Email this article 
Some pharmacokinetics aspects of new analgetics from hexaazaisiowuritsitane class in rats
- Authors: Lopatina K.A.1, Bryushinina O.S.1, Gurto R.V.1, Krylova S.G.1, Zuzkova Y.G.1, Kulagina D.A.2, Safonova E.A.1, Zueva E.P.1, Sysolyatin S.V.2
-
Affiliations:
- Tomsk National Research Medical Center of the RAS, Goldberg Research Institute of Pharmacology and Regenerative Medicine
- Institute for Problems of Chemical and Energetic Technologies of the Siberian Branch оf the RAS
- Issue: Vol 17, No 4 (2019)
- Pages: 51-56
- Section: Original articles
- URL: https://journals.eco-vector.com/RCF/article/view/13498
- DOI: https://doi.org/10.17816/RCF17451-56
- ID: 13498
Cite item
Full Text
Abstract
An important stage in the preclinical study of a new drug is the study of its pharmacokinetics: absorption, distribution, metabolism, and excretion of the drug compound.
The purpose of this study was to study the pharmacokinetics in healthy animals of a new analgesic based on hexaazaisowurtzitane (thiowurtzine).
Materials and methods. A technique for determining the concentration of thiowurtzine in the blood plasma and rat excreta has been developed and validated. Using high-performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry, concentrations of thiowurtzine in plasma and rat excreta were determined after a single intragastric dose of 100 mg/kg.
Results. The peak concentration of thiowurtzine in the blood plasma of rats accounts for 2 hours, which is consistent with the pharmacodynamic data of the analgesic, the average retention time of the substance in the body reached 17.15 h after administration. Thiowurtzine is believed to be actively metabolized.
Full Text
ВВЕДЕНИЕ
Важным этапом доклинического исследования нового лекарственного средства является изучение его фармакокинетики [1, 2]. Всасывание, распределение, метаболизм и выведение лекарственного соединения — взаимосвязанные процессы. Все они подвержены влиянию множества факторов: скорость всасывания зависит от физико-химических свойств, лекарственной формы препарата, концентрации действующего вещества, рН среды, в которой происходит растворение вещества, перистальтики кишечника и состояния площади поверхности всасывания [3]. На показатели распределения и биотрансформации лекарственного препарата влияют пол, возраст, соматическое состояние организма, а также состояние ферментативных систем организма, что часто обусловлено индивидуальными различиями. Высокоэффективная жидкостная хроматография и тандемная масс-спектрометрия являются приоритетными инструментами при постановке методик, позволяющих проводить количественную оценку целевых молекул в сложных биологических матрицах [4–6].
Целью настоящего исследования было изучение у крыс фармакокинетики нового анальгетика, синтезированного в Институте проблем химико-энергетических технологий СО РАН (г. Бийск) на основе гексаазаизовюрцитана. К настоящему времени закончен этап испытаний на животных. Новый препарат на основе гексаазаизовюрцитана будет рекомендован для лечения болевого синдрома различной этиологии, благодаря своему мощному анальгетическому потенциалу и низкому профилю токсичности.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Сведения об исследуемом веществе. Инновационная молекула представляет собой полиазотистое полициклическое соединение каркасного строения — 4-[(3,4-дибромтиофен)-2-карбонил]-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло [5.5.0.03,11.05,9]додекан) (далее — тиовюрцин, TVC) (рис. 1). Получено впервые ацилированием промышленно доступного 2,6,8,12-тетраацетил- 2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5.5.0.03,11.05,9]додекана хлорангидридом 3,4-дибромтиофенкарбоновой кислоты. Процесс проводили в среде ацетонитрила при температуре кипения реакционной массы.
Рис. 1. Синтез 4-[(3,4-дибромтиофен)-2-карбонил]-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5.5.0.03,11.05,9]-додекана (тиовюрцина)
Дизайн исследования. Эксперименты выполнены на половозрелых аутбредных крысах-самцах (возраст 3 мес., масса тела 270–330 г), стока SD разводки отдела экспериментальных биологических моделей Научно-исследовательского института фармакологии и регенеративной медицины им. Е.Д. Гольдберга (НИИФиРМ) Томского НИМЦ РАН.
В рамках выполненного исследования были изучены процессы: всасывания — оценена динамика концентраций тиовюрцина в плазме крови крыс после однократного внутрижелудочного введения; экскреции — исследована динамика выведения тиовюрцина с мочой и калом у крыс.
Тиовюрцин вводили крысам однократно внутрижелудочно в дозе 100 мг/кг на 1 % крахмальном геле. В качестве основного биоматериала была использована кровь. Для оценки экскреции препарата животным натощак, однократно внутрижелудочно вводили тиовюрцин в дозе 100 мг/кг, после чего животных помещали в индивидуальные метаболические клетки с доступом к воде и пище, и в течение 1 сут. был проведен забор экскретов (фекалии и моча) для оценки динамики выведения тиовюрцина и определения приоритетного пути выведения препарата.
Пробы крови у крыс отбирали до введения лекарственного средства и через 20, 40 мин и 1, 1,5, 2, 4, 6, 8, 16 и 24 ч после введения.
Животных, находящихся под наркозом в камере с СО2, декапитировали и проводили забор органов и крови. Образцы крови собирали в гепаринизированные пробирки и центрифугировали при 1600 g в течение 10 мин. Отобранная плазма помещалась в пластиковые пробирки и хранилась при температуре –24 °C до проведения аналитического этапа работы.
Методика количественного определения тиовюрцина. Методика количественного определения тиовюрцина в плазме крови и экскретах была впервые разработана и валидирована перед исследованием в лаборатории молекулярной и клинической физиологии НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга (Томский НИМЦ). Количественное определение тиовюрцина в биологических образцах животных проводили чувствительным, избирательным и точным хромато-масс-спектрометрическим методом. Исследование было проведено с использованием жидкостного хроматографа Prominence (Shimadzu) и гибридного масс-спектрометрического детектора AB Sciex 3200 Qtrap (AB Sciex, США), оснащенного линейной ловушкой. Источник ионизации — электроспрей Turbo V (ESI). Обработку хроматографических данных проводили с помощью программного обеспечения Analyst.
Условия хроматографического анализа и масс-спектрометрического детектирования были оптимизированы для обеспечения максимальной чувствительности детектора в режиме мониторинга множественных реакций (Multiple Reaction Monitoring, MRM) с использованием источника ионизации распылением в электрическом поле (ESI+). Давление газа-распылителя азота составило (GS1) — 35 psi, турбогаза для пробоввода TurboIonSpray (GS2) — 45 psi; температура турбогаза — 525 °C; напряжение на иглораспылителе — 4,75 кВ; газовая завеса — 10 psi. Для детектирования использовали MRM-переходы: TVC — 604,8/268,8 (DP = 60, EP = 5,80, CE = 60, CEP = 27,57, CXP = 2,30, CAD = high).
Масс-спектр аналита тиовюрцина представлен на рис. 2.
Рис. 2. Масс-спектр тиовюрцина
Хроматографическое разделение аналита проводили на колонке ProntoSIL 120-3-С18 (ЗАО «ЭкоНова», Россия) 85 % элюентом B. Скорость потока была установлена 0,25 мл/мин, температура колонки 40 °C, в качестве элюента А использовали 5 mM формиат аммония (pH = 2,8), элюента В — ацетонитрил. Перед хроматографическим анализом подвижную фазу дегазировали на ультразвуковой бане и фильтровали. Хроматографический анализ проводили в градиентном режиме, объем инжекции аналита — 5 мкл. Среднее время удерживания тиовюрцина составляло 1,60 ± 0,02 мин. Экспериментальные значения концентрации лекарственного средства в плазме крови рассчитывали после однократного введения тиовюрцина в динамике.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Динамика концентраций тиовюрцина в плазме крови крыс. Результаты исследования показали, что вещество достигает максимальной концентрации в течение 1,8 ч после введения. Затем наблюдается 2 фазы снижения концентрации вещества. В первой фазе (α-фазе) происходит резкое снижение, по-видимому, за счет быстрого распределения его в ткани органов (фаза распределения), полупериод распределения составляет 51 мин. Вторая фаза характеризуется более медленным снижением концентрации тиовюрцина и описывает кинетику выведения вещества из организма (фаза элиминации), полупериод элиминации — 16,3 ч. Значение среднего времени удерживания (17,15 ч) свидетельствует о медленном выведении тиовюрцина из организма.
Усредненный фармакокинетический профиль лекарственного средства в плазме крови крыс после однократного внутрижелудочного введения в дозе 100 мг/кг представлен на рис. 3.
Рис. 3. Усредненный фармакокинетический профиль тиовюрцина в плазме крови крыс после однократного внутрижелудочного введения в дозе 100 мг/кг
Оценка концентрации тиовюрцина в моче и кале крыс. Для оценки процесса элиминации лекарственного соединения из организма крыс использовали методику изучения кинетики выведения с мочой и калом. Концентрации тиовюрцина в моче и кале крыс на протяжении 1 сут после однократного введения препарата в дозе 100 мг/кг, суточный объем полученного экскрета на протяжении изучаемого периода и процент дозы представлены в табл. 1 и 2.
Таблица 1. Результаты оценки количества тиовюрцина в моче крыс после однократного внутрижелудочного введения в дозе 100 мг/кг
№ пробы | Концентрация, нг/мл | Суточный объем мочи крыс, мл | Количество, мг | Процент дозы |
1 | 390,7 | 8,5 | 0,0033 | 0,011 |
2 | 452,9 | 3,6 | 0,0016 | 0,005 |
3 | 195,6 | 11,2 | 0,0022 | 0,007 |
4 | 429,1 | 6,4 | 0,0027 | 0,009 |
5 | 224,2 | 6,0 | 0,0013 | 0,004 |
6 | 677,5 | 8,7 | 0,0059 | 0,020 |
M | 395,0 | 7,4 | 0,0029 | 0,010 |
± m | 195,7 | 2,9 | 0,0018 | 0,006 |
CV, % | 49,6 | 39,0 | 63,8911 | 63,891 |
Таблица 2. Результаты оценки количества тиовюрцина в кале крыс после однократного внутрижелудочного введения в дозе 100 мг/кг
№ пробы | Концентрация, нг/г | Суточный объем кала крыс, г | Количество, мг | Процент дозы |
1 | 151257,0 | 4,0 | 0,61 | 2,02 |
2 | 202125,9 | 3,6 | 0,74 | 2,45 |
3 | 164212,9 | 3,0 | 0,49 | 1,64 |
4 | 379210,8 | 5,7 | 2,17 | 7,22 |
5 | 286761,6 | 5,4 | 1,54 | 5,13 |
6 | 215931,5 | 2,4 | 0,53 | 1,75 |
M | 233250,0 | 4,0 | 1,01 | 3,37 |
± m | 84938,6 | 1,4 | 0,73 | 2,45 |
CV, % | 36,4 | 35,9 | 72,67 | 72,67 |
Результаты исследования экскреции тиовюрцина у крыс после внутрижелудочного введения в дозе 100 мг/кг показали, что основная часть вещества выводится в течение первых суток: с калом — в среднем 3,37 % от введенной дозы, а с мочой — в среднем 0,01 % от введенной дозы.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, проведенные фармакокинетические исследования показали, что максимальные значения концентрации тиовюрцина в плазме крови крыс достигаются через 2 ч после введения препарата в терапевтической дозе 100 мг/кг, что согласуется с данными фармакодинамики нового анальгетика: максимум анальгетической активности наблюдался в экспериментах «Горячая пластина», начиная с 1 ч после применения тиовюрцина, и длился до 4 ч наблюдения. В тесте механической соматической боли при раздражении основания хвоста крыс по Гаффнеру анальгетический эффект длился до 16–17 ч, что соответствует фармакокинетическим данным, полученным в настоящем исследовании: среднее время удерживания вещества в организме достигало 17,15 ч после введения.
Низкое количество тиовюрцина, выделенного в неизменном виде, свидетельствует об активном процессе биотрансформации, возможно наличие фармакологически активных метаболитов.
Работа выполнена в рамках Федеральной целевой программы «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу», госконтракт от 15 августа 2017 г. № 14.N08.11.0179 «Доклинические исследования лекарственного средства на основе производных гексаазаизовюрцитана для терапии болевого синдрома различной этиологии».
About the authors
Ksenya A. Lopatina
Tomsk National Research Medical Center of the RAS, Goldberg Research Institute of Pharmacology and Regenerative Medicine
Author for correspondence.
Email: k.lopatina@pharmso.ru
PhD, Senior Researcher of Oncopharmacology Laboratory
Russian Federation, TomskOlga S. Bryushinina
Tomsk National Research Medical Center of the RAS, Goldberg Research Institute of Pharmacology and Regenerative Medicine
Email: k.lopatina@pharmso.ru
PhD, Researcher of Molecular and Clinical Physiology Laboratory
Russian Federation, TomskRoman V. Gurto
Tomsk National Research Medical Center of the RAS, Goldberg Research Institute of Pharmacology and Regenerative Medicine
Email: roman.gurto@pharmso.ru
PhD, Leading Researcher of Molecular and Clinical Physiology Laboratory
Russian Federation, TomskSvetlana G. Krylova
Tomsk National Research Medical Center of the RAS, Goldberg Research Institute of Pharmacology and Regenerative Medicine
Email: krylova5935@gmail.com
PhD, MD, Leading Researcher of Oncopharmacology Laboratory
Russian Federation, TomskYulia G. Zuzkova
Tomsk National Research Medical Center of the RAS, Goldberg Research Institute of Pharmacology and Regenerative Medicine
Email: roman.gurto@pharmso.ru
Junior Researcher of Molecular and Clinical Physiology Laboratory
Russian Federation, TomskDarya A. Kulagina
Institute for Problems of Chemical and Energetic Technologies of the Siberian Branch оf the RAS
Email: imbiri@rambler.ru
PhD, Researcher of Medical Chemistry Laboratory
Russian Federation, BiyskElena A. Safonova
Tomsk National Research Medical Center of the RAS, Goldberg Research Institute of Pharmacology and Regenerative Medicine
Email: safonova_7@mail.ru
PhD, Researcher of Oncopharmacology Laboratory
Russian Federation, TomskElena P. Zueva
Tomsk National Research Medical Center of the RAS, Goldberg Research Institute of Pharmacology and Regenerative Medicine
Email: zep0929@mail.ru
PhD, MD, Head of Oncopharmacology Laboratory
Saint Helena, Ascension and Tristan da Cunha, TomskSergey V. Sysolyatin
Institute for Problems of Chemical and Energetic Technologies of the Siberian Branch оf the RAS
Email: imbiri@rambler.ru
PhD, MD, Head. Institute for Problems of Chemical and Energetic Technologies of the Siberian Branch оf the RAS
Russian Federation, BiyskReferences
- Мирошниченко И.И. Основы фармакокинетики. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2002. – 192 с. [Miroshnichenko II. Osnovy farmakokinetiki. Moscow: GEOTAR-MED; 2002. 192 p. (In Russ.)]
- Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / Под ред. А.Н. Миронова. Ч. 1. – М.: Гриф и К, 2013. – 944 с. [Rukovodstvo po provedeniyu doklinicheskikh issledovaniy lekarstvennykh sredstv. Ed. by A.N. Mironov. Part 1. Moscow: Grief and K; 2013. 944 p. (In Russ.)]
- Сергиенко В.И., Джеллифф Р., Бондарева И.Б. Прикладная фармакокинетика: основные положения и клиническое применение. – М.: Издательство РАМН, 2003. – 208 с. [Sergienko VI, Jellyff R, Bondareva IB. Prikladnaya farmakokinetika: osnovnye polozheniya i klinicheskoe primenenie. Moscow: Izdatel’stvo RAMN; 2003. 208 p. (In Russ.)]
- Каркищенко Н.Н., Хоронько В.В., Сергеева С.А., Каркищенко В.Н. Фармакокинетика. – Ростов-на-Дону: Феникс, 2001. – 384 с. [Karkishchenko NN, Khoron’ko VV, Sergeeva SA, Karkishchenko VN. Farmakokinetika. Rostov-na-Donu: Phoenix; 2001. 384 p. (In Russ.)]
- Лебедев А.Т. Масс-спектрометрия в органической химии. – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2003. – 493 с. [Lebedev AT. Mass-spektrometriya v organicheskoy khimii. Moscow: BINOM. Laboratoriya znaniy; 2003. 493 p. (In Russ.)]
- Niessen W.M.A. MS–MS and MSn. Encyclopedia of Spectroscopy and Spectrometry. 3rd ed. Ed. by J.C. Lindon, G.E. Tranter, D. Koppenaal. Academic Press; 2016. P. 936-941.
