что микроРНК-146a обычно экспрессируется в регуляторных T-клетках, и проиллюстрировали, что это важно для функционирования этих клеток. Кроме того, пониженная регуляция микроРНК-146a, хотя и приводила к повышению количества регуляторных T-клеток, однако нарушала их функции и в результате приводила к нарушению иммунологической толерантности во многих органах [107]. Kроме того, STAT1 и интерферон-γ участвуют в повреждениях, опосредованных иммунным ответом, индуцированным дефицитом этой микроРНК в регуляторных T-клетках [150].

Клетки врожденного иммунитета хозяина, включая естественные киллеры (NK), а также моноциты, макрофаги, гранулоциты, эпителиальные клетки и нейтрофилы, как известно, являются первой линией защиты хозяина от патогенов. Было показано, что отдельные микроРНК участвуют в функционировании и развитии клеток врожденного иммуннитета. Например, уровень экспрессии нескольких микроРНК (микроРНК-21, микроРНК-9, микроРНК-146а, микроРНК-147 и микроРНК-155) повышается во время индуцированной инфекцией воспалительной реакции макрофагов [86]. В некоторых исследованиях наблюдалась связь между сигнальным путем NF-kB и экспрессией микроРНК-146a [150]. Так, в своей работе K.D. Taganov и соавт. [164] обнаружили, что экспрессия микроРНК-146a индуцируется при стимуляции липополисахаридами NF-kB-зависимым образом, а микроРНК-146a нацелена на гены IRAK1 и TRAF6 [150]. После активации рецептора клеточной поверхности (например, Tолл-4) молекулярный каскад, включающий гены IRAK1 и TRAF6, вызывает фосфорилирование и деградацию IkBa, что приводит к активации NF-kB и его ядерную транслокацию. Кроме того, активация NF-kB запускает экспрессию нескольких генов, в частности, pri-miR-146a. После загрузки микроРНК-146a в RISC зрелая микроРНК-146a способствует ослаблению рецепторной сигнализации при помощи подавления активности генов TRAF6 и IRAK1. Таким образом, микроРНК-146a контролирует сигнальный путь при помощи обратной регуляции, сопровождаемой активацией NF-kB [164, 165]. В нескольких работах опубликованы данные, что микроРНК-146a сверхэкспрессируется при ряде вирусных заболеваний и может выступать в качестве критического фактора развития вирусной инфекции при помощи подавления противовирусных факторов хозяина. Таким образом, наличие столь многочисленных функций у микроРНК-146a выдвигает ее на передний план в борьбе с вирусными инфекциями [75, 164].

МикроРНК-146a и вирусы гепатита

Инфекции, вызванные вирусом гепатита С (HCV) и вирусом гепатита В (HBV), — наиболее существенная причина фиброза печени, цирроза и гепатоцеллюлярной карциномы — стали одними из самых опасных вирусных инфекционных заболеваний во всем мире [13, 17, 170]. Гепатит-ассоциированные болезни в основном обусловлены определенными иммунологическими причинами, а не самими вирусами [14, 110] и являются итогом вирусной инфекции, поэтому эффективность противовирусного лечения в первую очередь зависит от иммунных факторов при взаимодействии вируса с организмом человека [114, 125, 171]. Таким образом, изучение механизмов, вовлеченных в инфекцию гепатитов, имеет решающее значение для разработки новых эффективных методов лечения от этих заболеваний [23, 91, 117]. Известно, что большинство эффекторных клеток врожденной иммунной системы экспрессируют рецепторы распознавания образов (PRRs), которые обладают достаточной специфичностью для распознавания патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (PAMPs) [166]. В настоящее время к семейству PRRs относятся цитоплазматические белки, а также Толл-подобные рецепторы (RLRs), C-лектиновые рецепторы, NОD-подобные рецепторы и RIG-I-рецепторы [166].

Интерфероны I типа являются важнейшим узлом обороны естественного иммунитета и срабатывают через рецепторы PRRs, поэтому производные интерферона стали начальным этапом в разработке средств лечения от многих вирусных заболеваний, например гепатита В и C [15, 40, 174]. Интерферон I типа взаимодействует с общими рецепторными комплексами, которые широко экспрессируются на дендритных клетках, Т-клетках и NK-клетках. После взаимодействия интерферона со своим рецептором он активирует путь STAT–JAK, а затем фосфорилированный STAT1/2 перемещается в ядро [69]. Кроме того, этот комплекс связывается с интерферон-стимулированным элементом ответа, активируя таким образом транскрипцию различных интерферон-индуцибельных генов. Продукты этих генов функционируют как интерферон-индуцибельные противовирусные эффекторы [134]. Показано, что в гепатоцитах, инфицированных вирусом гепатита В, интерферон-α может привести к повышенной деградации вирусных РНК через протеасомно-зависимый путь, а также ингибировать образование частиц ядра, предотвращать синтез вирусного белка и, наконец, приводить к полному подавлению продукции вирионов [79, 121]. Kроме того, интерферон-α может активировать ответ адаптивной и врожденной противовирусной иммунной системы для достижения непрерывного антивирусного эффекта за счет усиления экспрессии интерферона-I, усиления вирус-специфичной пролиферации CD8⁺ Т-клеток, а также усиления секреции интерферона-С и ФНО-α [108]. Хотя препараты на основе интерферона-α, вакцины и измененные нуклеозид/нуклеотидные ингибиторы широко применяются в клинике, профилактика и лечение от гепатита В по-прежнему является значимой и трудоемкой задачей [58]. В настоящее время установлено, что многие микроРНК играют существенную роль в модуляции иммунного ответа, и они предоставили нам новый инструмент для изучения того, как работает иммунная система человекa [18]. Установлено, что микроРНК-146a — это одна из тех микроРНК, которая была сверхэкспрессирована при нескольких известных вирусных инфекционных заболеваниях. Кроме того, микроРНК-146a участвует в противоопухолевых и противовирусных врожденных иммунных реакциях, а также является критическим негативным регулятором иммунных путей, включая сигнальные пути RLR и TLR [67, 90]. В некоторых исследованиях продемонстрирована повышенная регуляция микроРНК-146a у гепатит-положительных пациентов с гепатокарциномой по сравнению с контрольными группами [123, 193]. Последующие экспериментальные исследования показали, что потеря Толл-рецепторов активирует сигнальные проводящие пути и эффективно повышает клиренс гепатит B-инфекции, что предполагает, что блокировка путей активации эффективна для подавления репликации вируса гепатита В [55].

Примечательно, что блокировка сигнальных проводящих путей обладает двойным эффектом, действуя в течение инфекции гепатита B, одновременно выступая в качестве индикатора врожденного иммунитета и антигепатит-фактора [153]. Таким образом, распознавание гепатита через уровень микроРНК и индукцию связанных сигнальных путей, вероятно, является важнейшим внутриклеточным механизмом против вируса гепатита B, играющим существенную роль во взаимодействии вируса с клеткой человека. Исследователи Z. Hou и соавт. [68] показали, что вирус гепатита B подавляет внутреннюю иммунную сигнализацию RIG-G и RIG-I, индуцируя экспрессию микроРНК-146a, что приводит к ингибированию продукции интерферона-I и последующую стимуляцию интерфероном генного ответа. Эти события приводят к нарушению противовирусных врожденных иммунных реакций человека.

В 2013 г. S. Wang и соавт. [175] исследовали механизм, лежащий в основе роли микроРНК-146a в регуляции Т-клеточных иммунных реакций при хроническом гепатите В. Они обнаружили, что экспрессия микроРНК-146a в Т-клетках значительно повышается при хроническом гепатите. Как вирусные факторы, так и воспалительные цитокины приводят к увеличению экспрессии микроРНК-146a в Т-клетках, а подавление, как показано in vitro, микроРНК-146a в Т-клетках способствует вирус-специфической активности Т-клеток человека. Результаты этого экспериментального исследования свидетельствуют, что повышенная регуляция микроРНК-146a при хроническом гепатите ухудшает активность Т-клеток, нацеливаясь на STAT1, и, вероятно, способствует ухудшению иммунопатогенеза и иммунным дефектам при хронической инфекции гепатита B [175].

Как уже упоминалось выше, первой линией защиты человека от инфекционных агентов является врожденный иммунитет, развившийся для распознавания PAMP. PAMP распознаются клеточными рецепторами (например, RLR и TLR), которые экспрессируются в клетках иммунной системы и затем индуцируют широкий спектр экспрессии цитокинов, которые, в свою очередь, активируют воспалительные и адаптивные иммунные реакции. После активации рецептора TLR адаптерный белок IRAK1/TRAF6 и ген первичного ответа дифференцировки MyD88 рекрутируются в комплекс сигнальных молекул, которые активируют фактор транскрипции NF-kB и приводят к сверхэкспрессии генов, связанных с иммунным ответом, включая про- и противовоспалительные цитокины (ИЛ-23, ИЛ-12, TGF-β и ИЛ-10) и интерфероны I типа (IFN-α и IFN-β), которые играют критическую роль в удалении вторгшихся патогенов. С другой стороны, вирусы, способствующие персистирующей инфекции, в том числе ВИЧ, вирусы гепатита С и В, выработали множество стратегий, направленных на подрыв иммунных реакций человека или уклонение от них. Механизмы этой стратегии бегства от иммунных реакций человека еще предстоит выяснить [88, 101, 112, 145]. Было показано, что микроРНК-146a регулирует выработку воспалительных цитокинов, нацеливаясь на фактор IRAK1. Другой фактор FOXP3 (Forkhead-box transcription factors), который известен как специфический маркер T-регуляторных клеток, контролирует функцию и развитие этих клеток. Имея FOXP3 T-регуляторные клетки сохраняют иммунный гомеостаз, ограничивая различные типы воспалительных реакций. Было продемонстрировано, что микроРНК-146a в норме экспрессируется в T-регуляторных клетках и играет ключевую роль в их ингибирующих функциях [107]. Исследователями J.P. Rеn и соавт. [146] в 2016 г. было продемонстрировано, что уровень микроРНК-146a повышен в моноцитах от гепатит-инфицированных пациентов по сравнению с контролем, в то время как он был понижен в моноцитах пациентов с гепатитом C. Индукция микроРНК-146a при инфицировании вирусом гепатита C и различные ответы на стимуляцию рецепторов TLR восстанавливаются в моноцитах, культивируемых совместно с гепатоцитами без или с вирусной инфекцией [38]. Примечательно, что ингибирование микроРНК-146a в моноцитах пациентов, инфицированных гепатитом С, приводит к снижению экспрессии ИЛ-10, TGF-β и ИЛ-23 опосредуемой ингибированием STAT3 и индуцированием супрессора цитокиновой сигнализации SOCS1, а это впоследствии приводит к снижению T-регуляторных клеток, накопленных во время гепатит-инфекции. Результаты этого исследования свидетельствуют, что микроРНК-146a от гепатитных пациентов регулирует STAT3/SOCS1 и экспрессию цитокинов в моноцитах, способствуя росту количества T-регуляторных клеток [144].

МикроРНК-146а при ВИЧ-инфекции

Вирус иммунодефицита человека ВИЧ-1, являющийся возбудителем синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД), был открыт более трех десятилетий назад. Способность ВИЧ-1 связываться и проникать в CD4⁺ Т-лимфоциты зависит от оптимальной экспрессии рецептора CD4⁺ на поверхности этих клеток. Тем не менее рецепторы хемокинов, в частности CXCR4 и CCR5, являются не менее важными корецепторами, которые наряду с молекулами CD4⁺ на мембране Т-лимфоцитов и других клеток, таких как дендритные клетки, а также макрофаги/моноциты, позволяют ВИЧ-1 проникать в эти клетки [118, 179]. Кроме того, CXCR4 и CCR5 — подходящие мишени для лекарственных препаратов, направленных на подавление проникновения ВИЧ-1 в первичные Т-лимфоциты и макрофаги [60, 72, 156]. Препарат AMD3100 (plerixafor, Mozobil®) впервые был признан очень специфичным антагонистом CXCR4 и рассматривался исследователями для лечения ВИЧ-1 [61]. B 2008 г. С. Labbaye и соавт. [89] показали, что CXCR4 является мишенью для микроРНК-146a в клетках онкогематологических больных, а также определили, что промиелоцитарный лейкозный рецептор PLZF действует как ингибитор этой микроРНК в мегакариоцитах. Позже, в 2015 г. исследователь M.T. Quaranta и соавт. [144] установили, что подавление микроРНК-146a при помощи PLZF приводит к усилению регуляции CXCR4 и TRAF6, что способствует ингибированию ВИЧ-инфекции в первичных CD4⁺ Т-клетках человека. Кроме того, сверхэкспрессия микроРНК-146a при блокировке PLZF или лечении AMD3100 снижает уровень экспрессии CXCR4 и ингибирует ВИЧ-1-инфицированные CD4⁺ Т-клетки и клеточную линию моноцитарного лейкоза [144].

Инфекция ВИЧ-1 часто связана с хроническим воспалением головного мозга, где микроглиальные клетки/макрофаги, вероятно, являются основным резервуаром для ВИЧ-1 [32]. Когда микроглиальные клетки инфицированы ВИЧ, то они выделяют различные хемокины и цитокины, в том числе MCP. Кроме того, хемокиновые рецепторы играют свою особую роль в вирусных заболеваниях; например, CCR-5 — основной корецептор для проникновения ВИЧ-1 в клетки человека [10, 36]. MCP-2, также известный как CCL8 у человека, — эффективный лиганд для CCR5, CCR1 и CCR2, и поэтому обладает потенциалом ингибировать проникновение ВИЧ-1, опосредованное CD4/CCR5 [45, 46]. Исследователи J.P. Rеn и соавт. [146] проанализировали изменение уровня экспрессии микроРНК-146a в первичных клетках микроглии головного мозга человека, инфицированных ВИЧ-1. Они установили, что экспрессия микроРНК-146a значительно повышается в клетках микроглии, инфицированных ВИЧ-1, по сравнению с неинфицированными. Кроме того, в этом же исследовании показано, что повышенная экспрессия микроРНК ингибирует индуцированное ВИЧ высвобождение CCL8/MCP-2 и приводит к предотвращению супрессивных эффектов CCL8/MCP-2 на проникновение вируса [49]. Клиническая значимость этого факта была оценена между этими находками и образцами от пациентов с ВИЧ-энцефалитом, было замечено, что в образцах микроглии головного мозга уровень CCL8/MCP-2 был понижен, а уровень экспрессии микроРНК-146a, наоборот, повышен. Этот результат указывает на важную роль микроРНК-146a в поддержании хронического воспаления головного мозга при ВИЧ-1 [146].

Один из хемокинов, высвобождаемых макрофагами после вирусной инфекции, — хемокиновый лиганд CCL5, нередко обозначаемый как RANTES. CCL5 служит хемоаттрактантом иммунных клеток, которые в основном экспрессируют CCR5, а также другие CCL5-чувствительные рецепторы, включая CCR1 и CCR3 [48, 157]. Позже было обнаружено, что CCL5, по сравнению с другими хемокинами, является более мощным рекрутером Т-клеток. Все больше исследований доказывают, что CCL5 связан с патогенезом ВИЧ-1 [42, 78, 82]. Кроме того, одна из важных ролей CCL5 в макрофагах состоит в привлечении моноцитов из кровотока в ткани. Примечательно, что мРНК CCL5 также была идентифицирована как мишень микроРНК-146a в макрофагах человека, полученных из моноцитов, и, нацеливаясь на 3'-нетранслируемую область (3'НТО) CCL5, микроРНК-146a приводит к ограничению продукции CCL5, индуцированной ВИЧ-1 в макрофагах. Однако обмен моноцитами вызывает многогранные функции. Во-первых, потребность в моноцитах имеет важное значение для контроля и клиренса инфекций. С другой стороны, рекрутирование моноцитов способствует патогенезу дегенеративных и воспалительных заболеваний. Кроме того, рекрутирование моноцитов повышает доступный пул макрофагов/моноцитов для ВИЧ-инфекции [28, 82]. Однако вклад регулирующего направления CCL5/микроРНК-146a в моноцитарно-макрофагальное взаимодействие в патогенезе ВИЧ-1 остается еще мало изученным. В целом, ВИЧ-1-индуцированная микроРНК-146a уменьшает миграцию моноцитов через таргетинг CCL5 в первичных макрофагах и, вероятно, вносит свой важный вклад в патогенез ВИЧ-1 [22].

МикроРНК-146а при гриппе

У людей вирус гриппа А — это самый распространенный респираторный патоген, потенциально способный привести к глобальным пандемиям. Примечательно, что этот вирус способен размножаться в клетках по всему дыхательному тракту [21, 119, 124]. Клетки эпителия в носу человека выполняют роль важнейшего барьера, защищающего нас от респираторных инфекций. Модуляция воспалительных процессов в дыхательных путях, вызывающая снижение дыхательных функций и повреждение эпителия, является альтернативной стратегией защиты от гриппозной инфекции. Считается, что эпителиальные клетки в носу как главный ответ на вирус гриппа в первую очередь отвечают за активацию и усиление воспаления и повреждения [44, 70, 176].

Было продемонстрировано, что Толл-рецепторы (TLR) участвуют в распознавании патогенов, включая вирусы. Вирусный геном обладает уникальными характеристиками, в том числе двуцепочечной РНК и высоким содержанием CpG, чего нет в геноме млекопитающих [52]. У человека к настоящему времени описано 11 функциональных рецепторов TLR. Так, TLR7 может распознавать вирусную или бактериальную одноцепочечную РНК (ssRNA) и находиться в мембранах эндосомального компартмента [197]. В исследованиях 2013–2016 гг. продемонстрировано, что рецептор TLR7 чрезмерно экспрессируется в макрофагах, инфицированных вирусом. После стимуляции рецептором TLR7 макрофаги распознают вирусные геномы ssRNA (включая, вирус гриппа) и активируют свои нисходящие сигнальные пути с помощью MyD88-зависимого пути, приводящего к активации рецепторов TRAF6, IRAK1, регуляторного фактора интерферона (IRF7), усилении продукции цитокинов с последующей инициацией реакций адаптивной иммунной системы [39, 63, 138, 179].

Эпителиальные клетки дыхательных путей человека — основная мишень, а также основное место контакта вирусов гриппа с человеком, поэтому эти клетки реагируют на инфекцию вирусами через экспрессию нескольких воспалительных генов и иммунных реакций, которые защищают клетки от вирусной инфекции [47]. К настоящему времени в ряде исследований in vivo и in vitro показано, что микроРНК играют различную роль в регуляции реакций врожденной иммунной системы на вирусную инфекцию гриппа, поэтому последующие работы все еще должны быть сосредоточены на первичном месте контакта вирусных инфекций с клетками эпителия носа [186]. МикроРНК-146a-5p, осуществляя регуляцию экспрессии генов в моноцитах и макрофагах, сейчас известна как значимый детерминант врожденных и адаптивных иммунных реакций человека [186]. И хотя микроРНК-146a участвует во множестве клеточных процессов и играет ключевую роль в регуляции генов-мишеней [167], точно до сих пор остается неизвестной ее роль в эпителиоцитах (hNEC) эпителиального барьера носа человека, инфицированного вирусом гриппа. Впервые в 2017 г. V. Deng и соавт. [33] оценили уровень экспрессии микроРНК-146a в клетках инфицированных вирусом гриппа H3N2. Они сообщили, что эта микроРНК сверхэкспрессируется в H3N2-инфицированных эпителиоцитах. Кроме того, они установили, что после сверхэкспрессии микроРНК-146a-5p путем трансфекции имитаторов микроРНК-146a-5p уровень экспрессии рецептора TRAF6 значительно снижается у вирус-инфицированных клеток. Таким образом, результаты этого исследования доказывают, что вирус-индуцированная микроРНК-146a ингибирует транскрипцию мРНК, рецептор TRAF6 при регуляции пути TLR7, а также предотвращает выработку противовирусных интерферонов [33].

Данные недавних работ доказывают, что некоторые микроРНК, такие как miR-33a, miR-302c и miR-let-7c, участвуют в репликации вирусов гриппа [52, 70, 109]. Было также установлено, что микроРНК-146a индуцируется широким спектром вирусных инфекций, и поэтому вполне возможно, что микроРНК-146a способствует репликации вируса гриппа. Однако исследований, указывающих на вовлечение микроРНК-146a в процесс инфекции вирусом гриппа A недостаточно, кроме того лежащие в основе заражения молекулярные механизмы инфекционного цикла гриппа А остаются пока неизвестными. Исследователи F. Zhang и соавт. [189] с помощью микрочипового анализа установили, что микроРНК-146a — одна из наиболее значительно индуцированных микроРНК в клетках линии A549, инфицированных вирусом гриппа A. В данном эксперименте они исследовали функцию микроРНК-146a в вирус-инфицированных клетках A549, трансфицированных либо ингибиторами микроРНК-146a, либо имитаторами микроРНК. Они выявили, что снижение или повышение экспрессии микроРНК-146a приводит к снижению или увеличению репликации вирусов H1N1/H3N2 соответственно. Кроме того, блокировка микроРНК-146a приводила к снижению экспрессии вирусных белков M1 и NP. Таким образом, данные этой работы доказывают индуцированную микроРНК-146a репликацию вируса A в клетках A549.

Выше уже упоминалось, интерферон-I играет важную противовирусную роль, и многие из его противовирусных действий включают как прямое ингибирование репликации вируса, так и активацию иммунной системы человека против вторгшегося вируса [154]. При этом микроРНК могут регулировать интерферон-I-опосредованный противовирусный ответ [24, 149]. Однако точный процесс, в котором микроРНК-146a участвует в противовирусной активности, опосредованной интерфероном-I в клетках, инфицированных вирусом А, до сих пор остается неясным. Недавно в эксперименте на мышах как in vitro, так и in vivo Z. Zhang и соавт. [194] установили, что повышенная регуляция микроРНК-146a способствует репликации вируса гриппа A, опосредуемой TRAF6, что приводит к ингибированию реакций интерферона-I.

МикроРНК-146а и вирусы папилломы

Вирус папилломы человека (ВПЧ) относится к семейству Papillomaviridae, присутствующих и у человека, и у животных [35, 84]. К настоящему времени идентифицировано более 200 типов папилломавирусов, причем по уровню инфекции эти вирусы обычно классифицируются как папилломавирусы высокого или низкого риска. В настоящее время установлено 20 типов вирусов высокого риска (например, папилломавирус 16, 18, 26, 31, 33, 39, 45 и т. д.), которые ответственны за цервикальную интраэпителиальную неоплазию и другие орофарингеальные и аногенитальные раковые опухоли [54]. ВПЧ 16 и 18 являются двумя наиболее распространенными штаммами ВПЧ, которые, как установлено, ответственны примерно за 62,6 и 15,7 % злокачественных новообразований шейки матки соответственно [173]. Установлено, что вирус папилломы содержит двуцепочечную кольцевую ДНК, которая кодирует 6 ранних белков (E1, E2, E4, E5, E6, E7) и 2 поздних белка (L1, L2). Онкопротеины ВПЧ Е 6 и Е 7 непосредственно участвуют в прогрессировании ВПЧ-индуцированного канцерогенеза [29, 173].

Понимание жизнедеятельности опухолевой клетки и ее основных механизмов может быть полезным для разработки эффективных терапевтических стратегий. Руководствуясь этими соображениями, в ряде экспериментов было продемонстрировано, что микроРНК связаны с дифференцировкой, жизнеспособностью, миграцией, адгезией и апоптозом раковых клеток [81, 123]. В работе B. Yan и соавт. [184] при анализе спектра микроРНК и при сравнении сопоставимых по возрасту клеток здоровых тканей и клеток рака шейки матки было показано, что микроРНК-146a сверхэкспрессируется в клетках рака шейки матки, а ее повышенная регуляция индуцирует жизнеспособность клеток, в то время как в исследовании А. Sathyanarayanan и соавт. [152] было продемонстрировано, что микроРНК-146a ингибирует инвазию, жизнеспособность и миграцию клеток рака шейки матки. В 2016 г. было установлено, что в этом процессе фактор NF-kB представляется как важный сигнальный фактор, участвующий в прогрессировании и развитии рака человека, при этом показано, что этот фактор является ключевой мишенью для терапии рака человека [130]. Показано также, что NF-kB играет критическую роль вo врожденных и адаптивных иммунных реакциях человека и действует как ингибитор развития опухоли на начальных стадиях ВПЧ-инфекции и подавляется во время начальной стадии рака шейки матки [98]. Поскольку факторы TRAF6 и IRAK1 являются ключевыми регуляторами активации классического пути контроля транскрипционного фактора NF-kB, то пониженная регуляция факторов TRAF6 и IRAK1 подавляет ФНО-α-индуцированную активацию NF-kB [86, 179]. Другие исследователи [16] показали, что микроРНК-146a может действовать как негативный регулятор NF-kB путем снижения метастатического потенциала в опухолевых клетках рака молочной железы. В эксперименте на кардиомиоцитах продемонстрировано, что микроРНК-146a может полностью блокировать активность NF-kB через факторы TRAF6 и IRAK1. Позже исследователи Q. Hu и соавт. [71] установили, что повышенная регуляция микроРНК-146a способствует прогрессированию рака шейки матки через таргетирование факторов TRAF6 и IRAK1. С другой стороны, пониженная регуляция TRAF6 и IRAK1 предотвращала активность NF-kB, что подавляло рост клеток, а это, по мнению этих авторов, может способствовать персистенции ВПЧ [71].

В ряде исследований установлено, что уровень экспрессии микроРНК-146а-5р снижается у нескольких видов рака человека, а ее целевые гены NOTCH1, ROCK1, CXCR4 принимают участие в миграции, образовании метастазов и их распространении [90]. Имеется несколько контрастных исследований по экспрессии микроРНК146а-5р в связанных с ВПЧ видах рака в ВПЧ-инфицированных кератиноцитах. X. Wang и соавт. [173] показали, что после временной трансфекции этой микроРНК, с целью подавления ее сверхэкспрессии этот процесс сопровождается усиленной пролиферацией в клетках рака шейки матки. Е. Peta и соавт. [135] в своей работе показали, что уровень экспрессии микроРНК-146a снижается в клетках плоскоклеточной карциномы полового члена, инфицированных ВПЧ, а также в кератиноцитах человека, трансдуцированных онкогеном Е6 ВПЧ-16. Исследователи обнаружили значимую отрицательную корреляцию между экспрессией EGFR и уровнем микроРНК-146a-5p в клетках плоскоклеточной карциномы полового члена и показали, что повышенная регуляция микроРНК-146a приводит к подавлению пролиферации клеток HeLa и HFKs. B другом исследовании экспрессии микроРНК-146a-5p при ВПЧ-связанном раке эти авторы наблюдали, что белки E6 ВПЧ-16 подавляют экспрессию микроРНК146a-5p в первичных кератиноцитах полости рта [136]. Они также установили, что повышенная регуляция микроРНК-146a-5p в линейных клетках карциномы шейки матки и в клетках HFKs приводит к ингибированию миграции и пролиферации опухолевых клеток. Был сделан вывод, что белки E6 и E7 HPV-16, вероятно, ингибируют микроРНК-146a-5p при помощи c-MYC, так как c-MYC обладает способностью связываться с промотором микроРНК-146a [135]. Мы упомянули, что онкобелки Е6 и Е7 могут подавлять микроРНК-146а-5р, однако, другие вирусные онкобелки, такие как vFLIP К13 при саркоме Капoши или LMP1 онкобелок HTLV-1, индуцируют микроРНК-146а-5р и экспрессию фактора NF-κB [137, 142]. Однако принудительная экспрессия этой микроРНК в ВПЧ-положительных клетках рака шейки матки и в кератиноцитах человека ингибирует миграцию и пролиферацию опухолевых клеток [136].

Известно, что гистондеметилаза KDM2B — значимый регулятор клеточного роста, который может заблокировать пролиферацию первичных клеток и остановить их старение [161]. Kроме того, этот фермент индуцирует развитие опухоли и участвует в развитии лейкемии, рака молочной железы и рака поджелудочной железы [185]. Полный блок KDM2B уменьшает миграцию и пролиферацию клеток рака шейки матки. Отметим, что Е. Peta и соавт. [135] продемонстрировали, что микроРНК-146a-5p ингибирует KDM2B. Отсюда следует, что именно эта микроРНК непосредственно нацелена на транскрипты KDM2B и KDM2B, уровень которых повышался в клетках рака шейки матки и в кератиноцитах при трансдукции онкобелка E6. Кроме того, онкобелок E6 и, менее эффективно, онкобелок E7 увеличивали экспрессию KDM2B через регуляторный путь, включающий повышенную регуляцию c-MYC, что, в свою очередь, снижало экспрессию микроРНК-146a-5p [135].

Папилломавирусы и некоторые другие вирусы могут действовать как онковирусы через дисрегуляцию различных микроРНК, включая микроРНК-146a. В комбинированных иммунологических исследованиях было отмечено, что в клетках метастатического рака молочной железы повышенный уровень микроРНК-146a/b был ассоциирован со значительным снижением экспрессии TRAF6 и IRAK1, и следовательно, такой процесс негативно регулирует активность NF-kB [16]. Снижение экспрессии TRAF6 и IRAK1 приводит к значительному ухудшению способности к миграции и инвазии, связанной со здоровыми клетками. Показано также, что микроРНК-146a входит в число других микроРНК, обнаруженных сверхэкспрессированными в клетках рака шейки матки по сравнению со здоровыми клетками нормальной ткани шейки матки. Было показано, что при трансдукции микроРНК-146a в линейные клетки рака шейки матки она индуцирует пролиферацию раковых клеток [184]. В экспериментальной работе Q. Hu и соавт. [71] было показано, что при трансдукции синтезированной микроРНК-146a в клетки клеточной линии рака шейки матки происходит снижение уровней TRAF6 и IRAK1 и одновременно повышается экспрессия циклина D1. И хотя частота апоптоза не изменялась, значительное количество клеток переходило в S-фазу, что указывает на повышенную скорость пролиферации. Эти результаты являются весьма существенными, поскольку в других исследованиях сообщалось, что снижение экспрессии TRAF6 и IRAK1 оказывает противоопухолевое действие [75]. МикроРНК-146a хорошо изучена при злокачественных новообразованиях предстательной железы, причем исследования показали, что эта микроРНК действует как ингибитор развития опухоли. В экспериментах S-L. Lin и соавт. [102] показано, что экспрессия микроРНК-146a снижается в клетках гормонально-рефрактерных карцином предстательной железы. Причем принудительная экспрессия микроРНК-146a снижала скорость пролиферации и инвазии в клетках рака предстательной железы. Примечательным фактом, установленным в этом исследовании, является то, что микроРНК-146a может быть нацелена на киназу ROCK1, которая играет важную роль в опухолевом генезе клеток рака предстательной железы [183]. Kроме того, используя в качестве мишени Rac1, микроРНК-146a опосредует подавление миграции и инвазии в клетках рака предстательной железы [160]. Анализ клинических данных показывает, что у пациентов, имевших тенденцию к повышению частоты рецидивов после простатэктомии, уровень экспрессии микроРНК-146a был снижен. Экспериментальные исследования показали, что микроРНК-146a способна in vitro стимулировать апоптоз в клетках [182]. Установлено также, что ген EGFR в клетках рака предстательной железы регулируется через микроРНК-146a [181]. Таким образом, эти результаты показывают, что микроРНК-146a воздействует на клетки эпителия предстательной железы человека разными регуляторными путями [75].

МикроРНК-146а и вирусы герпеса

Вирусы герпеса (Herpesviridae) — это большое семейство ДНК-содержащих вирусов [62]. Эти вирусы способны сохранять пожизненную персистенцию в инфицированных клетках человека благодаря обмену между латентной (непродуктивной) и литической (продуктивной) инфекцией. Восемь вирусов герпеса человека делятся на три подсемейства:

Герпесвирусная инфекция человека связана с несколькими важными заболеваниями, охватывающими от поражений слизистых оболочек/кожи до некоторых злокачественных новообразований. Герпесвирусы имеют две основные формы репликации в своем жизненном цикле: латентную и литическую репликацию. Во время латентности экспрессируется только ограниченное подмножество вирусных генов для поддержания вирусного генома в эписомальном состоянии и предотвращения гибели клеток-хозяев. Таким образом, латентная фаза позволяет герпесвирусам эффективно ускользать от механизма иммунного надзора хозяина и устанавливать персистирующую вирусную инфекцию [50]. Кроме того, при определенных условиях, включая иммуносупрессию, вирус может переключаться с латентной инфекции на литическую инфекцию и приводить к активации экспрессии вирусных генов и продукции инфекционных вирионов [50, 129].

Неудивительно, что вирусы приводят к модуляции (отрицательной или положительной) сигнального пути NF-kB, способствующей вирусной инфекции и/или избеганию антивирусных реакций. Было замечено, что несколько вирусных семейств вмешиваются в каждый этап сигнального пути NF-kB. Например, полимераза HBV и белок 3C вируса гепатита А предотвращают активность тримерного комплекса NF-кВ-зависимой киназы — основного компонента активации NF-kB. Вирусы ВПГ-1, ВЭБ, вирус осповакцины и поксовирус тормозят косвенно или напрямую ядерную транслокацию компонента Р65 NF-кВ, что является важным шагом для поддержания противовирусного ответа, опосредованного фактором NF-κB [196]. Таким образом, для вирусного захвата клеток человека в процессе совместной эволюции вирусом было разработано множество стратегий, чтобы ингибировать активность NF-кВ и способствовать выживаемости вирус-инфицированной клетки. Напротив, некоторые семейства вирусов приводят к стойкому усилению активации NF-kB, тесно связанной с онкогенной трансформацией. Онкогенные вирусные факторы активируют сигнальный путь NF-kB для улучшения приспособленности вирусной инфекции. В частности, было продемонстрировано, что связывание между гликопротеином EBV gp350/220 и рецептором комплемента 2 / рецептором CD21 запускает активацию NF-kB, что приводит к последующей сверхэкспрессии рецептора CD21. Эта обратная связь положительно повышает восприимчивость клеток к проникновению ВЭБ [158]. Аналогичные эффекты, опосредованные белком vFLIP KSHV и белком Tax HTLV-1, косвенно или непосредственно активируют комплекс NF-кВ-зависимой киназы и, следовательно, путь NF-kB по усилению онкогенной трансформации [193]. A. Venuti и соавт. [170] установили, что сверхэкспрессия микроРНК-146a при репликации ВПГ-1 строго зависит от активации NF-kB и связана с жестким контролем фактора IRAK1. Они исследовали способность HSV-1 рекрутировать NF-kB. Используя белок EGFP, который известен так же как HSV-1/EGFP, авторы установили, что в клетках THP-1 он повышает экспрессию микроРНК-146a NF-kB-зависимым образом. Таким образом, их исследование дало новое понимание потенциальной терапии ВПГ-1, показав, что микроРНК-146a, нацеленная на IRAK1, действует как негативный регулятор регуляторного пути NF-kB [170]. Следует отметить, что неадекватная воспалительная активность вредна для организма и может вызвать иммунные нарушения или иммунопатологические состояния [129]. B последнее время в эксперименте на мышиной модели in vitro было показано, что ингибирование микроРНК-146a способствует продукции интерферона-β путем восстановления экспрессии TRAF6 и IRAK1 и приводит к снижению вирусной нагрузки [66]. Таким образом, эти сообщения подчеркивают взаимодействующий регуляторный механизм между микроРНК-146a и состоянием NF-kB во время инфекции HSV-1, подчеркивая вероятность контроля активности NF-kB в качестве новой терапевтической стратегии при вирусиндуцированных воспалительных заболеваниях [140]. Кроме того, J.M. Hill и соавт. [64] опубликовали данные, что в клетках головного мозга человека, инфицированных ВПГ-1, индуцируется сверхэкспрессия микроРНК-146a, которая, как показано ранее, связана с провоспалительной сигнализацией в стрессорных клетках головного мозга человека и при болезни Альцгеймера. Они также наблюдали опосредованное микроРНК-146a снижение регуляции фактора комплемента H (ФКH), можно предположить, что это успешная стратегия, используемая вирусом для подрыва клеточных механизмов человека для развития инфекции [64].

Показано, что инфекция, связанная с саркомой Капоши может сопровождаться различными проангиогенными мигрирующими провоспалительными хемокинами и цитокинами для индуцирования вирусного патогенеза, а также выживания инфицированных вирусом клеток. Кроме того, чтобы обеспечить персистирующую инфекцию, вирус разработал сложную стратегию, с помощью которой вирусные белки приспосабливают адаптивный и врожденный иммунитет человека [143]. Например, в клетках, инфицированных KSHV, или в клетках, трансдуцированных белком vFLIP KSHV, экспрессия хемокиного рецептора CXCR4 была подавлена. Ингибирование белком vFLIP рецептора CXCR4 KSHV связано с чрезмерной экспрессией клеточной микроРНК-146a, кроме того известно, что эта микроРНК связывается с 3'-нетранслируемой областью (3'-НТО) мРНК [147]. Дальнейшие данные подтвердили, что сверхэкспрессия микроРНК-146a требует активации фактора NF-kB при помощи vFLIP, так как эта способность теряется в клетках дефектных по этому белку. Для клинических исследований важно сообщение о снижении уровня экспрессии CXCR4, связанного с повышением регуляции микроРНК-146a в тканях, полученных при прионной болезни. Показано, что снижение экспрессии CXCR4 способствует прогрессированию прионной болезни, за счет индукции преждевременного выброса инфицированных эндотелиальных клеток-предшественников в кровоток [66].

Белок IMP1 ВЭБ является функциональным гомологом семейства ФНО-рецепторов и, активируя NF-kB, вносит свой вклад в онкогенный потенциал BЭБ [11, 77, 120]. Исследователи J.E. Cameron и соавт. [23] посредством анализа микроРНК на микрочипах показали, что белок LMP1 дисрегулирует экспрессию различных клеточных микроРНК, в том числе микроРНК-146a. Исследование уровня ее экспрессии в клеточной линии типов I и III BL показало, что экспрессия этой микроРНК была значительно изменена в клетках латентного типа III (экспрессирующих белок LMP1) [122], однако она была изменена незначительно в клеточных линиях латентного типа I. В основном LMP1 индуцирует экспрессию микроРНК-146a двумя сайтами связывания NF-kB в промоторе этой микроРНК. Кроме того, массивный анализ уровней мРНК в клетках Аката, трансфицированных ретровирусными векторами, которые экспрессируют микроРНК-146a, распознает гены, косвенно или непосредственно регулируемые через микроРНК-146a, такие как группа интерферон-чувствительных генов, подавляемых этой микроРНК. Поскольку микроРНК-146a продвигается агентом, который активирует путь ответа интерферонов (например, LMP1), то она работает в петле отрицательной обратной связи путем подавления генов, реагирующих на интерфероны, чтобы регулировать продолжительность и/или интенсивность ответа интерферонов [23]. Это может быть средством «тонкой настройки» уровней сигнализации интерферона и/или может быть средством обеспечения процесса отключения после стимуляции при нормальной физиологической коммуникации между клетками. Примечательно, что повышенный уровень микроРНК-146a был выявлен в клетках некоторых видов опухолей [96, 97, 163]. Вероятно, дисрегулированная микроРНК-146a может вызывать ингибирование пути интерферонового ответа в опухолевых клетках, что приводит к подавлению интерферон-зависимого иммунного надзора за опухолью. При ВЭБ-инфекции сверхэкспрессия этой микроРНК может привести к модуляции или подавлению опосредованного интерфероном противовирусного ответа, что защищает вирус. Было также замечено, что сам интерфероновый путь индуцирует клеточные микроРНК, которые ингибируют репликацию вируса, показывая, что индукция клеточных микроРНК во время вирусной инфекции может быть либо вредной, либо весьма полезной для вируса [23, 132]. Один из важных регуляторных генов для интерферон-зависимых иммунных реакций — это регуляторный фактор интерферона IRF7, который может ингибироваться микроРНК-146a. Было продемонстрировано, что IRF7 обладает способностью связывать и активировать промотор LMP1 мРНК. Таким образом, возможно, что экспрессия LMP1 является отрицательной обратной связью, регулируемой прямым действием этой микроРНК на сигнализацию интерферона-I, и, вероятно, устанавливает механизм, который корректирует регуляцию экспрессии LMP1, чтобы избежать некоторых вредных эффектов внутриклеточного повышенного уровня LMP1 [23].

МикроРНК-146a и энтеровирусы

Энтеровирус EV71 — одноцепочечный неинвазивный РНК-вирус, относится к виду семейства Enterovirus рода Picornaviridae. EV71 — один из основных этиологических агентов, вовлеченных в болезни рук, ног и рта, весьма распространенную инфекцию у детей. Инфекция EV71 часто связана с асептическим менингитом, поражением центральной нервной системы с сильной дегенерацией нейронов, отеком легких, воспалением и некрозом или кровоизлиянием [185]. Точный патогенетический механизм инфекции EV71 остается неизвестным, однако считается, что его механизм у человека, особенно реакции иммунной системы, вероятно, являются более значимыми, чем сам вирус, детерминантами тяжести заболевания [92]. Чрезмерные провоспалительные хемокиновые и цитокиновые реакции способствуют тяжести заболевания при инфекции EV71. Кроме того, эта инфекция вызывает частичную блокировку выработки интерферона-I [131]. Исследователи B.-C. Ho и соавт. [66] в 2016 г. показали, что экспрессия микроРНК-146a, стимулируемая внедрением вируса EV71, приводит к подавлению продукции интерферона посредством ингибирования TRAF6 и IRAK1, двух ключевых факторов, вовлеченных в сигнальные пути Толл-рецепторов и продукции интерферонов. РНК вируса EV71 была недавно обнаружена в экзосомах, высвобожденных из клеток нейробластомы при инфицировании EV71. Однако молекулярные механизмы, контролирующие содержание и состав экзосом при инфекции EV71, изучены еще недостаточно [111].

МикроРНК и коронавирус SARS-CоV-2

Стремительное распространение SARS-CoV-2 привлекло широкий круг ученых к изучению особенностей этого нового коронавируса [191]. Было выяснено, что так же, как и при других патологиях, в вирусной инфекции принимают участие многочисленные микроРНК [8, 56]. Более того, в нескольких работах была выдвинута гипотеза, что микроРНК, активируемые коронавирусом SARS-CoV-2, могут регулировать противовирусные иммунные реакции человека, включая вирусное зондирование, секрецию цитокинов и опосредованное Т-клетками уничтожение клеток [22, 99]. Например, нуклеокапсидный белок OC43 коронавируса, присоединяясь к микроРНК-9, включает ядерный фактор NF-kB В-клеток, который является прототипом провоспалительного сигнального пути, связанного с несколькими хроническими и вирусными заболеваниями, если экспрессия фактора NF-kB нарушается инвазией вируса SARS-CoV-2 [91]. B своих исследованиях Md.A.-A.-K. Khan и соавт. [83] установили, что из 106 микроРНК host-аnti-SARS-CoV-2 только 3 (host-miR-17-5р, host-miR-20б-5р, hsa-miR-323a-5р) обладают постоянным противовирусным действием против SARS-CоV-2 в течение развития инфекции. Уровни мРНК и белка Ace2 ингибировались miR-200c в первичных кардиомиоцитах крыс и в кардиомиоцитах человека, полученных из iPSC, таким образом, микроРНК могли снижать инфекцию SARS-CoV-2 (поскольку AПФ2 служит входными воротами для SARS-CoV-2) [106].

Установлено, что микроРНК человека также могут играть хорошо зарекомендовавшую себя роль в предотвращении вирусной инвазии в клеточную систему человека путем блокирования путей-мишеней, необходимых для проникновения вируса, а также других важных путей репликации вируса и трансляции вирусных белков (рис. 2). Например, блокируя некоторые молекулы, регулирующие сигнальный путь p38 MAPK [65], сигнальный путь FAK [37], сигнальный путь p13K-Akt [35]. Это может контролироваться вирусом для эффективной обработки и репликации pre-микроРНК. Кроме того, эти микроРНК человека могут изменять некоторые воспалительные реакции хозяина, чтобы ингибировать сопутствующее повреждение восприимчивых органов, таких как легкие, таким образом, защищая легкие от возможного повреждения, нацеливаясь на сигнализацию IGF1, сигнализацию VEGF, сигнализацию PAR1, сигнализацию интегрина и сигнализацию TGF-β [83]. Интересно, что есть доказательства, что помимо защитной роли микроРНК некоторые микроРНК человека играют активную роль в вирусной инфекции путем подавления некоторых путей, предназначенных для обеспечения эффективного иммунного ответа, таким образом поддерживая выживание вируса в инфицированных клетках путем предотвращения ранних иммунных реакций, таких как вирусный апоптоз и аутофагия, следовательно, могут ингибировать пути иммунного надзора в организме человека и функционировать как провирусный фактор.

 

Рис. 2. Многообразие функций микроРНК при инфекции SARS-CoV-2 (по: [57] с изменениями)

 

Недавно было обнаружено, что некоторые вирусные микроРНК также могут регулировать экспрессию генов человека, имитируя клеточные микроРНК или вступая в новые модуляторные отношения, таким образом, используя преимущества предопределенных регуляторных путей организма человека и, следовательно, влияя на репликацию и патогенез вируса [196]. Несмотря на то что основное действие, инициируемое микроРНК человека, заключается в ингибировании вирусной РНК, тем не менее роль микроРНК можно описать как обоюдоострый меч, который облегчает инвазию вируса и функции иммунной системы человека, вмешиваясь в отдельные критические иммунные пути [19, 20]. Этот поразительный факт иллюстрируется тем, что микроРНК человека могут способствовать распространению вирусной репликации в присутствии факторов иммунной системы. Кроме того, вирусные факторы могут подавлять экспрессию микроРНК человека, которые обычно функционируют как репрессоры вирусной репликации. В соответствии с этими соображениями Md. A.-A.-K. Khan и соавт. [83] выделили несколько важных путей в иммунной системе человека. Это прежде всего регуляционные пути γ-интерферона, TGF-β, интерлейкинов, IGF1, путь TRAIL, которые связаны с несколькими важными провоспалительными путями, сигнализирующими о высвобождении цитокинов во время вирусной инфекции. Важно отметить, что авторы при этом задокументировали, что микроРНК человека также активируются при заражении вирусом SARS-CoV-2 и могут специфически подавлять различные сигнальные пути Toлл-подобных рецепторов, которые рассматриваются как важные инициирующие молекулы для продуцирования факторов противовирусной защитной системы человека, в частности индукцию воспалительных цитокинов и ряда интерферонов. В дополнение к этому, специализированные микроРНК могут также блокировать отдельные рецепторы, которые участвуют в регуляторных противовирусных реакциях, таких как сигнальный путь uPA-UPAR, cигнальный путь TRAF6, сигнальный путь S1P1, сигнальный путь морфогенетических факторов ВМР, приводя к понижению защитных функций противовирусного механизма [83].

Обобщая результаты своей работы Md.A.-A.-K. Khаn и соавт. [83] выдвинули гипотезу, что геномные различия между вирусами SARS-CoV-2, выделенными от пациентов COVID-19 в разных странах мира, могли способствовать различиям в связывании с микроРНК отдельных людей, следовательно, и различиям в патогенности вируса, а также в симптомах и признаках заболевания в инкубационном периоде. С другой стороны, вирусные микроРНК могут различаться по своему влиянию на регуляцию экспрессии генов человека, что может быть как выгодно, так и невыгодно и вирусу, и человеку [83]. Учитывая высокую частоту мутаций генома вируса в образцах SARS-CoV-2, взятых от пациентов в различных странах мира, в настоящее время принято считать, что именно этот факт мог сыграть решающую роль в определении тяжести заболевания и смертности среди пациентов, инфицированных SARS-CoV-2 [104, 113].

Экзосомальные микроРНК и вирусные инфекции

Экзосомы, как сейчас хорошо изучено, представляют собой наноразмерные (30–150 нм) внеклеточные везикулы, секретируемые во внеклеточную среду и существующие почти во всех жидкостях организма, включая кровь, сыворотку, грудное молоко, мочу, амниотическую жидкость, слюну, асцит и носовую секрецию [190]. Экзосомы высвобождаются, когда многовезикулярные тела, полученные из поздних эндосом, сливаются с плазматической мембраной. Они также обладают способностью переносить свои соединения в клетки-реципиенты и могут модулировать функцию клеток-реципиентов, транспортируя нуклеиновые кислоты, микроРНК, белки и липиды [37, 190]. Эти везикулы секретируются из различных клеток, включая раковые, инфицированные вирусом клетки и нормальные клетки, чтобы регулировать местную среду. Кроме того, экзосомы могут транспортироваться с кровотоком в отдаленные участки организма и таким образом способствовать распространению инфекции или болезни. Одна из важных функций экзосом — межклеточное взаимодействие между вирусом и иммунными клетками [116].

MикроРНК, избирательно упакованные и переносимые между клетками экзосомами, известны как экзосомальные микроРНК [187, 190]. Уровень экзосомальных микроРНК значительно снижается в экзосомах, выделенных из клеток, инфицированных вирусом. Cледовательно, по этому признаку они являются новыми биомаркерами для диагностики и контроля лечения при вирусной инфекции. В некоторых исследованиях было показано, что и микроРНК-146а также избирательно упаковывается в экзосомы, и что в экзосомах, выделенных из клеток, инфицированных энтеровирусом, присутствует сверхэкспрессированная экзосомальная микроРНК-146a [41].

Однако на сегодняшний день информация о механизме высвобождении экзосом, вызванных вирусной инфекцией, остается ограниченной. Можно предположить, что он подобен тому, как белок Nef ВИЧ-1 повышает продукцию экзосом и секретируется через экзосомы [94]. Позже, S.N. Hurwitz и соавт. [73] продемонстрировали в различных клеточных моделях, что белок LMP1 вируса ВЭБ усиливает секрецию экзосом, связанных с патогенезом этого вируса. Кроме того, Y. Fu и соавт. [41] на клетках THP-1 и HT-29 показали, что инфицирование вирусом EV71 приводит к повышенному высвобождению экзосом, а также к дифференциальной упаковке микроРНК-146a и вирусной геномной РНК в экзосомы. Вследствие этого, экзосомальный геном РНК EV71 может быть перенесен в новую клетку-мишень и реплицироваться в этих клетках, в то время как экзосомальная микроРНК-146a ингибирует интерфероновый ответ в клетках-мишенях, тем самым облегчая репликацию вируса EV71 (рис. 3). Таким образом, результаты, полученные в этом исследовании, доказывают, что хотя свободный вирус EV71 и экзосомальная РНК вируса EV71 эффективно проникали в пермиссивные клетки, проникновение экзосомальных вирусных РНК в непермиссивные клетки было более эффективным, чем проникновение свободного вируса EV71 [185]. В более ранних исследованиях сообщалось, что факторы PSGL-1 и SCARB2 служат рецепторами для входа вируса EV71 в клетку. А так как непермиссивные клетки L929 не экспрессируют PSGL-1 и SCARB2, то можно предположить, что экзосомальная РНК вируса EV71 может преодолеть отсутствие клеточного рецептора для входа вируса и, следовательно, опосредовать репликацию вируса рецептор-независимым образом. Можно также отметить, что экзосомальная микроРНК-146a способствует репликации экзосомальной вирусной РНК EV71, за счет подавления интерферонового ответа [41].

 

Рис. 3. Общие пути в жизненном цикле вируса и биогенезе внеклеточных везикул (BВ). 

 

Экзосомы, как уже упоминалось, получают из различных клеток, в том числе из инфицированных вирусом клеток, чтобы регулировать местную среду. Как уже подчеркивалось выше, эти везикулы кровотоком могут распространяться по организму, перенося, например, вирусную инфекцию. Это еще раз подчеркивает участие экзосом в межклеточных взаимодействиях во время вирусной инфекции либо осуществлении иммунных реакций на нее [9, 51]. Установлено, что экзосомы, полученные из инфицированных вирусом клеток, доставляют вирусный геном, вирусные белки и элементы хозяина в соседние клетки или даже в другие ткани, способствуя модуляции иммунных реакций хозяина и установлению продуктивных вирусных инфекций [9]. Hапример, экзосомы, выделенные из клетки, инфицированной HCV, содержат геном HCV, который может быть передан в дендритные клетки, чтобы вызвать продуктивную инфекцию [105], а экзосомы, полученные из клеток, инфицированных ВИЧ-1, содержат грузы, способствующие апоптозу неинфицированных клеток [94]. HTLV-инфицированные клетки содержат транскрипты мРНК HBZ, Env и Tax, демонстрируя, что экзосомы могут служить носителем для доставки транскриптов мРНК HTLV-1 в клетки-реципиенты [74]. Между тем экзосомы защищают свое содержимое от распознавания иммунной системой, что особенно важно для вирусов, не имеющих оболочки. Эти исследования предполагают, что экзосомы играют решающую роль в репликации вируса; тем не менее как экзосомы регулируют иммунную систему и влияют на вирусную инфекцию изучено недостаточно.

Генетические материалы экзосом, включая РНК, участвуют в опосредованных экзосомами клеточных функциях. Анализ данных секвенирования внутриэкзосомных РНК показал, что микроРНК — наиболее распространенные медиаторы среди различных классов экзосомальных РНК. Имеющиеся данные показывают, что многие типы клеток, включая эндотелиальные, иммунные, раковые и инфицированные вирусом, могут как высвобождать, так и поглощать экзосомальные микроРНК. Важно отметить, что загрузка микроРНК в экзосомы является избирательным механизмом, а не просто представляет собой комбинацию дисрегулированных микроРНК в родительских клетках. Кроме того, перенос экзосомальных микроРНК может позволить вирусам регулировать иммунную защиту клеток-реципиентов и способствовать распространению вируса (рис. 2) [187, 191].

Перспективы терапевтического применения микроРНК

Известно, что существуют два различных типа интерферирующих молекул РНК: малые шпилечные РНК (shРНК) как предшественники siRNAs и небольшие микроРНК [1, 3]. При этом показано, что экспрессия shРНК может быть достигнута in vitro путем доставки внутрь клетки коммерчески доступных реагентов, включающих бактериальные или вирусные векторы или плазмиды [140, 190]. Поскольку микроРНК некодируются, то естественным образом встречаются в вирусах, разных видах животных и растениях. Недавно при помощи математического моделирования были разработаны искусственные микроРНК для подавления или восстановления функций целого ряда генов [59, 100, 113].

Разработка ингибиторов антисмысловых РНК (тРНК) может быть использована в качестве восстановительного метода для ингибирования чрезмерной экспрессии зрелой последовательности микроРНК, которые участвуют в патогенезе ряда заболеваний [6, 59]. С новым прогрессом в медицинских технологиях становится возможным искусственно синтезировать скорректированные аналоги мРНК, а также siРНК, которые могут модулировать экспрессию генов, связанных с заболеванием, и даже блокировать экспрессию генов патогена. Обеспечение экзогенной микроРНК может помочь восстановить нормальную функцию клетки путем сброса экспрессии микроРНК [7, 133]. В настоящее время концентрация зрелых микроРНК может быть понижена путем экспериментальной регуляции экспрессии сайтов, где они связываются с pre-miRNA (рис. 1), или путем введения антисмысловых олигонуклеотидов с использованием фармакологических подходов [8, 20]. Одним из преимуществ использования ингибиторов мРНК считается предсказуемая специфичность связывания ингибитора с его целевой мРНК. Это важное преимущество по сравнению, например, с малыми молекулами, которые обладают непредсказуемой специфичностью к своей мишени. В результате экспериментальной разработки для микроРНК препаратов-мишеней, имеющих структуру нуклеиновых кислот, появился оптимистичный вариант для изменения перспективы разработки лекарственных препаратов с точки зрения медицинской химии [76], то есть сокращения материальных затрат и времени на разработку. Показано, что применение антимикроРНК-155 в случае лимфомы лечение было эффективным и имело более высокую точность нацеливания на больные клетки по сравнению со стандартным лечением [26]. Исследователи обнаружили, что несколько химических модификаций нуклеотидов могут усилить связывание ингибиторов антимикроРНК с их целевыми микроРНК, а их противодействие нуклеазам может уменьшить отрицательный заряд клетки, который, как известно, ингибирует проникновение вирусов [99]. Поэтому ингибиторы на основе нуклеиновых кислот получили название антимикроРНК. Несмотря на то что ингибирование микроРНК может происходить in vivo, однако наиболее сложным аспектом ингибирования микроРНК in vivo является доставка антимикроРНК к целевому гену. Чтобы преодолеть эту проблему, микроРНК конъюгируют с искусственными носителями или упаковывают в различные средства доставки, включая экзосомы [80, 132, 139, 140]. Искусственные носители могут усиливать поглощение клетками ингибиторов in vivo, кроме того, они повышают эффективность и точность доставки для клеток-мишеней и органов [12, 115, 157].

Кольцевые нуклеиновые кислоты, способные нацеливаться на промоторную область микроРНК, представляют собой еще один многообещающий класс антимикроРНК [123]. Ингибиторы LNA могут блокировать целые семейства микроРНК, а не только индивидуально-специфичные микроРНК. Можно отметить, что их биодоступность in vivo оптимальна и не требует специальных носителей, что делает их перспективным классом антимикроРНК [123]. В недавнем исследовании модифицированная ингибитором LNA антимикроРНК-21 подавляла волчанку у животных и псориаз у пациентов, которым были пересажены ксенотрансплантаты кожи [43, 53]. Это были многообещающие результаты, поскольку применение ингибиторов LNA на мышах с дефицитом микроРНК-21 не выявило никаких обнаруживаемых дефектов, что предполагает, что ингибирование микроРНК-21 в клетках человека будет вызывать немного или вообще не будет иметь побочных эффектов. Более того, поглощение антимикроРНК-21 клетками кожи резко повлияло на исход заболевания. Это говорит о том, что топические способы доставки антимикроРНК в качестве лекарств могут легко получить доступ к поверхности тела (то есть кожа, глаза, полость рта, дыхательные пути, прямая кишка, влагалище) и представляют собой идеальную замену способам систематического введения лекарств in vivo [53].

Препараты, усиливающие экспрессию микроРНК

В отличие от упомянутых терапевтических вариантов антимикроРНК, лечебный эффект может быть достигнут фармакологическим воздействием на функции микроРНК, либо для замены утраченной функции микроРНК, либо для снижения регуляции сверхэкспрессированной микроРНК, в зависимости от клиники заболевания. Например, при индукции микроРНК-146a можно ожидать подавления определенных иммунных реакций, поскольку эта РНК будет негативно регулировать различные иммунные клетки и усиливать регуляторную роль Т-клеток [190, 195]. Как альтернатива функций обычной микроРНК-210, данная РНК, активируемая в гипоксических условиях, может отрицательно регулировать дифференцировку Th17. Таким образом, понижающая регуляция Th17-управляемого воспаления может быть достигнута за счет доставки имитаторов микроРНК-210 [173]. Другим привлекательным вариантом коррекции функций микроРНК можно считать индукцию транскрипции эндогенных микроРНК вместо доставки микроРНК-имитаторов. Достичь этого можно было бы с помощью подходов, основанных на использовании искусственного комплекса CRISPR-Cas9 [86, 87]. Кроме того, таргетирование структуры мРНК или процессинга микроРНК — это еще один привлекательный подход, который начали изучать относительно недавно. В целом, наличие обширных вторичных структур микроРНК и многоступенчатый процессинг предлагают отличные возможности для фармакологических вмешательств. Поэтому для усиления функций микроРНК можно использовать несколько стратегий. Например, была проведена модификация олигорибонуклеотида, названного «looptomir» [147], для нейтрализации микроРНК-let-7a в качестве успешного терапевтического подхода (см. таблицу).

 

Таблица. Предполагаемая лекарственная терапия на основе микроРНК [25, 27, 32, 34, 43, 59, 98, 151]

Фирма	Таргентная микроРНК	Заболевание	Механизм действия	Фаза клинических испытаний
Regulus Therapeutics	miRNA-122	Гепатит С	АнтимикроРНК	Доклиническая
	iR-10b	Глиобластома	АнтимикроРНК	Доклиническая
	miRNA-221	Первичный рак печени	АнтимикроРНК	Доклиническая
	miRNA-21	Фиброз почек	АнтимикроРНК	Доклинические
	miRNA-33	Атеросклероз	АнтимикроРНК	Завершенная доклиническая
	miRNA-17	Генетическая болезнь почек	АнтимикроРНК	Доклиническая
	miRNA-27	Холестатическая болезнь	АнтимикроРНК	Исследования прекращены
	miR103/107	Сахарный диабет 2-го типа	АнтимикроРНК	Фаза-I
Santaris Plasma Mirna therapeutics	miRNA-122	Гепатит С	АнтимикроРНК	Фаза-IIa
	miRNA-34	Первичный рак печени	Подражать	Фаза-I
	miRNA-155	Онкологические заболевания	АнтимикроРНК	Завершенная доклиническая
	miRNA-215	Рак	Подражать	Доклиническая
	miRNA-101	Рак	Подражать	Доклиническая
	miRNA-16	Рак	Подражать	В стадии разработки
	miRNA-let-7	Рак	Подражать	В стадии разработки
miRagen therapeutics	miRNA-92	Заболевание периферических артерий	АнтимикроРНК	Доклиническая
	miRNA-15/195	Инфаркт миокарда	АнтимикроРНК	Доклиническая
	miRNA-155	Т-клеточные лимфомы кожи	Ингибирование	Фаза-I
	miRNA-208	Хроническая сердечная недостаточность	Ингибирование	В стадии разработки
	miRNA-143/145	Сосудистые заболевания	Ингибирование	В стадии разработки
	miRNA-29	Фиброз сердца	Ингибирование	В стадии разработки
	miRNA-451	Аномальная выработка эритроцитов	АнтимикроРНК	В стадии исследования
	miRNA-92	Заболевания периферических артерий	Ингибирование	В стадии разработки

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Этот обзор иллюстрирует новые исследования по изучению микроРНК, связанных с вирусными инфекциями. Исследователи постоянно пытаются найти новые терапевтические подходы для лечения пациентов с вирусными заболеваниями, а вероятные терапевтические стратегии на основе микроРНК произвели революцию в области биологии микроРНК. Из имеющихся данных известно, что микроРНК-146a играет существенную роль в некоторых вирусных инфекциях, в то время как при других роль микроРНК-146a сложна, особенно при онковирусных инфекциях. Приведенные выше результаты показывают, что индуцированное микроРНК снижение экспрессии некоторых генов-мишеней, включая STAT1, IRAK1 и TRAF6, защищает вирус от противовирусного ответа клеток хозяина. Кроме того, отдельные эксперименты показали, что микроРНК-146a может быть распознана в жидких средах организма человека, а поскольку уровень экспрессии этой микроРНК значительно изменяется у инфицированных вирусом пациентов по сравнению со здоровыми людьми, то априори предполагается, что эта микроРНК-146a может быть перспективным диагностическим биомаркером уже в ближайшем будущем. В целом, данные этих исследований предполагают, что микроРНК-146a является важным фактором в развитии вирусной инфекции и, таким образом, становится важной мишенью для улучшения терапевтических схем лечения при вирусных инфекциях.

About the authors

Petr D. Shabanov

Kirov Military-Medical Academy

Author for correspondence.
Email: pdshabanov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1464-1127
SPIN-code: 8974-7477

Dr. Med. Sci. (Pharmacology), Professor

Russian Federation, 6 Acad. Lebedes str., Saint Petersburg, 194044

Vladimir I. Vashchenko

Kirov Military-Medical Academy

Email: vaschenko@yandex.ru

Dr. Biol. Sci.

Russian Federation, 6 Acad. Lebedes str., Saint Petersburg, 194044

References