Полный текст

АКТУАЛЬНОСТЬ

Флавоноиды представляют собой класс растительных полифенолов, которые поступают в рацион человека с овощами, фруктами и другими продуктами растительного происхождения. Хотя флавоноиды не являются необходимыми питательными веществами, они обладают широким спектром благоприятных биологических эффектов — нейро- и иммунотропных, антиоксидантных, противовоспалительных, эпигеном-модулирующих, — вовлеченных в механизмы коррекции при различных патологических процессах, включая нейродегенерацию, нейротоксичность и аффективные расстройства.

Алкоголизм в настоящее время — глобальная социальная, медицинская и экономическая проблема современного общества, затрагивающая до 4 % взрослого населения планеты и являющаяся одним из ведущих факторов риска преждевременной смерти и инвалидизации [1, 2]. Десятилетия исследований показали, что длительное воздействие этанола на организм негативно влияет на функции основных адаптационных систем организма. Так, в нервной системе алкоголь воздействует на функцию почти всех нейротрансмиттерных систем (ГАМК-, дофамин-, серотонин-, ацетилхолинергической, глутамата и эндоканнабиноидов), изменяя синтез, высвобождение и метаболизм отдельных нейромедиаторов и процесс их рецепции [3]. Кроме того, этанол влияет на различные гормоны, нейропептиды, факторы роста, ферменты, внутриклеточные сигнальные молекулы и факторы транскрипции [4]. Этанол при длительной алкоголизации опосредованно воздействует через Тoll-подобные рецепторы (TLR) на TLR7-сигнализацию, что способствует развитию процессов нейровоспаления и нейродегенерации. Показано также изменение уровня экспрессии микро-РНК miR-let7b, miR-96, miR-182, miR-155 и содержания мРНК амфотерина (HMGB1), TLR3, TLR4 в прилежащем ядре (nucleus accumbens) головного мозга у длительно алкоголизированных крыс [5]. Прием этанола увеличивает перекисное окисление липидов, уровень митохондриального окисленного глутатиона (GSSG), интерлейкина-1 β (IL-1β), фактора некроза опухоли-α (TNF-α) у экспериментальных животных в тканях гиппокампа. Этанол также приводит к снижению активности глутатиона (GSH), супероксиддисмутазы (SOD), глутатионпероксидазы (GPx) и глутатионредуктазы (GR), уровней фактора транскрипции CREB, мозгового нейротрофического фактора BDNF и регулятора апоптоза Bcl-2 [6]. Этанол изменяет активность нейронов, глиальных клеток и продукцию ими нейроиммунных регуляторных факторов [7]. В настоящее время вызванные этанолом поведенческие изменения, в частности, депрессивно-подобное поведение [8], ухудшение памяти [9], нейродегенеративные изменения — увеличение гибели нейронов и снижение нейропластичности (снижение нейрогенеза и уровня BDNF) преимущественно в гиппокампе, как и субклинические изменения в других структурах мозга [10, 11], связывают с нейровоспалительными процессами и оксидативным стрессом [12].

Вызванные этанолом изменения в функциях иммунной системы — еще один механизм, с помощью которого он изменяет физиологические процессы в организме [13]. Исследования in vivo и in vitro демонстрируют, что этанол модулирует функциональную активность клеток врожденного иммунитета, в частности, хроническое злоупотребление алкоголем вызывает подавление фагоцитоза и снижение продукции ряда ростовых факторов — фактора роста гепатоцитов (HGF), колониестимулирующего фактора роста гранулоцитов (G-CSF) и фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) — мононуклеарными клетками крови с повышением секреции этими клетками провоспалительных цитокинов посредством стимуляции TLR4, TLR7 и TLR8. Злоупотребление алкоголем также влияет на клеточно-опосредованный и гуморальный иммунитет, вызывая сокращение числа CD4⁺ и CD8⁺ субпопуляций лимфоцитов, изменяя конверсию фенотипа наивных Т-лимфоцитов и гомеостатическую пролиферацию, что приводит к росту числа Т-клеток памяти [14]. Следует отметить, что повышение содержания Т-клеток памяти связано с развитием хронических воспалительных и возраст-ассоциированных заболеваний, таких как остеопороз, болезнь Альцгеймера, аутоиммунные и онкологические заболевания, сердечно-сосудистая патология [13]. Уменьшение же пула наивных Т-клеток ассоциировано со снижением формирования эффективного иммунного ответа на инфекцию и вакцинацию [15], чему способствуют функциональные, транскриптомные и эпигеномные изменения в моноцитах и резидентных макрофагах, приводящие к усилению воспаления, но ослабляющие антимикробный ответ, а также снижающие уровни циркулирующих факторов, ответственных за рекрутирование иммунных клеток в очаг инфекции (хемокины CCL3/4, металлопротеазы MMP-9), но повышающие уровни цитокинов — IL-2, IL-7, IL-15, IL-12, TNF-α, хемокина, экспрессируемого и секретируемого Т-лимфоцитами (RANTES), и Т-клеточного хемоаттрактанта CXCL9 [14, 16].

Механизмы воздействия этанола на иммунную систему могут быть реализованы как непосредственно рецептор-опосредованным образом, изменяя функциональный фенотип иммунокомпетентных клеток [17], так и опосредованно — путем модуляции активности гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы, обеспечивая тем самым глюкокортикоид-опосредованное потенцирование компонентов врожденного иммунитета и подавление адаптивной иммунной системы через периферическую цитокин-индуцированную активацию блуждающего нерва [18]. Нарушение нейроиммунного взаимодействия при хронической интоксикации этанолом проявляется также в изменении баланса центральной и периферической продукции цитокинов, увеличении синтеза аутоантител к нейромедиаторам [19–21]. Тяжесть клинических проявлений, неопределенность прогноза, недостаточная эффективность существующих методов лечения определяют актуальность разработки новых стратегий терапии алкоголизма с воздействием на ключевые механизмы патогенеза данной патологии.

Растительные полифенольные соединения обладают способностью к регуляции различных физиологических процессов, в том числе защитных реакций организма, а также к коррекции патологических нарушений при широком спектре хронических заболеваний с нейроиммунными механизмами в патогенезе путем взаимодействия со специфическими рецепторами на поверхности клеток иммунной системы, а также нейронов и клеток микроглии, защищая клетки от окислительного стресса [22, 23]. Так, биофлавоноиды воздействуют на функции рецепторов различных цитокинов, рецепторов, связанных с G-белком (GРСR), а также на интегрины (трансмембранные переносчики белковых сигналов). Результатом инициированной биофлавоноидами рецептор-опосредованной передачи сигнала могут быть изменение адгезивных свойств и подвижности клеток, а также модуляция экспрессии генов, модуляция синтеза и продукции биологически активных веществ, пролиферация или апоптоз клеток [24]. Основные механизмы и пути влияния биофлавоноидов, опосредованные рецепторными системами клетки, схематично представлены на рис. 1.

 

Рис. 1. Пути рецептор-опосредованного влияния биофлавоноидов на функции клеток (по: Nelson J. Structure and function in cell signalling. John Wiley and Sons, Ltd., 2008). RTK (Receptor tyrosine kinase) — рецептор тирозинкиназы; GPCR (G-protein-coupled receptors) — рецептор, связывающий G-белки, выполняет функцию активаторов внутриклеточных путей передачи сигнала; JAK (Janus kinase) — Janus-киназа; STAT — член семейства транскрипционных факторов / переносчик сигналов и активатор транскрипции; PKB (Protein kinase В) — протеинкиназа В; IκB — ингибитор ядерного фактора транскрипции NF-κВ; PLC — протеинлипаза С (protein lipase С); PKC — протеинкиназа С (protein kinase C); PKA (Protein kinase A) — протеинкиназа А; GRB2 (Growth factor receptor-bound protein 2) — фактор роста; SOS1 — мембранный белок, участвующий в передаче сигналов клеточного роста и дифференцировки; Ras — мембраносвязанные белки семейства малых ГТФаз, участвующие в передаче сигнала; Raf — протоонкоген; MAPK и MAP2K (Mitogen-activated protein kinase) — митоген-активируемые протеинкиназы; SHC1 (SHC-transforming protein 1) — SHC-трансформирующий белок 1, играет важную роль в регуляции апоптоза и лекарственной устойчивости в клетках

Fig. 1. Pathways of receptor-mediated effects of bioflavonoids on cell functions (according to Nelson J. Structure and function in cell signalling. John Wiley and Sons, Ltd., 2008). RTK — Receptor tyrosine kinase; GPCR — G-protein-coupled receptors; JAK — Janus kinase; STAT — is a member of the transcription factor/signal transducer and activator of transcription family; PKB — Protein kinase В; IκB — nuclear transcription NF-κВ factor inhibitor; PLC — protein lipase С; PKC — protein kinase C; PKA — Protein kinase A; GRB2 — Growth factor receptor-bound protein 2); SOS1 — membrane protein involved in signaling cell growth and differentiation; Ras — a membrane-bound protein of the small GTPases family involved in signal transduction; Raf — proto-oncogene; MAPK и MAP2K — Mitogen-activated protein kinase; SHC1 — SHC-transforming protein 1

 

Противовоспалительные, антиоксидантные, нейрорегенеративные, иммуномодулирующие свойства биофлавоноидов, а также их способность влиять на эпигенетические механизмы регуляции экспрессии генов и проникать через гематоэнцефалический барьер, оказывая прямое модулирующее влияние на клетки головного мозга, которые были подробно описаны ранее [24], позволяют рассматривать данные вещества в качестве адъювантов в терапии алкоголизма. Нами также были показаны позитивные эффекты куркумина при экспериментальном алкоголизме, выражающиеся в стимуляции ориентировочно-исследовательского поведения, пролиферативной активности лимфоцитов и клеточного иммунного ответа [25–27].

В рамках договора о научно-техническом сотрудничестве между ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии» (Новосибирск, Россия) и ООО «Доктор Корнилов» (Барнаул, Россия) на основе куркумина была разработана инновационная композиции биофлавоноидов (ИКБ), обладающая лечебно-профилактическими свойствами в отношении возраст-ассоциированных заболеваний (Патент на изобретение RU 2654868С1) [28].

Цель настоящего исследования — учитывая мультимодальные эффекты биофлавоноидов, оценить нейротропное и иммуномодулирующее действие ИКБ на основе куркумина при длительном употреблении этанола.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследованиях использовали ИКБ, включающую в качестве составляющих: экстракт корня куркумы — 37,2 % (содержание куркумина не менее 95 %), экстракт черного перца — 0,2 % (содержание пиперина не менее 95 %), экстракт бобов сои — 20 % (содержание изофлавонов не менее 40 %), экстракт листьев зеленого чая — 20 % (содержание катехинов не менее 40 %), экстракт красного корня — 5 % (содержание катехинов и сапонинов не менее 25 %), экстракт корня солодки — 2 % (содержание глицирризиновой кислоты не менее 40 %), экстракт листьев облепихи — 15,6 % [28].

Определение содержания биофлавоноидов в композиции

Содержание биоактивных веществ в ИКБ измеряли в водно-органических экстрактах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе «Миллихром Ф-02» с колонкой ProntoSil-120–5-C18 AQ и с использованием соответствующих элюентов, в качестве стандартов использовали растворы соответствующих веществ аналитической чистоты.

Определение содержания куркумина: дистиллированную воду доводили фосфорной кислотой до pH 3,5, добавляли сухую субстанцию, метанол до концентрации 50 % и проводили экстракцию при температуре 25 °C при перемешивании в течение 2 ч. Затем пробы фильтровали через стеклянный фильтр и разводили водной фосфорной кислотой в соотношении 1 : 4, анализировали в градиенте ацетонитрил – водная фосфорная кислота при pH 3,5 с градиентом метанола от 10 до 90 %, скоростью потока 100 мкл/мин, максимальным давлением 1,8 МПа, температурой в колонке 30 °C. Детекцию проводили при длине волны 425 нм [29]. Экстракция пиперина: метанолом при температуре 25 °C при перемешивании в течение 4 ч, пробы фильтровали через стеклянный фильтр, разводили дистиллированой водой в соотношении 1 : 9 и анализировали в градиенте метанол – вода с градиентом метанола от 10 до 90 %, скоростью потока 100 мкл/мин, максимальным давлением 1,8 МПа, температурой в колонке 25 °C; детекцию проводили при длине волны 343 нм [29]. Экстракция изофлавоноидов сои: использовали водно-метанольную смесь при температуре 25 °C и перемешивании в течение 24 ч, пробы фильтровали через стеклянный фильтр и анализировали в градиенте метанол – вода с градиентом метанола от 10 до 90 %, скоростью потока 100 мкл/мин, максимальном давлении 1,8 МПа, температурой в колонке 25 °C; детекцию проводили при длине волны 256 нм [30]. Экстракция эпигаллокатехина зеленого чая: дистиллированной водой при температуре 80 °C с обратным холодильником при перемешивании в течение 2 ч, пробы фильтровали через стеклянный фильтр и анализировали в градиенте ацетонитрил – вода с градиентом ацетонитрила от 10 до 90 %, скоростью потока 100 мкл/мин, максимальным давлением 1,8 МПа, температурой в колонке 40 °C; детекцию проводили при длине волны 235 нм [31]. Экстракция тритерпеновых сапонинов красного корня: дистиллированную воду доводили фосфорной кислотой до pH 3,5, прибавляли сухую субстанцию, хлороформ и выдерживали на ультразвуковой бане в течение 30 мин, охлаждали полученный раствор до 25 °C, фильтровали через стеклянный фильтр, осадок переносили в колбу со шлифом, замеряя его количество, добавляли метанол и проводили экстракцию при температуре 80 °C с обратным холодильником при перемешивании в течение 2 ч, пробы фильтровали через стеклянный фильтр и разводили дистиллированной водой в соотношении 1 : 9, анализировали в градиенте метанол – водная фосфорная кислота pH 3,5 с градиентом метанола от 10 до 90 %, со скоростью потока 100 мкл/мин, максимальным давлением 1,8 МПа, температурой в колонке 30 °C; детекцию проводили при длине волны 210 нм [32]. Содержание каротинов листьев облепихи определяли по методу И.К. Мурри с экстракцией ацетоном и последующей хроматографией на колонке с окисью алюминия [31].

Экспериментальные животные

Исследования проводили на мышах-самцах (CBA×C57BL/6)F1 10-месячного возраста, полученных в возрасте 3 мес. из питомника научно-исследовательской лаборатории экспериментальной медицины (Томск). Животные содержались в условиях лабораторного вивария, в клетках по 10 особей, на стандартном рационе питания, при естественном световом режиме. Все манипуляции выполнялись в первой половине суток.

Учитывая наличие в популяции мышей (CBA×C57Bl/6)F1 особей с активным и пассивным типами поведения, различающимися по уровню потребления этанола [33, 34], с целью формирования однородных экспериментальных групп животных мыши были предварительно протестированы в тесте «открытое поле», и в исследование были включены только особи со средним уровнем ориентировочно-исследовательского поведения (ОИП). Параметры ОИП определяли в тесте «открытое поле», как было описано нами ранее [25, 33].

Моделирование хронической алкогольной интоксикации

Для создания модели хронической алкогольной интоксикации использовали метод принудительного спаивания, при котором мыши были вынуждены употреблять 10 % раствор этанола (ОАО «Кемеровская фармацевтическая фабрика», Россия) в качестве единственного источника жидкости на протяжении 6 мес. Формирование зависимости от этанола оценивалось путем однократной инъекции налоксона (3 мг/кг, подкожно) с последующей визуальной регистрацией признаков «синдрома отмены» (судороги, скрежет зубами, отряхивания «мокрой собаки», птоз, диарея). На следующем этапе длительно алкоголизированные мыши были разделены на 3 группы — контрольную 1 (n = 30), представители которой продолжали принимать в течение 30 дней 10 % раствор этанола, контрольную 2 (n = 30), мышам которой через зонд вводили куркумин (Sigma-Aldrich, США) из расчета 2 мг/мышь в 0,5 мл раствора 10 % этанола на фоне продолжающегося свободного доступа к 10 % раствору этанола в качестве единственного источника жидкости в течение 30 дней, и экспериментальную (n = 30), мышам которой через зонд вводили ИКБ из расчета 2 мг/мышь в 0,5 мл раствора 10 % этанола на фоне продолжающегося свободного доступа к 10 % раствору этанола в качестве единственного источника жидкости в течение 30 дней. Четвертую группу сравнения составляли интактные мыши соответствующего возраста, которые в течение всего экспериментального периода, включающего формирование алкогольной зависимости и введение ИКБ, находились в аналогичных условиях вивария. По окончании этого периода оценивали выраженность алкогольной мотивации, параметры ОИП, содержание цитокинов в структурах головного мозга, интенсивность гуморального и клеточного иммунного ответа. По окончании экспериментов животных декапитировали под эфирным наркозом.

Исследование алкогольной мотивации

Алкогольную мотивацию животных контрольной и экспериментальной групп оценивали по потреблению 10 % раствора этанола в условиях свободного выбора с водой. Для этого в каждой клетке находились две поилки (с водой и 10 % раствором этанола), чтобы мыши могли потреблять жидкости в зависимости от индивидуальной потребности (двухбутылочный оральный тест). Количественное потребление 10 % раствора этанола и воды мышами контрольных и экспериментальной групп (мл/день×мышь) регистрировалось ежедневно в 10 ч утра в течение 10 дней, начиная с первого дня после окончания введения ИКБ.

Исследование содержания цитокинов

Количественное содержание цитокинов в структурах головного мозга определяли в лизатах образцов отдельных структур (гиппокамп, гипоталамус, стриатум, фронтальная кора) методом иммунноферментного анализа (англ. ELISA — enzyme-linked immunosorbent assay). Лизаты структур мозга получали путем гомогенизирования тканей в среде RPMI-1640 с добавлением 0,1 % Triton X-100 (GERBU Biotechnik GmbH, Германия), с последующим центрифугированием в течение 3 мин при 10 000 об/мин. Надосадочную жидкость использовали для исследования. Содержание цитокинов в образцах оценивали с использованием тест-систем eBioscience (BenderMed Systems, Австрия) для определения IFN-γ, IL-6 и R&D Systems Inc. (США) для определения IL-1β, IL-10, TNF-α в соответствии с инструкцией производителей. Оптическую плотность образцов измеряли при помощи спектрофотометра с вертикальным прохождением света Anthos 2020 (Anthos Labtec Instruments GmbH, Австрия) при длине волны 450 нм. Результаты представляли в виде массовой концентрации (пг) на мг ткани.

Исследование иммунного ответа

Выраженность гуморального иммунного ответа определяли на основании подсчета количества антителообразующих клеток (АОК) селезенки, модифицированным методом A.J. Cunningham на 5-е сутки после внутрибрюшинной иммунизации Т-зависимым антигеном (эритроцитами барана, ЭБ) по количеству локальных зон гемолиза в полужидкой среде. Для этого селезенку измельчали, суспензию клеток фильтровали и доводили конечный объем до 5 мл. Равные объемы клеточной суспензии, 10 % суспензии ЭБ и раствора комплемента смешивали и заливали в стеклянные камеры, которые инкубировали в течение 45 мин при 37 °C. Затем подсчитывали количество локальных зон гемолиза под бинокулярной лупой. Учитывали число зон гемолиза в камере, количество ядросодержащих клеток в 1 мл клеточной суспензии, объем заполненной камеры и клеточность селезенки. Оценивали относительное (на 10⁶ ядросодержащих клеток селезенки) количество АОК. Интенсивность клеточного иммунного ответа оценивали по уровню формируемой реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) в ответ на введение Т-зависимого антигена — ЭБ. Для этого мышей иммунизировали внутрибрюшинным введением ЭБ (0,5 % ЭБ 0,5 мл). Разрешающую дозу антигена (50 % ЭБ 0,05 мл) вводили под апоневроз стопы задней конечности через 96 ч после иммунизации. Формирование реакции ГЗТ оценивали через 24 ч после разрешающей инъекции антигена, по степени изменения толщины задней лапы по сравнению с позитивно-контрольной задней лапой того же животного, в которую была введена среда RPMI-1640. Индекс реакции (ИР) определяли для каждой мыши по формуле ИР = (Р_о – Р_к) / Р_к и выражали в процентах [35].

Для статистической обработки результатов использовали коммерческий пакет программ Statistica 10.0 (SatSoft, США). Результаты представляли в виде медианы и интервала между 1-м и 3-м квартилем — Ме [Q₁; Q₃]. При проведении сравнений независимых выборок, при числе групп равной 2, применяли критерий Манна–Уитни. Для сравнения показателей при числе групп >2 использовали критерий Краскела–Уоллиса. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в исследовании принимали p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В результате исследования ИКБ было определено содержание биофлавоноидов, которое составило: куркумин — 13,6 ± 0,3 мг/г, пиперин — 7,2 ± 0,1 мг/г, изофлавоноиды сои — 15,5 ± 0,4 мг/г, эпигаллокатехин-3-галлат — 72,7 ± 0,8 мг/г, тритерпеновые сапонины — 8,8 ± 0,1 мг/г, β-каротин — 0,4 ± 0,02 мг/г.

При оценке алкогольной мотивации длительно алкоголизированных животных после курсового введения ИКБ было выявлено более низкое среднесуточное потребление 10 % этанола животными экспериментальной группы, по сравнению с контрольной группой длительно алкоголизированных мышей: 4,9 [4, 5; 5, 1] мл/(день×мышь) в контрольной группе и 1,9 [1, 7; 2, 2] мл/(день×мышь) в экспериментальной, p = 0,038, U-критерий Манна–Уитни. При этом потребление мышами воды в условиях свободного выбора после приема ИКБ было значительно выше и составило 3,2 [2, 9; 3, 5] мл/(день×мышь) по сравнению с таковым в указанной контрольной группе — 0,4 [0, 0; 0, 4], p = 0,028, U-критерий Манна–Уитни.

При исследовании ОИП в тесте «открытое поле» была обнаружена стимуляция поведенческой активности у животных, которым вводили ИКБ, выражающаяся в повышении показателей моторного компонента поведения (горизонтальная двигательная активность: экспериментальная группа — 75,2 [73, 1; 77, 8] периферическая, 2,4 [2, 1; 2, 7] центральная, 77,8 [75, 0; 79, 4] суммарная; контрольная группа длительно алкоголизированных мышей — 46,8 [45, 1; 47, 9] периферическая, p = 0,017, U-критерий Манна–Уитни, 1,3 [1, 2; 1, 5] центральная, p = 0,024, U-критерий Манна–Уитни, 48,9 [46, 5; 49, 7] суммарная, p = 0,014, U-критерий Манна–Уитни) и исследовательского компонента поведения (вертикальная двигательная активность: экспериментальная группа — 0,0 [0, 0; 0, 1] свободная, 4,5 [4, 3; 4, 7] с опорой на стенку, 4,4 [4, 3; 4, 7] суммарная; контрольная группа длительно алкоголизированных мышей — 0,0 [0, 0; 0, 1] свободная, p = 0,012, U-критерий Манна–Уитни, 2,3 [2, 1; 2, 4] с опорой на стенку, p = 0,026, U-критерий Манна–Уитни, 2,3 [2, 1; 2, 4] суммарная, p = 0,024, U-критерий Манна–Уитни). Под действием куркумина менялись показатели двигательной активности (горизонтальная: экспериментальная группа — 64,3 [47, 2; 67, 8] периферическая, p = 0,051, U-критерий Манна–Уитни, 2,1 [1, 8; 2, 3] центральная, p = 0,062, U-критерий Манна–Уитни, 67,3 [45, 9; 69, 1] суммарная, p = 0,059, U-критерий Манна–Уитни, по сравнению с показателями животных, которым вводили ИКБ); и исследовательского компонента поведения (вертикальная двигательная активность: экспериментальная группа — 0,0 [0, 0; 0, 2] свободная, p = 1,0, U-критерий Манна–Уитни, 4,0 [3, 3; 4, 5] с опорой на стенку, p = 0,069, U-критерий Манна–Уитни, 4,4 [4, 3; 4, 7] суммарная, p = 0,084, U-критерий Манна–Уитни).

Нейровоспаление, характерное для хронического алкоголизма, обусловлено как прямым взаимодействием этанола с нейрональными и иммунными клетками мозга, так и с индукцией воспаления на периферии. Известно, что хроническое воздействие этанола приводит к усиленной продукции провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-6, IL-12, TNF-α, IFN-γ и обусловленному нейровоспалением повышению проницаемости гематоэнцефалического барьера [36].

При исследовании влияния ИКБ на количественное содержание ряда патогенетически значимых для хронического алкоголизма цитокинов в структурах головного мозга у длительно алкоголизированных мышей было зарегистрировано снижение уровней IL-1β, IL-6, IFN-γ, TNF-α в префронтальной коре, гипоталамусе, гиппокампе и стриатуме, наряду с повышением содержания IL-10 в гипоталамусе и гиппокампе (см. таблицу).

 

Таблица. Содержание цитокинов в структурах головного мозга длительно алкоголизированных мышей-самцов (СBA×C57Bl/6)F1 после курсового внутрижелудочного введения инновационной композиции биофлавоноидов, Mе [Q1; Q3] Table. Cytokine content in the brain structures of chronically alcoholized male mice (CBA×C57Bl/6)F1 after a course of intragastric administration of the novel bioflavonoid composition, Mе [Q1; Q3]
Группа животных	Содержание цитокинов, пг/мл ткани
	префронтальная кора	гипоталамус	гиппокамп	стриатум
IL-1β
Контрольная	165,2 [151, 8; 179, 3]	180,2 [172, 1; 192, 5]	206,1 [196, 0; 224, 3]	124,9 [114, 7; 135, 0]
Экспериментальная	82,3 [77, 1; 89, 2]*, p = 0,001	183,0 [172, 7; 193, 1], p = 0,074	205,5 [195, 3; 215, 6], p = 0,082	83,6 [73, 4; 93, 7]*, p = 0,001
IL-6
Контрольная (n = 30)	230,9 [215, 8; 266, 1]	172,0 [157, 2; 179, 1]	308,2 [298, 0; 319, 4]	325,9 [315, 7; 346, 0]
Экспериментальная (n = 30)	235,4 [215, 3; 255, 7], p = 0,057	153,3 [144, 0; 163, 4], p = 0,055	214,0 [193, 8; 227, 2]*, p = 0,001	326,0 [315, 9; 346, 1], p = 0,234
IL-10
Контрольная (n = 30)	176,1 [132, 9; 193, 3]	128,7 [101, 4; 152, 5]	352,6 [324, 5; 373, 4]	249,5 [229, 2; 259, 8]
Экспериментальная (n = 30)	173,6 [131, 3; 181, 9], p = 0,095	236,4 [226, 2; 248, 7]*, p = 0,001	413,9 [404, 5; 428, 1]*, p = 0,002	230,8 [223, 3; 250, 9], p = 0,120
IFN-γ
Контрольная (n = 30)	49,3 [44, 0; 54, 9]	93,9 [81, 2; 99, 3]	105,1 [94, 7; 124, 2]	47,5 [34, 9; 55, 4]
Экспериментальная (n = 30)	28,0 [27, 7; 34, 1]*, p = 0,030	97,8 [83, 4; 97, 9], p = 1,000	64,5 [53, 3; 72, 8]*, p = 0,030	54,9 [44, 6; 63, 3], p = 0,098
TNF-α
Контрольная (n = 30)	241,5 [231, 2; 252, 8]	238,8 [218, 5; 249, 0]	247,1 [236, 8; 257, 4]	150,9 [142, 4; 163, 1]
Экспериментальная (n = 30)	184,8 [171, 6; 195, 0]*, p = 0,040	230,1 [219, 8; 240, 3], p = 0,20	248,5 [228, 2; 258, 8], p = 0,450	153,0 [132, 7; 165, 1], p = 0,150
*Достоверные различия (p < 0,05) между соответствующими показателями в образцах контрольной группы (длительно алкоголизированные мыши) и экспериментальной группы (длительно алкоголизированные мыши, получавшие инновационную композицию биофлавоноидов). *Significant difference (p < 0.05) between the corresponding parameters in the samples from the control group (chronically alcoholized mice) and the experimental group (chronically alcoholized mice that received the novel bioflavonoid composition).

 

Как видно из данных таблицы, наиболее выраженные изменения содержания провоспалительных цитокинов выявлены в гиппокампе. Учитывая, что потребление этанола вызывает продолжительную активацию микроглии преимущественно в гиппокампе, опосредованную TLR [37], можно предположить влияние ИКБ на активность микроглии, которой отводится роль источника нейровоспалительных сигналов, что и выражается в снижении нейровоспаления. Исследования с использованием животных моделей показали, что нейровоспаление способствует поддержанию алкогольной зависимости [36, 38]. Провоспалительные цитокины являются также триггерами депрессивно-подобного поведения при алкоголизме. Выявленное в настоящем исследовании снижение провоспалительных цитокинов в патогенетически значимых для алкоголизма структурах головного мозга, указывающее на снижение нейровоспаления, может быть также одним из механизмов продемонстрированных выше позитивных эффектов ИКБ на алкогольную мотивацию и двигательную активность длительно алкоголизированных мышей.

Результаты недавних исследований показывают, что потребление флавоноидов с пищей оказывает нейрорегуляторное действие посредством множества прямых (локальных) и непрямых (системных) механизмов, схематично представленных на рис. 2. Флавоноиды способны проникать через гематоэнцефалический барьер и кумулироваться в центральной нервной системе, противодействуя накоплению активных форм кислорода, способствуя выживанию и пролиферации нейронов путем ингибирования нейровоспалительных и окислительных стрессовых реакций. Более того, микробиота кишечника также участвует в регуляции функции мозга и поведения посредством выработки биоактивных метаболитов. Флавоноиды могут формировать состав микробиоты кишечника, действуя в качестве углеродных субстратов, способствуя росту пробиотической флоры, которую вырабатывают нейропротекторные метаболиты. Влияя на ось микробиота–кишечник–мозг, флавоноиды опосредованно воздействуют на функционирование мозга.

 

Рис. 2. Нейрорегуляторное действие флавоноидов (по: Wang H. и соавт., 2023 [39]). Direct effect — прямое действие; Indirect effect — непрямое действие; BBB (Blood-brain barrier) — гематоэнцефалический барьер; Nrf2 (Nuclear erythroid 2-related factor 2) — ядерный эритроидный фактор 2; NF-κB (nuclear transcription factor κB) — ядерный фактор транскрипции κB; Trkb (Tropomyosin receptor kinase B) — тропомиозиновый тирозинкиназный рецептор; ROS (Reactive oxygen species) — активные формы кислорода; ES cell (human embryonic stem cells) — эмбриональные (стволовые) клетки человека; SCFAs (Short-chain fatty acids) — короткоцепочечные жирные кислоты; Microglia cells — клетки микроглии; Neuron — нейрон; Percyte — периэндотелиальные клетки; Lumen of blood vessal — просвет кровеносного сосуда; Basement membrane — базальная мембрана; Astrocyte — астроцит; Regulating intestinal Flora — регулирующая флора кишечника; Neurotrophic factors — нейротрофные факторы; Neurotransmitters — нейротрансмиттеры

Fig. 2. The neuroregulatory effects of flavonoids (according to Wang H. et al. [39]). BBB — Blood-brain barrier; Nrf2 — Nuclear erythroid 2-related factor 2; NF-κB — nuclear transcription factor κB; Trkb — Tropomyosin receptor kinase B; ROS — Reactive oxygen species; ES cell — human embryonic stem cells; SCFAs — Short-chain fatty acids

 

Как указывалось выше, иммунная система играет существенную роль в развитии и поддержании алкогольной зависимости. Поэтому в мире растет интерес к разработке методов иммунотерапии алкоголизма. Мы исследовали эффекты курсового введения ИКБ на основные звенья иммунного ответа у длительно алкоголизированных мышей. Было установлено, что уровень развития реакции ГЗТ был значительно снижен в группе длительно алкоголизированных мышей (контрольная группа 1), что соответствует литературным данным об иммуносупрессии, индуцируемой хроническим воздействием этанола [40]. После введения ИКБ уровень ГЗТ у длительно алкоголизированных мышей был близок к таковому в группе интактных и превышал данный показатель в группе длительно алкоголизированных животных, которым вводили только куркумин (контрольная группа 2; рис. 3), что свидетельствует о стимуляции ИКБ клеточного иммунного ответа.

 

Рис. 3. Выраженность реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) у длительно алкоголизированных мышей (СBA×C57Bl/6)F1 после курсового внутрижелудочного введения инновационной композиции биофлавоноидов. n = 30 — в каждой группе; ^#p = 0,002 между показателями у интактных животных и в контрольной группе 1 (алкоголизированные животные); *p = 0,061 между показателями в контрольной группе 1 (алкоголизированные животные) и контрольной группе 2 (алкоголизированные животные, получавшие куркумин); ^p = 0,011 между показателями в контрольной группе 2 (алкоголизированные животные, получавшие куркумин) и экспериментальной группе (алкоголизированные животные, получавшие инновационную композицию биофлавоноидов); **p = 0,054 между показателями в контрольной группе 2 (алкоголизированные животные) и экспериментальной группе (алкоголизированные животные, получавшие инновационную композицию биофлавоноидов)

Fig. 3. The severity of a delayed-type hypersensitivity (DTH) response in chronically alcoholized mice (CBA×C57Bl/6)F1 after a course of intragastric administration of the novel bioflavonoid composition. n = 30 in each group; ^#p = 0.002 between the values in intact animals and in the control group 1 (alcoholized animals); *p = 0.061 between the values in the control group 1 (alcoholized animals) and the control group 2 (alcoholized animals receiving curcumin); ^p = 0.011 between the values in the control group 2 (alcoholized animals receiving curcumin) and the experimental group (alcoholized animals receiving the novel bioflavonoid composition); **p = 0.054 between the parameters in the control group 2 (alcoholized animals) and the experimental group (alcoholized animals receiving the novel bioflavonoid composition)

 

После приема ИКБ наблюдалась также существенная стимуляция гуморального иммунного ответа, оцененная по относительному числу АОК селезенки, которое, как и ожидалось, было значительно сниженным в контрольной группе 1 (длительно алкоголизированные животные). Причем интенсивность гуморального иммунного ответа под влиянием ИКБ также превышала таковую при введении куркумина (контрольная группа 2), что свидетельствует о синергизме действия биофлавоноидов в ИКБ (рис. 4).

 

Рис. 4. Количество антителообразующих клеток селезенки (АОК) алкоголизированных мышей (CBA×C57Bl/6)F1 после курсового внутрижелудочного введения инновационной композиции биофлавоноидов. n = 30 — в каждой группе; ^#p = 0,003 между показателями у интактных животных и в контрольной группе 1 (алкоголизированные животные); *p = 0,041 между показателями в контрольной группе 1 (алкоголизированные животные) и контрольной группе 2 (алкоголизированные животные, получавшие куркумин); ^p = 0,047 между показателями в контрольной группе 2 (алкоголизированные животные, получавшие куркумин) и экспериментальной группе (алкоголизированные животные, получавшие инновационную композицию биофлавоноидов); **p = 0,0006 между показателями в контрольной группе 1 (алкоголизированные животные) и экспериментальной группе (алкоголизированные животные, получавшие инновационную композицию биофлавоноидов)

Fig. 4. Splenic antibody-forming cells (SAFC) count in alcoholized mice (CBA×C57Bl/6)F1 after a course of intragastric administration of the novel bioflavonoid composition. n = 30 in each group; ^#p = 0.003 between the values in intact animals and in the control group 1 (alcoholized animals); *p = 0.041 between the values in the control group 1 (alcoholized animals) and the control group 2 (alcoholized animals receiving curcumin); ^p = 0.047 between the values in the control group 2 (alcoholized animals receiving curcumin) and the experimental group (alcoholized animals receiving the novel bioflavonoid composition); **p = 0.0006 between the parameters in the control group 1 (alcoholized animals) and the experimental group (alcoholized animals receiving the novel bioflavonoid composition)

 

Полученные результаты позволяют обоснованно заявлять о наличии у ИКБ иммуностимулирующих свойств.

В состав ИКБ, использованной в экспериментах, были включены биофлавоноиды, обладающие широким спектром биологической активности. Так, куркума, получаемая из корневищ растения порядка имбирных Curcuma longa L., рассматривается как одна из наиболее активных специй благодаря высокому содержанию гидрофобных полифенолов семейства куркуминоидов [41]. Куркумин — 1,7-бис(4-гидрокси-3-метоксифенил)-гепта-1,6-диен-3,5-дион — считается одним из наиболее активных компонентов этой группы соединений [42, 43]. Способность куркумина взаимодействовать с различными белками и модулировать функции сигнальной трансдукции связана с влиянием на многие острые и хронические патологические процессы. Исследования показали, что куркумин модулирует целый ряд молекул в пути передачи клеточного сигнала, включая PI3K, Akt, mTOR, ERK5, AP-1, TGF-β, Wnt, β-катенин, Shh, PAK1, Rac1, STAT3, PPARγ, EBPα, инфламмасома NLRP3, p38MAPK, Nrf2, Notch-1, AMPK, TLR-4 и MyD-88. Было показано, что куркумин также ингибирует пролиферацию клеток Th17 и снижает выработку воспалительных цитокинов, включая IL-1β, TNF-α, IL-22 и IL-17, что в свою очередь снижает выраженность системного воспаления [43, 44]. Нейропротекторные свойства куркумина реализуются посредством нескольких механизмов. Куркумин способен нейтрализовать свободные радикалы и усиливать активность антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутаза — SOD, каталаза — CAT, глутатионпероксидаза — GPx), защищая нейроны от окислительного стресса. Куркумин оказывает противовоспалительное действие, ингибируя маркеры воспаления — TNF-α, IL-1β и IL-6, тем самым снижая выраженность воспалительной реакции в ткани мозга [45]. Кроме того, данный биофлавоноид подавляет активность провоспалительных ферментов (ЦОГ-2 и iNOS), что приводит к снижению уровня простагландинов и оксида азота, модулирует сигнальные пути NF-κB, ключевого фактора транскрипции, участвующего в регуляции воспалительных реакций, наряду с Wnt5 (член семейства Wnt5A) и JNK1 (N-концевые киназы c-Jun), которые имеют решающее значение для нейрональной активности, выживания клеток, воспаления и апоптоза [46].

Эффективность куркумина была продемонстрирована при нейродегенеративных заболеваниях нервной системы [47–49], депрессии. Согласно многочисленным доклиническим исследованиям, куркумин оказывает антидепрессивное действие в моделях на животных, причем эффекты напоминают эффекты антидепрессантов, таких как флуоксетин и имипрамин [50, 51]. Другой антидепрессантный механизм действия куркумина связан с ингибированием транскрипционных сигнальных путей ядерных факторов, снижая нейровоспаление [52]. Кроме того, куркумин повышает уровень нейротрофического фактора головного мозга (BDNF), сниженный при депрессии [53]. Результаты метаанализа на людях, страдающих депрессией, также показали, что куркумин снижает выраженность симптомов депрессии и тревоги [54], что открывает возможность его использования при лечении депрессивных расстройств.

Эффективность куркумина была выявлена и при алкоголизме. Предполагается, что куркумин действует как нейропротектор при злоупотреблении алкоголем за счет активации сигнального пути CREB–BDNF [6]. Кроме того, у мышей с этанол-индуцированным повреждением тканей пероральное введение куркумина снижало выраженность окислительного стресса и защищало слизистую оболочку желудка [55]. Как указывалось выше, ранее нами также были показаны эффекты куркумина на поведенческие и иммунологические показатели при экспериментальном алкоголизме.

Среди методов повышения биодоступности куркумина свою эффективность продемонстрировало сочетание его с пиперином [43]. Как показано в настоящем исследовании, в составе ИКБ кроме куркумина также присутствует пиперин, который повышает биодоступность куркумина, ингибируя его глюкуронирование и увеличивая транспортирование в плазму; пиперин обладает также антиоксидантными, антитоксическими и антиканцерогенными свойствами [24, 43]. Изофлавоноидам сои, присутствующим в ИКБ, присущи высокая антиоксидантная активность и противовоспалительные свойства (снижение уровня IL-18) [24, 56]. Эпигаллокатехин-3-галлат, флавоноид зеленого чая, обладает способностью нейтрализации повреждающего действия высоких концентраций цитокинов, возникающих в процессе воспаления, а в присутствии IL-1β он ингибирует MAPKs, деградацию IRAK-1 и снижает активность эффекторов NF-κB, p38 и JNK, которые играют ключевую роль в транскрипции генов воспалительного ответа в клетках [57]. Сапонины, сложные органические соединения гликозидов растительного происхождения с поверхностно-активными свойствами, присутствуют в корневищах красного корня. Химические свойства сапонинов обусловлены структурой агликона, наличием отдельных функциональных групп, а также присутствием гликозидной связи. Сапонины различных растений также повышают биодоступность куркумина, обладая при этом нейротрофным, гипотензивным, гипохолестеринемическим, диуретическим, адаптогенным и седативным свойствами [58]. β-Каротин — наиболее распространенный каротиноид группы терпеноидов, мощный антиоксидант, обладает также иммуностимулирующими и адаптогенными свойствами [59].

Таким образом, в настоящем исследовании установлено, что в ИКБ сочетанием куркумина с указанными биофлавоноидами в фармакологически значимых концентрациях достигается синергизм их эффектов, приводящий к значительному снижению выраженности нейро- и иммунотоксических последствий длительного употребления этанола, что позволяет рассматривать перспективность применения данной композиции в качестве иммуномодулирующего и нейротропного средства в комплексной терапии хронического алкоголизма.

ВЫВОДЫ

1. Изученная в настоящем исследовании инновационная композиция биофлавоноидов содержит комплекс биологически активных компонентов — куркумин, пиперин, изофлавоноиды сои, эпигаллокатехин-3-галлат, тритерпеновые сапонины и β-каротин — в фармакологически значимых количествах.
2. Прием данной композиции на фоне длительного употребления этанола оказывает позитивный эффект, направленный на снижение выраженности вызванных его хроническим токсическим влиянием изменений функциональной активности как нервной системы (снижение алкогольной мотивации, стимуляция ориентировочно-исследовательского поведения, модуляция уровня провоспалительных цитокинов в центральной нервной системе, свидетельствующая о снижении нейровоспаления), так и иммунной системы (стимуляция гуморального и клеточного иммунного ответа).

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Личный вклад каждого автора: И.А. Гольдина — концепция и дизайн исследования, обзор литературы, обработка данных, написание текста, внесение окончательной правки; Е.В. Маркова — руководитель темы НИР «Экспериментальное обоснование разработки новых технологий иммунотерапии поведенческих и аддиктивных расстройств в моделях стресс-индуцированной депрессии/агрессии и алкоголизма», концепция и дизайн исследования, обзор литературы, обработка данных, написание текста, внесение окончательной правки; И.В. Савкин — моделирование хронического алкоголизма, обработка данных, хроматографическое исследование; О.С. Аникеева, А.В. Смык — проведение экспериментов по влиянию ИНС на алкогольную мотивацию и поведение длительно алкоголизированных животных в тесте «открытое поле»; Е.В. Серенко — проведение экспериментов по влиянию биофлавоноидов на содержание цитокинов в структурах мозга и интенсивность иммунного ответа; Т.В. Шушпанова — консультант по проведению химической части исследования; М.А. Княжева — проведение экспериментов по влиянию биофлавоноидов на содержание цитокинов в структурах мозга и интенсивность иммунного ответа.

Финансирование. Работа выполнена за счет средств федерального бюджета Российской Федерации, выделенных на выполнение фундаментальных научных исследований в ФГБНУ «НИИ фундаментальной и клинической иммунологии», тема № FGMN-2024-0011.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.

Этический комитет. Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии» (протокол заседания № 139 от 30.05.2022).

ADDITIONAL INFO

Author’s contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the study, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the article, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the study. Personal contribution of the authors: I.A. Goldina — concept and design of the study, literature review, data analysis, writing the text, making final edits; E.V. Markova — head of the research topic «Experimental substantiation of the development of new technologies for immunotherapy of behavioral and addictive disorders in models of stress-induced depression/aggression and alcoholism», study concept and design, literature review, data analysis, text writing, making final editing; I.V. Savkin — modeling of chronic alcoholism, data analysis, chromatographic research; O.S. Anikeeva, A.V. Smyk — conducting experiments on the bioflavonoides influence on long-term alcoholized animal’s alcohol motivation and behavior in the “Open Field” test; E.V. Serenko — conducting experiments on the bioflavonoids effect on the cytokines content in brain structures and the immune response intensity; T.V. Shushpanova — consultant for the chemical part of the study; M.A. Knyazheva — conducting experiments on the bioflavonoids effect on the cytokines content in brain structures and the immune response intensity.

Funding source. The study was carried out using funds from the federal budget of the Russian Federation allocated for fundamental scientific research in the Federal State Budgetary Scientific Institution “Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology”, theme No. FGMN-2024-001.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Ethics approval. The protocol of the study was approved by the local Ethics Committee of the Federal State Budgetary Scientific Institution “Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology” (No. 139 of 2022 May 30).

Об авторах

Ирина Александровна Гольдина

Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии

Автор, ответственный за переписку.
Email: igoldina@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8246-9552
SPIN-код: 7537-8927
Россия, 630099, Новосибирск, ул. Ядринцевская, д. 14

Евгения Валерьевна Маркова

Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии

Email: evgeniya_markova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9746-3751
SPIN-код: 8439-7310

д-р мед. наук

Россия, 630099, Новосибирск, ул. Ядринцевская, д. 14

Иван Владимирович Савкин

Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии

Email: i.v.savkin2020@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-1065-9234
SPIN-код: 8344-4247
Россия, 630099, Новосибирск, ул. Ядринцевская, д. 14

Ольга Сергеевна Аникеева

Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии

Email: osa7.7@mail.ru
ORCID iD: 0009-0007-0421-7150
SPIN-код: 3490-2527

канд. мед. наук

Россия, 630099, Новосибирск, ул. Ядринцевская, д. 14

Евгений Владимирович Серенко

Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии

Email: serenko.evgeniy@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7807-3603
SPIN-код: 3197-7109
Россия, 630099, Новосибирск, ул. Ядринцевская, д. 14

Анна Владимировна Смык

Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии

Email: anna-v-smyk@mail.ru
ORCID iD: 0009-0009-5582-6305
SPIN-код: 8582-0040
Россия, 630099, Новосибирск, ул. Ядринцевская, д. 14

Тамара Владимировна Шушпанова

Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук

Email: shush59@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9455-0358
SPIN-код: 9158-9235

канд. мед. наук

Россия, Томск

Мария Александровна Княжева

Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии

Email: lira357knyazheva@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2537-8232
SPIN-код: 8913-3798

канд. биол. наук

Россия, 14 Yadrintsevskaya st., Novosibirsk, 630099

Список литературы