Comparative effectiveness of Molixan and Glutoxim in the model of toxic liver lesions with anti-tuberculosis drugs

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Согласно данным литературы применение изониазида в терапевтических дозах приводит к развитию у 20 % пациентов острого гепатоцеллюлярного некроза [8]. При этом клинические признаки гепатита отмечаются в 0,1 % случаев, повышение в крови активности трансаминаз наблюдается у 10–20 % пациентов [4]. Стоит отметить, что частота и тяжесть токсических поражений печени возрастает при комбинации изониазида с рифампицином вследствие индукции рифампицином цитохрома Р450 [8]. По данным зарубежных клинических исследований, из 3900 больных туберкулезом пациентов, получавших в качестве лечения комбинацию изониазида с рифампицином, у 150 (3,8 %) развивались лекарственно индуцированные поражения печени [10]. В настоящее время отсутствуют точные данные по возникновению фатальных поражений печени. Однако американские специалисты приводят данные о 8 погибших из 174 человек с лекарственным гепатитом в клиническом исследовании US Public Health Service Surveillance Study, которое включало 13 838 человек [8].

Таким образом, проблема токсических поражений печени при использовании противотуберкулезных средств является актуальной. Для профилактики токсических гепатопатий используют препараты, которые показали свою активность как в экспериментах, так и в клинических исследованиях. В настоящее время все больший интерес вызывают пептидные препараты на основе окисленного глутатиона, такие как моликсан и глутоксим, которые продемонстрировали свою эффективность при различных патологиях, в том числе при лечении хронических вирусных гепатитов В и С, острых крайне тяжелых отравлениях этанолом [1, 3, 9].

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ

Цель исследования заключалась в проведении сравнительной оценки гепатозащитных свойств моликсана и глутоксима при поражениях печени противотуберкулезными препаратами (ПП). Для достижения поставленной цели решали следующие задачи: на модели токсического поражения печени, вызванного ПП (изониазид, рифампицин, пиразинамид), изучить эффективность глутоксима и моликсана по биохимическим и морфологическим показателям; на основании полученных данных определить наиболее эффективную схему применения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эффективность препаратов моликсан и глутоксим изучали на модели поражения печени изониазидом в комбинации с рифампицином и пиразинамидом. Исследование проводили на 90 белых беспородных крысах-самцах из питомника РАН «Рапполово». Экспериментальных животных содержали в условиях вивария не более 6 особей в одной клетке. Содержание, питание и выведение из эксперимента соответствовали нормативным документам [6].

Противотуберкулезные препараты вводили животным ежедневно в течение 14 дней в следующих дозах: изониазид — 50 мг/кг внутрибрюшинно, рифампицин — 250 мг/кг и пиразинамид — 45 мг/кг внутрижелудочно [2]. Глутоксим (20 и 40 мг/кг) и моликсан (30 мг/кг) вводили ежедневно в течение 14 дней внутрибрюшинно за 2 ч до введения ПП. Животные были разделены на пять групп по 18 особей в каждой: 1-я группа — интактные животные, 2-я — контрольная ПП, 3-я — ПП + глутоксим 20 мг/кг, 4-я — ПП + глутоксим 40 мг/кг, 5-я — ПП + моликсан 30 мг/кг.

На 15-й день эксперимента у животных из хвостовой вены забирали кровь, после чего подвергали их эвтаназии, выполняли патологоанатомическое вскрытие и извлекали печень для определения печеночного коэффициента, проведения морфогистологических и биохимических (определение уровня перекисного окисления липидов — ПОЛ) исследований. Активность ПОЛ в гомогенатах печени оценивали по концентрации диеновых конъюгатов (ДК) и малонового диальдегида (МДА). Концентрацию ДК определяли по методике И.Д. Стальной [7]. Содержание МДА в печени крыс определяли по методу M. Uchiyama [11].

Статистическую обработку экспериментальных данных осуществляли при помощи программ Excel for Windows, Statistica 10 с расчетом среднего значения и ошибки среднего. Значимыми считали различия при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При введении ПП в указанных дозах в течение 14 суток гибель животных не была зарегистрирована. У животных 2-й (контрольной) группы, получавших только ПП, отмечались выраженные гепатотоксические реакции, которые проявлялись в значимом повышении относительной массы печени (печеночного коэффициента) до 3,75 ± 0,07 % по сравнению с 2,86 ± 0,1 % в интактной группе (рис. 1), значимом повышении (в 8,4 раза) концентрации общего билирубина в сыворотке крови в контрольной группе по сравнению с интактной (табл. 1). У животных контрольной группы наблюдалось повышение активности процессов перекисного окисления липидов в печени: содержание ДК и МДА в гомогенатах печени крыс контрольной группы значимо превышало аналогичные показатели интактной группы: ДК — в 1,77 раза, а МДА — в 1,89 раза (рис. 2).

 

Рис. 1. Относительная масса печени (печеночный коэффициент) на 15-й день эксперимента у крыс, получавших комплекс противотуберкулезных препаратов (ПП), с лечением и без лечения, %, M ± mx. *р ≤ 0,05 в сравнении с интактной группой; # в сравнении с контрольной группой (t-критерий Стьюдента); n = 18 в каждой группе

 

Рис. 2. Влияние глутоксима и моликсана на содержание диеновых конъюгатов (ДК) и малонового диальдегида (МДА) в гомогенатах печени крыс, получавших комплекс противотуберкулезных препаратов, 15-й день эксперимента, M ± mx. *р ≤ 0,05 в сравнении с интактной группой; # в сравнении с контрольной группой; ^в сравнении с 3-й группой (t-критерий Стьюдента); n = 18 в каждой группе

 

В результате морфогистологического исследования печени у крыс контрольной группы были выявлены полиморфные патологические изменения в паренхиме: балочное строение частично сохранено лишь в некоторых образцах, отсутствует в обширных участках с выраженными дегенеративными (вплоть до некробиотических) изменениями гепатоцитов в виде расширения, базофилии и комковатости цитоплазмы, литических изменений ядер. Описанные изменения имели как очаговый, так и более распространенный характер, отмечались в центролобулярных и перипортальных отделах печеночной дольки (рис. 3).

 

Рис. 3. Печень крысы после ежедневного введения комплекса противотуберкулезных препаратов, контроль, 15-й день эксперимента. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение ×250. 1 — нарушение балочного строения, обширные поля дегенеративно измененных гепатоцитов; 2 — литически измененные ядра гепатоцитов; 3 — гепатоциты с расширением, базофилией и комковатостью цитоплазмы

 

Использование глутоксима в качестве средства коррекции возникающих при применении комплекса ПП токсических поражений печени приводило к значительному снижению их выраженности. При этом наилучший эффект отмечался при применении глутоксима в дозе 40 мг/кг. Положительное влияние препарата подтверждается статистически значимым снижением печеночного коэффициента по сравнению с контрольной группой (см. рис. 1), достоверным снижением (в 1,73 раза) концентрации общего билирубина в сыворотке крови в 4-й группе, по сравнению с контрольной группой (см. табл. 1). Кроме того, у крыс, получавших глутоксим в дозе 40 мг/кг, наблюдалось значимое, по сравнению с контрольной группой, снижение концентрации в гомогенатах печени продуктов окислительной деградации липидов: ДК — в 1,47 раза, МДА — в 1,82 раза (см. рис. 2). Следует отметить, что концентрация ДК и МДА в 4-й группе статистически не отличалась от показателей в интактной группе, что свидетельствует о полной нормализации перекисного окисления липидов, нарушенного в результате воздействия ПП.

 

Таблица 1. Влияние глутоксима и моликсана на биохимические показатели крови крыс, получавших комплекс противотуберкулезных препаратов, 15-й день эксперимента, M ± m_x

Показатель	Группа
	1-я, интактные животные	2-я, контроль ПП	3-я, ПП + глутоксим 20 мг/кг	4-я, ПП + глутоксим 40 мг/кг	5-я, ПП + моликсан 30 мг/кг
АЛТ, ЕД/л	62,10 ± 10,36	40,63 ± 4,96	47,42 ± 2,08	37,40 ± 1,84	36,22 ± 2,03
АСТ, ЕД/л	226,60 ± 25,73	165,87 ± 7,54	190,80 ± 16,17	142,48 ± 9,81 *	141,88 ± 9,31
Общий белок, г/л	63,65 ± 2,82	57,58 ± 1,60	63,63 ± 1,56	60,47 ± 2,09	60,10 ± 1,76
Общий билирубин, мкмоль/л	1,50 ± 0,33	12,52 ± 1,56 *	10,98 ± 0,56 *	7,25 ± 0,53 *#^	3,07 ± 0,60 #^×
ЛДГ, ЕД/л	442,3 ± 31,3	448,0 ± 41,0	486,8 ± 64,6	349,0 ± 44,3	349,7 ± 46,7
Щелочная фосфатаза, ЕД/л	171,8 ± 29,6	122,7 ± 21,1	118,8 ± 25,8	114,8 ± 24,0	116,3 ± 25,2
Примечание: *р ≤ 0,05 в сравнении с интактной группой; # в сравнении с контрольной группой; ^ в сравнении с 3-й группой; × в сравнении с 4-й группой (t-критерий Стьюдента); n = 18 в каждой группе. ПП — противотуберкулезный препарат.

 

На гистологических препаратах печени крыс 4-й группы патологические изменения в паренхиме печени, по сравнению с контрольной группой, выражены существенно меньше: балочное строение было сохранено, некробиотические изменения не выявлены, наблюдались только фокальные дистрофические изменения гепатоцитов, преимущественно в центролобулярных отделах. Кроме того, глутоксим улучшал гемодинамику печени: в гистологических препаратах интактной группы и группы, получавшей глутоксим, зарегистрировано выраженное полнокровие центральных вен, в то время как в контрольной группе центральные вены преимущественно были малокровны (рис. 4).

 

Рис. 4. Печень крысы после ежедневного введения комплекса противотуберкулезных препаратов и лечения глутоксимом в дозе 40 мг/кг, 15-й день эксперимента. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение ×250. 1 — фокальные дистрофические изменения гепатоцитов; 2 — неизмененные печеночные балки; 3 — неизмененные гепатоциты в перипортальных отделах печеночной дольки

 

Применение глутоксима в дозе 20 мг/кг также оказывало защитное действие на печень крыс, получавших ПП, но оно было менее выраженным: концентрация общего билирубина в 3-й группе была выше, чем в 4-й, и значимо не отличалась от аналогичного показателя контрольной группы (см. табл. 1). Глутоксим в дозе 20 мг/кг способствовал снижению интенсивности ПОЛ в гепатоцитах, о чем свидетельствует достоверное снижение содержания ДК и МДА в гомогенатах печени по сравнению с контрольной группой, при этом концентрация МДА в печени крыс 3-й группы была значимо выше показателя интактной группы, группы, получавшей препарат в дозе 40 мг/кг, и группы, получавшей моликсан в дозе 30 мг/кг (см. рис. 2).

При морфогистологическом исследовании была зафиксирована тенденция к нормализации структуры печени, но эффект был менее выраженным, чем при использовании глутоксима в дозе 40 мг/кг, то есть наблюдался дозозависимый эффект. На гистологических срезах печени животных, получавших глутоксим в дозе 20 мг/кг, структура и балочное строение паренхимы было сохранно во всех образцах. Некровоспалительных изменений в перипортальных отделах печеночных долек выявлено не было, однако в ряде препаратов в центролобулярных отделах отмечались дистрофические изменения мелких групп гепатоцитов, вплоть до дегенеративных, с формированием зернистости цитоплазмы и кариолизиса, при этом данные изменения носили менее выраженный характер, чем в контрольной группе.

Моликсан в дозе 30 мг/кг для коррекции нарушений со стороны печени при интоксикации ПП оказался еще более эффективным по сравнению с глутоксимом. Как видно из табл. 1, при биохимическом исследовании крови концентрация общего билирубина в сыворотке крови животных, получавших моликсан, достоверно отличалась от таковой в контрольной группе, а также в группах, получавших глутоксим.

Введение моликсана в дозе 30 мг/кг сопровождалось достоверным снижением концентрации ДК и МДА по сравнению с контрольной группой (см. рис. 2). Содержание ДК в печени крыс 5-й группы было в 1,55 раза ниже, чем у крыс контрольной группы. Концентрация МДА в гомогенатах печени при применении моликсана была статистически значимо ниже показателя не только в контрольной группе, но и в группе, получавшей глутоксим в дозе 20 мг/кг.

Морфогистологическое исследование срезов печени крыс, получавших моликсан, также свидетельствовало о наличии выраженной тенденции к нормализации структуры печеночной ткани по сравнению с контрольной группой. При этом наилучшая гистологическая картина отмечалась при использовании моликсана в дозе 30 мг/кг. Во всех препаратах структура ткани печени и балочное строение паренхимы были сохранены, в 50 % образцов наблюдались незначительные изменения мелких групп гепатоцитов в виде базофильной зернистости цитоплазмы, встречающиеся преимущественно в центролобулярных отделах печеночных долек, в перипортальных отделах некровоспалительные изменения отсутствовали. В половине образцов патологических изменений паренхимы печени по сравнению с интактной группой зарегистрировано не было (рис. 5).

 

Рис. 5. Печень крысы после ежедневного введения комплекса противотуберкулезных препаратов и лечения моликсаном в дозе 30 мг/кг (слева) и интактной крысы (справа), 15-й день эксперимента. Окраска гематоксилином и эозином, увеличение ×250. Слева: 1 — центральная вена; 2 — неизмененные печеночные балки. Справа: 1 — неизмененные печеночные балки

 

Таким образом, использование глутоксима и моликсана в качестве гепатопротекторов при поражениях печени ПП оказалось эффективным, при этом уровень гепатозащитной активности глутоксима носил дозозависимый характер.

Механизм токсического поражения печени изониазидом обусловлен повреждающим действием N-ацетилконъюгата (N-ацетилизониазида), образующегося в процессе метаболизма препарата под влиянием N-ацетилтрансферазы 2 (NAT2). Существует две гипотезы возникновения токсической гепатопатии при комбинированном применении изониазида с рифампицином. Согласно первой теории изониазид в процессе метаболизма превращается в ацетилгидразин с последующим образованием свободных радикалов, при этом процесс не индуцируется рифампицином, согласно второй — происходит прямой гидролиз изониазида до изоникотиновой кислоты и гидразина под воздействием рифампицина [8]. Кроме того, полученные нами данные о резком повышении (в 8,4 раза) концентрации общего билирубина у крыс, получавших ПП, вероятнее всего, обусловлены развитием у животных синдрома внутрипеченочного холестаза вследствие повреждения гепатоцитов и желчных капилляров, о чем свидетельствует нарушенное балочное строение паренхимы печени отравленных животных на гистологических срезах.

Эффективность моликсана и глутоксима, являющихся дисульфидами глутатиона, объясняется, по-видимому, их участием в тиол-дисульфидном обмене гепатоцитов. Известно, что в ходе окислительного стресса в цитозоле оксиленный глутатион обеспечивает процесс S-глутатионилирования белков, таким образом защищая белковые молекулы от других необратимых форм окисления [5]. Более высокая эффективность моликсана при этом, по всей видимости, связана с присутствием в его составе инозина, что способствует улучшению микроциркуляции в паренхиме печени, восстановлению активности аэробных процессов в гепатоцитах и улучшению их энергообеспечения.

Выраженные улучшения по сравнению с контрольной группой отмечены у всех животных, получавших как глутоксим, так и моликсан, что свидетельствует об эффективности данных препаратов при поражениях печени противотуберкулезными средствами.

ВЫВОДЫ

В результате экспериментального исследования показано выраженное гепатозащитное действие моликсана и глутоксима. При этом наилучший эффект отмечен при применении моликсана, а эффективность глутоксима носила дозозависимый характер.

Гепатопротекторные свойства моликсана могут стать основанием для проведения дальнейших клинических исследований по возможному применению препарата в комплексной терапии туберкулеза.

About the authors

Pjotr A. Bugaev

S.M. Kirov Military Medical Academy

Author for correspondence.
Email: petr-bugaev@mail.ru

Head of Department of Clinic Military-field Therapy

Russian Federation, 6G, Akademika Lebedeva street, Saint-Petersburg, 194044

Vadim A. Basharin

S.M. Kirov Military Medical Academy

Email: basharin1@mail.ru

Doctor of Medical Sciences, Professor, Head of the Department of Military Toxicology and Medical Protection

Russian Federation, 6G, Akademika Lebedeva street, Saint-Petersburg, 194044

Aleksandr E. Antushevich

S.M. Kirov Military Medical Academy

Email: a.antushevich@mail.ru

Doctor of Medical Sciences, Senior Researcher of the Research Laboratory of Military Therapy of the Research Center

Russian Federation, 6G, Akademika Lebedeva street, Saint-Petersburg, 194044

References