Коррекция гипоксических состояний метаболическими предшественниками эндогенного активатора митохондриальных АТФ-зависимых К+-каналов

Полный текст

Введение

Кислородная недостаточность, возникающая при ограничении или прекращении снабжения организма кислородом, а также при нарушении его утилизации, приводит к возникновению гипоксии. Она сопровождается угнетением тканевого обмена, в первую очередь снижением энергетического обеспечения клеток, что служит причиной развития той или иной патологии или гибели организма [3, 4]. Основной мишенью для гипоксии являются митохондрии. Изменение их структуры и функции в условиях дефицита кислорода играет ведущую роль в развитии функциональных и метаболических перестроек в клетке, так как в основе механизма любой формы гипоксии лежит нарушение работы митохондриальных ферментных комплексов [7]. Кроме того, согласно современным представлениям, митохондрии могут участвовать в регуляции кислородного гомеостаза не только клетки, но и организма в целом [8]. Поэтому при гипоксии начинают работать эндогенные механизмы защиты, действие которых направлено прежде всего на сохранение структурной организации митохондрий и поддержание их функции обеспечения клетки макроэргическими соединениями. Большое значение в этих процессах имеет активация митоКАТФ-каналов. Триггером активации является уменьшение внутриклеточной концентрации АТФ в условиях недостатка кислорода, в частности, при ишемии. Предполагается, что антиишемическое действие активации митоКАТФ-каналов может быть связано с ограничением накопления внутримитохондриального кальция [13, 19], c созданием оптимального для синтеза АТФ электрохимического градиента [23], c сохранением активности дыхательной цепи в результате поддержания архитектуры внутренней мембраны за счет набухания митохондрий [15], с изменением уровня активных форм кислорода [21], которые запускают ряд реакций, приводящих к антигипоксической защите [16, 22]. Участие митоКАТФ-каналов в ограничении ишемических повреждений дает основание предполагать, что они играют важную роль в формировании устойчивости организма к кислородному голоданию [24]. В связи с этим поиск возможности фармакологической регуляции активности мито-КАТФ-каналов представляет собой новый подход к предупреждению и ограничению последствий кислородной недостаточности.

В настоящее время существует целый ряд синтетических активаторов каналов. Однако наиболее перспективными и безопасными в плане терапевтического применения могут быть природные активаторы канала. Было показано, что одним из них является уридиндифосфат, который способен активировать канал в физиологических условиях, когда концентрация АТФ в клетке достаточна для того, чтобы мито-КАТФ-каналы находились в неактивном состоянии [18, 20]. Известно, что уридиндифосфат не проникает через клеточную мембрану, но может синтезироваться в клетке из уридина и уридин-5′-монофосфата (УМФ) [17]. В условиях локальной циркуляторной гипоксии скорость элиминации экзогенного уридина, введенного в кровеносное русло, увеличивается по сравнению с интактными животными [5]. Приведенные данные дают основание предполагать, что экзогенные метаболические предшественники внутриклеточного синтеза уридиндифосфата уридин и УМФ могут проявлять антигипоксическую активностью.

Цель настоящей работы — исследовать антигипоксические свойства уридина и УМФ на моделях гипоксической гипоксии с гиперкапнией (ГГсГ), гемической гипоксии и локальной циркуляторной гипоксии, вызванной окклюзией левой коронарной артерии (ЛКА).

Методы исследования

Опыты выполнены на животных, полученных из питомника «Рапполово» и содержавшихся в стандартных условиях вивария при естественном освещении со свободным доступом к воде и еде.

ГГсГ моделировали на 37 самцах и 38 самках белых беспородных мышей массой 28–30 г. Животных помещали по одному в герметически закрывающиеся банки и определяли продолжительность их жизни в замкнутом объеме. Антигипоксическую активность уридина и УМФ сравнивали с эталонным анигипоксантом амтизолом, который вводили в дозе 50 мг/кг. Гемическую гипоксию вызывали у 23 крыс-самцов линии Вистар массой 350–370 г введением нитрита натрия (внутримышечно в дозе 100 мг/кг). Об эффективности препаратов судили по продолжительности жизни животных. За 30 мин до начала ГГсГ и гемической гипоксии животным внутрибрюшинно вводили уридин или УМФ в дозе 30 мг/кг. Контрольные мыши и крысы получали физиологический раствор.

Локальную циркуляторную гипоксию моделировали на 52 крысах-самцах линии Вистар массой 250–300 г. Острую коронарную недостаточность длительностью 60 мин воспроизводили перевязкой нисходящей ветви ЛКА на уровне нижнего края ушка левого предсердия при искусственной вентиляции легких. Животных наркотизировали этаминалом натрия (50 мг/кг). Уридин или УМФ в дозе 30 мг/кг вводили внутривенно за 5 мин до окклюзии ЛКА. Для выявления участия мито-КАТФ-каналов в эффектах исследуемых препаратов использовали селективный блокатор этих каналов 5-гидроксидеканоат (5-ГД, 5 мг/кг, внутривенно, за 5 мин до инъекции уридина или УМФ). Контрольные крысы с циркуляторной гипоксией без медикаментозной коррекции получали физиологический раствор. Антигипоксическое действие препаратов оценивали по изменению объема поврежденного миокарда. Для этого через 60 мин после окклюзии ЛКА сердца крыс замораживали при –20 °C и разрезали на четыре сегмента толщиной 2 мм, с которых изготавливали по одному срезу. В каждом срезе после гистохимического определения фермента гликогенфосфорилазы планиметрически оценивали площадь участка, где ферментативная активность отсутствовала [14]. Индекс повреждения миокарда (ИПМ) рассчитывали по формуле: ИПМ = ∑S1–4/лин. увел2 × вес сердца, где S1–4 — сумма площадей зоны повреждения с потерей ферментативной активности на всех срезах одного сердца.

Статистическую обработку данных проводили стандартными методами с использованием t-критерия Стъюдента и дисперсионного анализа ANOVA при помощи пакета статистических программ Statistica 6.

Результаты исследования

ГГсГ приводила к гибели контрольных самцов мышей через 663 ± 18 с (табл. 1). Самки были более устойчивы к гипоксии и жили в 1,43 раза дольше, чем самцы. Эффект эталонного антигипоксанта амтизола был схожим у самцов и самок. Он увеличивал продолжительность жизни самок на 48 %, самцов — на 56 %. Введение самцам уридина и УМФ увеличивало продолжительность их жизни на 25 и 20 % соответственно. У самок антигипоксическое действие препаратов не проявлялось.

 

Таблица 1. Влияние уридина и уридин-5′-монофосфата (УМФ) на продолжительность жизни животных на модели гипоксической гипоксии с гиперкапнией и гемической гипоксии

Группа	Гипоксическая гипоксия с гиперкапнией		Гемическая гипоксия
	продолжительность жизни мышей-самцов, с	продолжительность жизни мышей-самок, с	Продолжительность жизни крыс, мин
Контроль	663 ± 18	951 ± 43#	57,2 ± 2,4
Амтизол, 50 мг/кг	1034 ± 65*	1407 ± 32*	–
Уридин, 30 мг/кг	828 ± 31*	979 ± 50	62,1 ± 1,8
УМФ, 30 мг/кг	795 ± 44*	989 ± 57	61,5 ± 1,6
Примечание: * отличия от контрольной группы статистически достоверны при р < 0,05; # различия между самцами и самками достоверны при р < 0,05

 

В условиях гемической гипоксии продолжительность жизни контрольных крыс составила 57,2 ± 2,4 мин. Продолжительность жизни крыс, получавших уридин или УМФ, не отличалась от контрольных значений (см. табл. 1).

При циркуляторной гипоксии через 60 мин после окклюзии ЛКА наблюдались признаки гипоксического повреждения миокарда, что выражалось в исчезновении активности гликогенфосфорилазы в кардио­миоцитах. ИПМ в контроле составил 1,08 ± 0,04. Введение уридина за 5 мин до окклюзии привело к уменьшению объема повреждения почти в 2 раза (ИПМ = 0,59 ± 0,06, р < 0,05), а УМФ — в 3,5 раза (ИПМ = 0,31 ± 0,07, р < 0,01) (рис. 1). Ингибитор мито-КАТФ-каналов 5-ГД блокировал защитный эффект этих соединений.

 

Рис. 1. Влияние уридина и УМФ на величину зоны повреждения миокарда через 60 мин после окклюзии левой коронарной артерии (ЛКА). 1 — контроль — локальная циркуляторная гипоксия (ЦГ), вызванная окклюзией ЛКА; 2 — ЦГ + уридин; 3 — ЦГ + 5-гидроксидеканоат (5-ГД, селективный ингибитор мито-КАТФ-каналов) + уридин; 4 — ЦГ + УМФ; 5 — ЦГ + 5-ГД + УМФ. Уридин и УМФ вводили в дозе 30 мг/кг за 5 мин до окклюзии, 5-ГД — в дозе 5 мг/кг за 5 мин до уридина или УМФ. * различия между 1-й и 2-й группами достоверны при p < 0,05, между 1-й и 4-й группами — при p < 0,01

 

Обсуждение полученных результатов

Гипоксия представляет собой универсальный процесс, который лежит в основе развития большого количества патологических состояний. Главным патогенетическим звеном при кислородном голодании тканей любой природы является нарушение митохондриального дыхания и окислительного фосфорилирования, что приводит к недостатку энергии, необходимой для поддержания функционирования всех систем организма. Повреждающее действие гипоксии усугубляется лавинообразным накоплением недоокисленных продуктов с появлением высокотоксичных свободных радикалов, что в свою очередь приводит к дальнейшей дезорганизации дыхательной цепи и усугублению энергетического дефицита [1]. Поэтому большой интерес вызывает изучение антигипоксических свойств препаратов, механизм действия которых связан с предотвращением или ограничением нарушения энергетического баланса в клетках. К числу таких препаратов можно отнести уридин и УМФ, действие которых опосредуется активацией мито-КАТФ-каналов — природного механизма защиты от гипоксии. Ранее было показано, что эти соединения проявляют энергостабилизирующий эффект, подавляют гиперактивацию перекисного окисления липидов, восстанавливают активность ферментов антиоксидантной системы при острой ишемии миокарда [5, 6].

В настоящей работе изучение антигипоксических свойств уридина и УМФ проводили на трех моделях гипоксии. ГГсГ возникает при нормальном общем барометрическом давлении, но сниженном парциальном давлении кислорода во вдыхаемом воздухе [9, 12]. Примером развития такого вида гипоксии может быть нахождение в небольших замкнутых помещениях, работа в шахтах, колодцах, подводных лодках. В эксперименте острая кислородная недостаточность, возникающая в результате уменьшения напряжения кислорода в плазме крови и недостаточного насыщения им гемоглобина, приводит к летальному исходу. Однако продолжительность жизни самцов и самок мышей при ГГсГ различается. В нашем эксперименте самки жили в замкнутом объеме в 1,4 раза дольше самцов. Защитное действие уридина и УМФ наблюдалось только у самцов, у которых препараты увеличивали продолжительность их жизни на 25 и 20 % соответственно. В то же время введение уридина и УМФ самкам не приводило к положительному результату. Это свидетельствует о том, что антигипоксический эффект этих препаратов проявляется у менее устойчивых к гипоксии животных. Возможно, это связано с особенностями работы мито-КАТФ-каналов, участвующих в механизме действия препаратов, у животных с разной толерантностью к гипоксии.

Изучение параметров дыхания и окислительного фосфорилирования в митохондриях сердца крыс с разной генетически детерминированной толерантностью к гипоксии показало, что у высокоустойчивых животных сопряжение дыхательной цепи выше и синтез АТФ происходит более эффективно [11]. У низкоустойчивых животных мито-КАТФ-каналы работают менее эффективно и процесс синтеза АТФ характеризуется исходно меньшей экономичностью. В этом случае гипоксия, то есть увеличение функцио­нальной нагрузки на дыхательную цепь митохондрий, приводит к быстрому истощению ее резервных возможностей, а активация каналов, вероятно, может обеспечить увеличение интенсивности синтеза макроэргических соединений и повышение устойчивости к гипоксическому воздействию. Можно предположить, что у самцов и самок существуют аналогичные особенности функционирования каналов и синтеза АТФ. Было показано, что уридин по-разному влияет на выносливость животных с разной устойчивостью к физической нагрузке, оказывая максимальный положительный эффект на низко­устойчивых крыс [10]. Это действие сопровождается увеличением скорости транспорта калия в митохондриях. Приведенные данные являются косвенным свидетельством связи между особенностями антигипоксического действия уридина и УМФ у самок и самцов и возможностью существования половых различий в функционировании мито-КАТФ-каналов. Однако этот вопрос остается пока неизученным.

Локальная циркуляторная гипоксия, вызванная окклюзией ЛКА, сопровождается формированием очага повреждения миокарда. Введение крысам уридина и УМФ за 5 мин до окклюзии ЛКА уменьшает объем зоны повреждения в 2 и 3,5 раза соответственно. Ранее были получены данные о том, что эти соединения способствуют восстановлению содержания АТФ в миокарде до исходного уровня к 30-й минуте, а креатинфосфата — к 60-й минуте ишемии, нормализуя таким образом энергетический обмен в кардиомиоцитах [6]. При введении препаратов на фоне блокады мито-КАТФ-каналов их положительный эффект значительно ослабевает. Это свидетельствует в пользу предположения о том, что уридин и УМФ, превращаясь в уридиндифосфат, активируют мито-КАТФ-каналы, что приводит к ограничению структурно-функциональных изменений митохондрий. Тем самым обеспечивается возможность синтеза макроэргических соединений и увеличения резистентности миокарда к недостатку кислорода. Кроме того, в условиях нарушения коронарного кровообращения возрастает роль гликогена как энергетического субстрата. Ранее было продемонстрировано, что УМФ способствует восстановлению запасов гликогена в кардиомиоцитах в условиях кислородной недостаточности [2]. Таким образом, при гипоксии препараты могут участвовать в коррекции энергетического обмена в кардиомиоцитах, с одной стороны, активируя мито-КАТФ-каналы и сохраняя тем самым функциональную активность митохондрий, а с другой — увеличивая субстратное обеспечение аэробного и анаэробного синтеза макроэргических соединений.

Заключение

Уридин и УМФ являются метаболическими предшественниками в синтезе природного активатора мито-КАТФ-каналов УДФ. Эти соединения оказывают умеренное антигипоксическое действие при ГГсГ и выраженное защитное действие в условиях локальной циркуляторной гипоксии. На модели ГГсГ антигипоксическая активность препаратов проявляется по-разному у самок и самцов мышей, что может быть связано с половыми различиями в устойчивости животных к воздействию ГГсГ. Максимальный эффект наблюдается при исходно низкой устойчивости организма к кислородной недостаточности и может быть связан с особенностями функционирования мито-КАТФ-каналов. При локальной циркуляторной гипоксии антигипоксический эффект уридина и УМФ проявляется в значительном уменьшении объема повреждения миокарда. Механизм антигипоксического действия препаратов связан с активацией мито-КАТФ-каналов, так как их предварительная блокада селективным ингибитором 5-ГД в значительной степени ограничивает их положительное влияние.

Об авторах

Ирина Борисовна Крылова

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»

Автор, ответственный за переписку.
Email: irinakrylova@mail.ru

канд. биол. наук, старший научный сотрудник отдела нейрофармакологии им. акад. С.В. Аничкова

Россия, Санкт-Петербург

Альбина Федоровна Сафонова

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»

Email: a.safonova@list.ru

научный сотрудник отдела нейрофармакологии им. акад. С.В. Аничкова

Россия, Санкт-Петербург

Наталья Ремовна Евдокимова

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»

Email: enatalyar@mail.ru

канд. биол. наук, научный сотрудник отдела нейрофармакологии им. акад. С.В. Аничкова

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы