Effect of altered thyroid status on the incidence of colon tumors induced by methylnitrosourea in rats

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Поиск механизмов и технологий, препятствующих возникновению и/или развитию рака, а также его раннему выявлению, продолжается в различных направлениях [17]. Одним из направлений вторичной профилактики злокачественных новообразований — раннего выявления опухолей или предопухолевых заболеваний является стратификация факторов риска и формирование групп повышенного риска возникновения опухолей тех или иных топических локализаций [2]. В свете новых данных о проканцерогенных эффектах избыточных концентраций йодотиронинов одну из таких групп могут составить пациенты с длительно протекающим гипертиреозом в анамнезе, например с диффузным или узловым токсическим зобом [3]. Избыточные концентрации L-тироксина (Т₄) как основного, в отличие от трийодтиронина (Т₃), лиганда мембранного рецептора, расположенного на интегрине CD51/CD61 (ανβ₃), в результате соответствующего взаимодействия приводят к активации клеточной пролиферации и ангиогенеза, а также усилению экспрессии других генов, активация которых обеспечивает автономность опухолевых клеток [6].

Цель исследования — изучение влияния медикаментозно измененного тиреоидного статуса (гипо- и гипертиреоза) на частоту развития вызываемых метилнитрозомочевиной опухолей толстой кишки у лабораторных животных (беспородных крыс).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Общий дизайн экспериментального исследования. Исследование проведено на 99 самках беспородных крыс (ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово», Ленинградская область) в возрасте 30 ± 10 дней с начальной массой тела 180–200 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария с декабря по август. Длительность карантина (акклиматизационного периода) для всех животных составляла не менее 14 дней. В течение карантина каждое животное осматривали (оценивали поведение и общее состояние) дважды в день (в утренние и вечерние часы). Лабораторных животных с подозрением на любое заболевание и/или с измененным поведением исключали из исследования в период карантина. После окончания карантина лабораторные животные были рандомизированно распределены на четыре равные группы по 22 особи в каждой, оставшиеся 11 крыс служили контролем. Рандомизацию лабораторных животных проводили методом закрытых конвертов. Общая продолжительность эксперимента без учета карантина составила 216 дней.

Содержание животных. Питание и содержание лабораторных животных соответствовали нормам приказа МЗ СССР № 1179 от 10 октября 1983 г. «Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник». Работа проведена в соответствии с этическими принципами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принята в Страсбурге 18.03.1986 и подтверждена в Страсбурге 15.06.2006) [7], и одобрена локальным этическим комитетом. Животных содержали по 5–6 особей в группе в условиях свободного доступа к воде и пище.

Индукция канцерогенеза. N-метил-N-нитрозомочевина (МНМ) в виде белого порошка была предоставлена ФГБУН «Институт токсикологии Федерального медико-биологического агентства» РФ. Проведены четыре интраректальные инстилляции 4 мг МНМ, растворенной в 0,5 мл изотонического раствора натрия хлорида с кратностью 1 раз в 7 суток, при этом глубина введения ректального зонда составила 7–8 см от ануса [1].

Лекарственная индукция измененного тиреоидного статуса. На лабораторных животных второй (II, гипертиреоидная) и третьей (III, гипертиреоидная) групп воспроизведена модель индуцированного лекарственного гипертиреоза, на четвертой (IV, гипотиреоидная) группе — модель индуцированного пропилтиоурацилового гипотиреоза путем введения исследуемых веществ: лиотиронина натрия (сухое вещество, Balkan Pharmaceuticals, Республика Молдова) в дозе 100 ± 10 мкг на 100 г массы тела животного 1 раз в сутки), L-тироксина (сухое вещество, РУП «Белмедпрепараты», Республика Беларусь) в дозе 100 ± 10 мкг на 100 г массы тела животного 1 раз в сутки, пропилтиоурацила (сухое вещество, Merck Selbstmedikation GmbH, Германия) 2,0 ± 0,15 мг на 100 г массы животного 1 раз в сутки (внутрижелудочно через атравматичный полиуретановый зонд ежедневно, начиная со дня последней интраректальной инстилляции МНМ). Первая (I, МНМ-контроль) группа служила группой сравнения эффектов индуцированного МНМ-канцерогенеза толстой кишки. После взвешивания лабораторных животных (не реже 1 раз в 7 дней) необходимое количество исследуемой субстанции растворяли в 1,0 мл индифферентного пищевого желатинового геля (Henan Boom Gelatin Co., Ltd, КНР) и вводили соответствующей особи. С целью создания одинакового стрессового фактора лабораторные животные групп сравнения (I, МНМ-контроль, V, контроль) также получали по 1,0 мл геля внутрижелудочно через зонд.

Морфологическое исследование. После вывода из эксперимента лабораторных животных производили вскрытие брюшной полости с тотальной экстирпацией толстой кишки с целью подтверждения наличия опухоли. Образцы тканей у всех исследованных животных забирали из участков, подозрительных на наличие новообразования, а также в пределах идентичных зон исследуемых участков толстой кишки, при этом обеспечивали случайный отбор кусочков ткани и формирование представительной выборки морфологического исследования. Далее готовили микропрепараты по стандартной методике: фиксировали, проводили в спиртах восходящей концентрации, заливали в парафин, готовили блоки, гистологические срезы (толщина срезов — 3–5 мкм) и помещали их на предметные стекла, осуществляли гистологическое окрашивание препаратов, просветление с покрытием покровным стеклом.

Статистический анализ результатов исследования. Для сравнения частоты встречаемости (инцидентность новообразований) в группах лабораторных животных применяли непараметрический точный критерий Фишера. Для расчета точного критерия Фишера (F-критерий) выполняли построение четырехпольной таблицы сопряженности (табл. 1), исходя из количества исследуемых групп и признаков.

 

Таблица 1. Четырехпольная таблица сопряженности для настоящего эксперимента

	Исход есть (наличие опухоли)	Исхода нет (отсутствие опухоли)	Всего
Медикаментозно измененный тиреоидный статус	a	b	a + b
Группа сравнения	c	d	c + d
Всего	a + c	b + d	a + b + c + d

 

Точный критерий Фишера рассчитывали по формуле

$p =\frac{(a + b)!·(c + d)!·(a + c)!·(b + d)!}{\left(a\right)!·\left(b\right)!·\left(c\right)!·\left(d\right)!·(a + b + c + d)!},$

где ! — символ факториала числа.

Различия считали статистически значимыми при p < 0,05, при этом сравнение проводили по группе МНМ-контроля и группе с минимальной инцидентностью опухолей толстой кишки. Рассчитывали также критерий χ² (с поправкой Йейтса). Процесс статистической обработки данных выполняли на персональном компьютере с помощью программ Excel, SPSS Statistics 21.0.0.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Инцидентность (частота возникновения) опухолей толстой кишки. Из табл. 2 следует, что частота возникновения химически индуцированных опухолей была максимальной в группе индуцированного L-тироксином гипертиреоза и минимальной в группе индуцированного пропилтиоурацилом (ПТУ) гипотиреоза и составила 70,0 и 27,3 % соответственно (p < 0,05, см. табл. 3). При индукции гипертиреоза в группе лабораторных животных, получавших Т₃, частота возникновения опухолей толстой кишки была меньше, чем при индукции гипертиреоза Т₄: 50,3 и 70,0 % соответственно.

 

Таблица 2. Частота развития опухолей толстой кишки у крыс, вызываемая N-метил-N-нитрозомочевиной, при медикаментозно измененном тиреоидном статусе

Группа	Название группы			n (n1)*	Частота, % (кол-во крыс с опухолями)**	Кол-во опухолей (кол-во аденокарцином)	Коэффициент множественности
I	МНМ	Группа сравнения		22 (21)	47,6 % (10)	13 (10)	0,62 ± 0,10
II	МНМ	Гипертиреоидная	Т3	22 (21)	53,4 % (11)	15 (11)	0,71 ± 0,11
III	МНМ	Гипертиреоидная	Т4	22 (20)	70,0 % (14)	23 (16)	1,15 ± 0,12
IV	МНМ	Гипотиреоидная		22 (22)	27,3 % (6)	10 (6)	0,45 ± 0,08
V	Контроль			11 (11)	0
Примечание. МНМ — N-метил-N-нитрозомочевина; n (n1) — количество лабораторных животных на начало (конец) эксперимента; * расчет инцидентности производили на количество лабораторных животных на конец (день предшествующий выводу из эксперимента) исследования; **понимается количество лабораторных животных, имеющих не менее одной аденокарциномы толстой кишки.

 

Таблица 3. Достоверность различий в группах с медикаментозно измененным тиреоидным статусом

Группа	Название группы	n1	Кол-во крыс с опухолями	Достоверность по отношению к IV группе (гипотиреоз)			Достоверность по отношению к I группе (МНМ-контроль)
				Точный критерий Фишера	χ2	χ2с поправкой Йейтса	Точный критерий Фишера	χ2	χ2с поправкой Йейтса
I	МНМ-контроль	21	10	0,215	1,90	1,13	1,0	0	0,95
II	МНМ + гипертиреоз (Т 3)	21	11	0,124	2,83	1,88	0,769	0,095	0
III	МНМ + гипертиреоз (Т 4)	20	14	0,012*	7,67*	6,05*	0,208	2,114	1,293
IV	МНМ + гипотиреоз (ПТУ)	22	6	1,0	0	0,115	0,215	1,904	1,132
Примечание: МНМ — N-метил-N-нитрозомочевина; ПТУ — пропилтиоурацил; * достоверность различий при p < 0,05.

 

Морфологические изменения опухолей толстой кишки. Рак толстой кишки во всех группах был представлен комплексами высокодифференцированной и умеренно дифференцированной аденокарциномы, доброкачественные новообразования — тубулярной аденомой толстой кишки. При этом отмечались общие особенности морфологического строения препаратов в зависимости от тиреоидного статуса. При гипертиреозе (II и III группы) выявлены гипертрофия слизистой оболочки толстой кишки (рис. 1), увеличение числа митозов с наличием апоптотических телец среди эпителия желез слизистой оболочки кишки (рис. 2), при этом в подслизистой основе превалировали явления склероза. Во всех отделах кишки лимфоидная инфильтрация была более выражена относительно нормы — от умеренной до выраженной (см. рис. 2). При гипотиреозе, напротив, наблюдалась гипотрофия слизистой оболочки толстой кишки (рис. 3), наряду с этим определялось увеличение числа фибробластов и фиброцитов непосредственно в толще слизистой оболочки. В подслизистой основе при длительно протекающем гипотиреозе превалировали явления склероза (рис. 4).

 

Рис. 1. Гипертрофия слизистой оболочки на фоне гипертиреоза. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. ×50

 

Рис. 2. Повышенная митотическая активность на фоне гипертиреоза. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. ×200

 

Рис. 3. Гипотрофия слизистой оболочки на фоне гипотиреоза. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. ×100

 

Рис. 4. Склероз подслизистой основы на фоне гипотиреоза. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. ×100

 

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

К настоящему времени накоплены данные о влиянии измененного тиреоидного статуса на течение опухолевого процесса в эксперименте [4, 8, 12, 14, 18, 19] (см. табл. 4), однако материалы о влиянии гипо- и гипертиреоза на канцерогенез толстой кишки отсутствовали, что и стало целью нашего исследования. К тому же колоректальный рак является одной из глобальных проблем всемирного здравоохранения, занимая третье-четвертое место в структуре заболеваемости и второе место по смертности от онкологических заболеваний по всему миру [17].

 

Таблица 4. Экспериментальные данные о влиянии измененного тиреоидного статуса на течение опухолевого процесса

Год публикации	Авторы	Опухолевая модель	Дизайн исследования	Способ индукции		Результаты
				гипотиреоза	гипертиреоза
1979	Kumar M.S. et al. [12]	Перевиваемая опухолевая линия (саркома, фибросаркома)	Гипертиреоз vs гипотиреоз vs контроль	Радиоактивный 131I	L-тироксин	Увеличение и снижение массы опухоли и метастатического индекса в группах гипер- и гипотиреоза соответственно
1981	Mishkin S.Y. et al. [14]	Перевиваемая опухолевая линия (гепатома Морриса)	Гипотиреоз vs контроль	ПТУ; радиоактивный131I; тиреоидэктомия	–	Снижение объема опухоли, количества метастазов в легком, увеличение выживаемости в группе гипотиреоза
1999	Theodossiou C. et al. [18]	Перевиваемая опухолевая линия (РПЖ, рак легкого)	Гипотиреоз vs контроль	ПТУ	–	Снижение интенсивности опухолевого роста в группе гипотиреоза
2013	Глушаков Р.И. и др. [4]	Инбредные мыши (самки) линии С3Н-А	Гипертиреоз vs гипотиреоз vs контроль	ПТУ	L-тироксин	Увеличение и снижение частоты возникновения РМЖ в группе гипер- и гипотиреоза соответственно, увеличение метастатического индекса в группе гипертиреоза
2015	Vermey M.L. et al. [19]	МНМ-индуцированный РМЖ	Гипертиреоз vs гипотиреоз vs контроль	Тиреоидэктомия	L-тироксин	Снижение частоты возникновения опухолей в группе гипотиреоза, увеличение опухолевой массы в группе гипертиреоза
2018	Glushakov R. et al. [8]	Перевиваемая опухолевая линия рака яичника	Гипертиреоз vs гипотиреоз vs контроль	ПТУ	L-тироксин	Трехкратное (достоверное) увеличение продолжительности жизни крыс с индуцированным гипотиреозом
Примечание. МНМ — N-метил-N-нитрозомочевина; ПТУ — пропилтиоурацил; РМЖ — рак молочной железы; РПЖ — рак предстательной железы.

 

В нашем экспериментальном наблюдении с учетом отсутствия данных о функциональном состоянии щитовидной железы у лабораторных животных в момент начала исследования воспроизводили модели фармакологической индукции гипер- и гипотиреоза с условно высокими дозами вводимых препаратов. В течение 3 дней достигали выраженного повышения и/или снижения концентрации тиреоидного гормона в периферических тканях [20]. Для индукции гипотиреоза из наиболее распространенных тиреостатиков выбрали ПТУ вследствие его фармакодинамических свойств (дополнительное ингибирование дейодиназы в периферических тканях) и высокого профиля безопасности (разрешен к применению в период беременности и лактации) [4]. Если снижение частоты возникновения опухолей толстой кишки при гипотиреозе (27,3 vs 47,6 % в МНМ-контроле) объясняется отсутствием активации негеномных рецепторов [2], то различия в частоте возникновения опухолей при индукции гипертиреоза Т₄ и Т₃ (70,0 vs 53,4 %) объясняются тем, что Т₄ является основным лигандом мембранного рецептора, в то время как Т₃ — основным лигандом ядерного рецептора тиреоидного гормона [6]. Морфологические изменения в тканях толстой кишки обусловлены системным действием избытка или дефицита йодотиронинов [4], которые активируют или, соответственно, ингибируют пролиферативную активность кишечного эпителия. Лимфоидная инфильтрация при гипертиреозе вызвана иммуномодулирующими эффектами тиреоидного гормона, которые заключаются в активации синтеза тканеспецифичных провоспалительных генов, что приводит к активации хемотаксиса и, соответственно, к лимфоидной инфильтрации [6]. Продемонстрированный фиброз подслизистой основы в гипертиреоидной группе, скорее всего, является следствием оксидативного стресса под действием избыточных концентраций тиреоидного гормона [13, 18, 20].

В настоящее время доступны эпидемиологические [16] и клинические [3] данные, свидетельствующие о том, что гипертиреоз, в том числе субклинический, в анамнезе или в момент обнаружения злокачественных новообразований является как прогностическим фактором риска возникновения новообразования, так и фактором, отягощающим течение опухолевого процесса — изменяющим «естественную историю развития опухоли». В проспективном исследовании с медианой наблюдения 9 лет установлено, что субклинический гипертиреоз в анамнезе достоверно повышает относительный риск развития злокачественных новообразований любой локализации в 1,34 раза (95 % ДИ 1,06–1,69), при этом рака легких — в 2,34 раза, рака предстательной железы — в 1,97 раза, колоректального рака — в 1,34 раза [10]. Терапия противоопухолевыми и/или иммунопрепаратами, например интерлейкином 2-го типа, интерферонами [5], ингибиторами тирозинкиназы [15] и ингибиторами контрольных точек иммунного ответа [9], достаточно часто приводит к снижению функции щитовидной железы — у 14–85 % пациентов, по данным разных авторов [5, 9, 15]. При этом во многих исследованиях продемонстрированы увеличение уровня объективных ответов и/или улучшение показателей суррогатных маркеров выживаемости (продолжительность безрецидивного периода, продолжительность времени до прогрессирования) у онкологических больных [15]. К настоящему времени опубликованы два сообщения об индукции медикаментозного гипотиреоза в лечении онкологических больных. A. Hercbergs et al. [11] и E. Linetsky et al. [13] представили данные, что гипотиреоз легкой степени, индуцированный ПТУ (600 мг в сутки), в сочетании со стандартным противоопухолевым лечением (темозоломид) приводит к достоверному (трехкратному) увеличению выживаемости пациентов с мультиформной глиобластомой по сравнению с больными, получающими стандартную терапию [11, 13].

Наше исследование на модели химически индуцированных опухолей толстой кишки подтверждает роль избыточных концентраций тиреоидного гормона в регуляции опухолевого роста. Если данные экспериментального исследования найдут свое подтверждение в клинической практике, пациенты с длительно протекающим гипертиреозом в анамнезе могут быть отнесены к группе повышенного онкологического риска, а изучение тиреоидного статуса у больных колоректальным раком перед началом лечения и/или в процессе противоопухолевой терапии может быть дополнительным прогностическим маркером выживаемости данной когорты пациентов.

Авторы заявляют об отсутствии возможных конфликтов интересов.

About the authors

Ruslan I. Glushakov

S.M. Kirov Military Medical Academy

Author for correspondence.
Email: glushakovruslan@gmail.com

Ph.D., Doctoral Student

Russian Federation, 6G, Akademika Lebedeva street, Saint-Petersburg, 194044

Pavel G. Tolkach

S.M. Kirov Military Medical Academy

Email: pusher6@yandex.ru

Ph.D., Assistant of Department of Toxicology and Medical Defenses

Russian Federation, 6G, Akademika Lebedeva street, Saint-Petersburg, 194044

Ruslan A. Kurbanov

Saint Petersburg State Pediatric Medical University, Ministry of Healthcare of Russian Federation

Email: pusher6@yandex.ru

Postgraduate Student of Department of Operative Surgery and Topographic Anatomy

Russian Federation, 2, Litovskay street, Saint-Peterburg, 194100

Alexander L. Semenov

N.N. Petrov National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Healthcare of Russian Federation

Email: genesem7@gmail.com

Research Fellow of Laboratory of Cancer Chemoprevention and Oncopharmacology

Russian Federation, 68, Leningradskaya street, Pesochny, St. Petersburg, 197758

Grigoriy A. Tchizh

Saint Petersburg State Pediatric Medical University, Ministry of Healthcare of Russian Federation

Email: ya.grisha234@yandex.ru

Student of Pediatric Faculty

Russian Federation, 2, Litovskay street, Saint-Peterburg, 194100

Vladimir L. Reynyuk

Institute of Toxicology of Federal Medical and Biological Agency

Email: vladton@mail.ru

Ph.D., M.D., Assistant Professor, Deputy Director for Research

Russian Federation, 1, Bekhtereva Ulitsa, Saint-Petersburg, 192019

Vadim A. Basharin

S.M. Kirov Military Medical Academy

Email: basharin1@mail.ru

Doctor of Medical Sciences, Professor, Head of the Department of Military Toxicology and Medical Protection

Russian Federation, 6G, Akademika Lebedeva street, Saint-Petersburg, 194044

Bogdan N. Kotiv

S.M. Kirov Military Medical Academy

Email: pusher6@yandex.ru

Ph.D., M.D., Professor, Deputy Director for Academic Affairs and Research

Russian Federation, 6G, Akademika Lebedeva street, Saint-Petersburg, 194044

References