Роль оксида азота в механизмах стресс-протекторного действия низкоинтенсивного электромагнитного излучения крайне высокой частоты при остром и хроническом стрессе

Полный текст

АКТУАЛЬНОСТЬ

В наших предыдущих исследованиях микроциркуляции у крыс установлено, что превентивное 10-кратное воздействие низкоинтенсивного электромагнитного излучения крайне высокой частоты (ЭМИ КВЧ) уменьшало выраженность проявлений гиперемии, характерной для острого стресса на протяжении 48 ч после действия стресс-фактора [1]. Одновременное воздействие ЭМИ КВЧ на животных, находившихся в условиях длительного ограничения подвижности, привело к нивелированию вазоконстрикции, нарушений притока и оттока крови, вызванных стрессом. При проведении лазерной допплеровской флоуметрии анализ структуры ритмов колебаний позволил установить, что в механизмах стресс-протекторного действия низкоинтенсивного ЭМИ КВЧ основную роль играют эндотелий-зависимый, миогенный эндотелий-независимый и нейрогенный компоненты регуляции тканевого микрокровотока [1, 2].

В то же время для более полного понимания механизма стресс-протекторного действия ЭМИ КВЧ необходимы дополнительные исследования звеньев стресс-реакции — иммунной, процессов перекисного окисления, воспаления. Кроме того, до сих пор не выяснена роль оксида азота (NO) в механизмах антистрессорного действия ЭМИ КВЧ.

Цель исследования — изучение уровня молекул средней массы, циркулирующих иммунных комплексов и малонового диальдегида у крыс, находящихся в условиях стресса разной продолжительности и действия ЭМИ КВЧ, а также определение роли NO в реализации антистрессорного эффекта низкоинтенсивного ЭМИ КВЧ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экспериментальная часть работы выполнена на кафедре физиологии человека и животных и биофизики в Центре коллективного пользования научным оборудованием «Экспериментальная физиология и биофизика» ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет им. В.И. Вернадского» в рамках гранта РНФ № 23-24-00332 «Тканевая микрогемодинамика: механизмы антистрессорного действия низкоинтенсивного миллиметрового излучения» и программы исследований № АААА-А21-121011990099-6 «Физиологические механизмы биологического действия факторов разной природы и интенсивности» ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет им. В.И. Вернадского».

Объекты исследования

Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены. Все процедуры, выполненные в исследованиях с участием животных, соответствовали этическим стандартам, утвержденным правовыми актами Российской Федерации, принципам Базельской декларации и рекомендациям этического комитета по биоэтике ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет им. В.И. Вернадского» (протокол № 5 от 2022 г.).

Эксперимент проводили на половозрелых крысах-самцах линии Wistar массой 200–220 г (ФГУП «Питомник лабораторных животных „Рапполово“»), прошедших карантин не менее 14 дней. Животные содержались в условиях вивария с естественным световым режимом при температуре 18–22 °C на подстиле на основе початков кукурузы (ООО «Зилубаг», Россия), со свободным доступом к воде и полноценному гранулированному корму (ЛБК-120, ЗАО «Тосненский комбикормовый завод», Россия).

Для эксперимента из 200 животных были отобраны 140 крыс-самцов одинакового возраста, характеризующиеся средней двигательной активностью и низкой эмоциональностью в тесте «открытое поле» (НПК «Открытая Наука», Россия), которые составляют большинство в популяции. Такой отбор позволил сформировать однородные группы животных с близкими конституционными особенностями, однонаправленно реагирующими на действие того или иного фактора.

После предварительного отбора животных разделили на 7 групп по 20 крыс в каждой (табл. 1): 1) интактная (n = 20) — животные содержались в условиях вивария; 2) ОС (n = 20) — животные были подвержены однократному действию острого стресса (ОС); 3) КВЧ-ОС (n = 20) — животные в течение 10 сут подвергались воздействию ЭМИ КВЧ, с последующим воздействием ОС (на 10-е сутки); 4) группа L-NAME-КВЧ-ОС (n = 20) — животным в течение 10 дней ежедневно вводили в брюшную полость неселективный ингибитор NOS L-NAME (NG-Nitro-L-arginine Methyl Ester, Hydrochloride, Sigma, США) в концентрации 10 мг/кг, а затем через 1 ч подвергали воздействию ЭМИ КВЧ; 5) группа ГК (n = 20) — животные в течение 10 сут подвергались воздействию хронического гипокинетического стресса (ГК); 6) КВЧ-ГК (n = 20) — животные в течение 10 сут последовательно подвергались сначала облучению ЭМИ КВЧ с последующим воздействием ГК; 7) группа L-NAME-КВЧ-ГК (n = 20) — животным в течение 10 дней ежедневно вводили в брюшную полость L-NAME в концентрации 10 мг/кг, затем через 1 ч подвергали воздействию ЭМИ КВЧ, а еще через 1 ч — ГК.

 

Таблица 1. Дизайн эксперимента Table 1. Experiment design
Группа	Сутки эксперимента
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Интактная	К	К	К	К	К	К	К	К	К	К
ОС	–	–	–	–	–	–	–	–	–	ОС
КВЧ-ОС	КВЧ	КВЧ	КВЧ	КВЧ	КВЧ	КВЧ	КВЧ	КВЧ	КВЧ	КВЧ/ОС
L-NAMEКВЧ-ОС	L-NAME/КВЧ	L-NAME/КВЧ	L-NAME/КВЧ	L-NAME/КВЧ	L-NAME/КВЧ	L-NAME/КВЧ	L-NAME/КВЧ	L-NAME/КВЧ	L-NAME/КВЧ	L-NAME/КВЧ/ОС
ГК	ГК	ГК	ГК	ГК	ГК	ГК	ГК	ГК	ГК	ГК
КВЧ-ГК	КВЧ/ГК	КВЧ/ГК	КВЧ/ГК	КВЧ/ГК	КВЧ/ГК	КВЧ/ГК	КВЧ/ГК	КВЧ/ГК	КВЧ/ГК	КВЧ/ГК
L-NAMEКВЧ-ГК	L-NAME/ ГК/КВЧ	L-NAME/ ГК/КВЧ	L-NAME/ ГК/КВЧ	L-NAME/ ГК/КВЧ	L-NAME/ ГК/КВЧ	L-NAME/ ГК/КВЧ	L-NAME/ ГК/КВЧ	L-NAME/ ГК/КВЧ	L-NAME/ ГК/КВЧ	L-NAME/ ГК/КВЧ
Примечание. Здесь и в табл. 2–4: К — контроль; ОС — острый стресс; ГК — хронический гипокинетический стресс; КВЧ — электромагнитное излучение крайне высокой частоты (ЭМИ КВЧ); КВЧ-ОС — комбинация факторов ЭМИ КВЧ и ОС; L-NAME-КВЧ-ОС — комбинация воздействия блокатора оксида азота L-NAME, ЭМИ КВЧ и ОС; КВЧ-ГК — комбинация факторов ЭМИ КВЧ и ГК; L-NAME-КВЧ-ГК — комбинация воздействия блокатора оксида азота L-NAME, ЭМИ КВЧ и ГК. Note. Here and in Tables 2–4: К, control; OC, acute stress; ГК, chronic hypokinetic stress; КВЧ, extremely high-frequency low-intensity electromagnetic radiation’s; КВЧ-ОС, a combination of extremely high-frequency low-intensity electromagnetic radiation’s and acute stress factors and acute stress factors; L-NAME-КВЧ-ОС, a combination effects of nitric oxide blocker L-NAME, extremely high-frequency low-intensity electromagnetic radiation’s and acute stress factors; КВЧ-ГК, a combination of extremely high-frequency low-intensity electromagnetic radiation’s and hypokinetic stress factors; L-NAME-КВЧ-ГК — is a combination effects of L-NAME nitric oxide blocker, extremely high-frequency low-intensity electromagnetic radiation’s and hypokinetic stress.

 

На 10-е сутки эксперимента, через два часа после окончания всех манипуляций с животными, под эфирным наркозом осуществляли декапитацию с помощью гильотины («НПК Открытая Наука», Россия) и забор крови для определения физиологических маркеров стресс-протекторного действия: молекул средней массы, циркулирующих иммунных комплексов, малонового диальдегида. Кровь отбирали в вакуумные пробирки с разделительным гелем для сыворотки BD Vacutainer (BD Vacutainer SST II Advance).

Моделирование острого и хронического стресса и их комбинаций

Для моделирования ОС животных помещали в емкость для плавания, длительность эксперимента составила 1 ч. Температура воды 21–25 °C.

При создании условий ограничения подвижности животных в эксперименте использовались специальные пеналы из оргстекла, соответствующие размеру животного, для обеспечения максимально комфортного нахождения крысы внутри пенала и предотвращения сдавливания частей тела. При моделировании ГК в данных пеналах животные находились 10 сут по 19–20 ч в сутки, в остальное время осуществлялись кормление и уход за животными.

Методика определения уровня содержания молекул средней массы в сыворотке крови.

Молекулы средней массы (МСМ) — интегральный биохимический маркер эндогенной интоксикации [3]. Данный способ включает забор крови, отделение сыворотки от форменных элементов крови путем центрифугирования, получения безбелковой пробы путем прибавления к 1 мл сыворотки крови 0,5 мл 10 % трихлоруксусной кислоты и центрифугирования в течение 30 мин при 3000 об/мин. Далее к 0,5 мл надосадочной жидкости прибавляли 4,5 мл дистиллированной воды и определяли оптическую плотность пробы на спектрофотометре при длинах волн 254, 275 и 280 нм [4, 5].

Измерения проб проводили на спектрофотометре ПЭ 5400-УФ (ООО «Экрос-аналитика», Россия) против контроля (дистиллированной воды). По величине оптической плотности пробы определяли содержание МСМ и по их уровню судили о наличии эндогенной интоксикации [3].

Методика определения концентрации циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови с помощью полиэтиленгликольного теста

Определение концентрации высокомолекулярных циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови проводили по методу Гриневича [6] с помощью преципитации в течение 60 мин из сыворотки крови комплексов антиген–антитело раствором 3,75 % полиэтиленгликоля, приготовленным с использованием 0,1 М боратного буфера (pH 8,4), с последующим фотометрическим определением оптической плотности преципитата. Измерения проводили на спектрофотометре ПЭ 5400-УФ (ООО «Экрос-аналитика», Россия), определяя оптическую плотность опытных проб (приготовлены 0,1 М боратного буфера с раствором 3,75 % полиэтиленгликоля) и контроля (0,1 М боратный буфер) в кюветах с толщиной 10 мм при 450 нм. Затем рассчитывали разность показателей оптической плотности, результат умножали на 1000 и получали количество ЦИК в 100 мл сыворотки. Ответ выражали в единицах оптической плотности:

E_ЦИК = (E_оп – E_к) × 1000,

где Е_ЦИК — плотность высокомолекулярных циркулирующих иммунных комплексов; Е_оп — оптическая плотность опытной пробы; Е_к — оптическая плотность контрольной пробы.

Методика определения малонового диальдегида в сыворотке крови

Определение содержания МДА в сыворотке проводили по методу M. Uchiyama и M. Mihara [7]. В основе метода лежит реакция между малоновым альдегидом и тиобарбитуровой кислотой (ТБК), которая при высокой температуре и кислом значении рН протекает с образованием окрашенного триметинового комплекса, содержащего одну молекулу МДА и две молекулы ТБК [8].

Пробирки интенсивно встряхивали до образования белой суспензии, имеющей розовый оттенок. Затем пробирки центрифугировали при 3000 об/мин (1800 g). Сразу после центрифугирования отбирали 3 мл супернатанта в чистую пробирку и измеряли оптическую плотность опытной пробы против холостой при двух длинах волн: 540 и 590 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Измерение проводили не позднее 1,5 ч после центрифугирования.

Концентрацию МДА рассчитывали по следующей формуле:

$C =\frac{D_{540} – D_{590}}{0,156}\times 16,$

где C — содержание ТБК-продуктов в пробе, мкмоль/л; D₅₄₀ — оптическая плотность опытной пробы при 540 нм; D₅₉₀ — оптическая плотность опытной пробы при 590 нм; 0,156 — коэффициент молярной экстинкции комплекса малоновый альдегид – ТБК, л/мкмоль×см; 16 — коэффициент разведения сыворотки.

Результат измерения представляется в виде единиц оптической плотности.

Статистическая обработка результатов исследования

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета Graph Pad Prism 9.5.1. Так как распределение значений переменных в некоторых экспериментальных группах по данным теста Шапиро–Уилка отличалось от нормального, достоверность различий относительно интактной группы определяли с помощью непараметрического критерия множественных сравнений Данна. Различия считали достоверными при p < 0,05. Данные представлены на графиках как среднее и стандартная ошибка среднего (M ± SEM).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Уровень содержания молекул средней массы в сыворотке крови крыс

В литературе принято считать, что МСМ являются стресс-маркерами, отражающими патологическое состояние белкового обмена [9]. При этом МСМ могут свидетельствовать не только о внутренней эндоинтоксикации, но и сами могут служить вторичными токсинами, существенно нарушая жизнедеятельность всех систем и органов. Общеизвестно, что при длине волны 280 нм среди многообразия МСМ выявляются ароматические нетоксические аминокислоты, а также фенолы, тирозин, триптофан, фенилаланин, а при 254 нм можно обнаружить не содержащие аминокислот продукты неполного распада белков, обладающие токсическим влиянием, а также аденозиндифосфат и аденозинтрифосфат, аденин, валин, фенилаланин и производные ряда аминокислот [10, 11].

При патологических процессах происходит активация плазменных систем ограниченного протеолиза, преобладает и наблюдается возрастание уровня содержания МСМ в спектре 280 нм, а при увеличении перекисного окисления липидов (ПОЛ) и иммуногенеза, наоборот, наблюдается рост МСМ при длине волны 254 нм [12]. При длине волны 275 нм регистрируют МСМ, содержащие ароматические производные тирозина [13].

Исходя из их многообразия, по МСМ невозможно сделать ясное заключение о той или иной направленности процессов, происходящих в организме, а лишь констатировать степень интоксикации организма. Так, некоторые МСМ ингибируют процесс дифференцировки эритроцитов синтез гемоглобина, ДНК, глюконеогенез, нарушают механизмы транспорта веществ через мембрану, а также тканевое дыхание [14].

Установлено, что при длине волны 254 нм только в группе L-NAME-КВЧ-ГК (табл. 2) происходило достоверное увеличение уровня содержания МСМ относительно интактной группы крыс на 36,7 % (р = 0,04). Это свидетельствует о стимуляции при блокаде NO ПОЛ и иммуногенеза (при 254 нм), чего не наблюдалось при отсутствии блокады. В других экспериментальных группах (ОС, ГК, КВЧ-ОС, КВЧ-ГК, L-NAME-КВЧ-ОС) при данной длине волны регистрации МСМ не было обнаружено значительных изменений по сравнению с интактной группой. При длине волны 275 нм ни в одной из исследуемых групп (ОС, ГК, КВЧ-ОС, КВЧ-ГК, L-NAME-КВЧ-ОС, L-NAME-КВЧ-ГК) уровень содержания МСМ достоверно не отличался от интактной группы.

 

Таблица 2. Содержание молекул средней массы (е. о. п.) в сыворотке крови крыс в условиях нормы, изолированного острого стресса, хронического гипокинетического стресса, а также различных комбинаций этих факторов c электромагнитным излучением крайне высокой частоты и блокатором оксида азота L-NAME, M ± SEM Table 2. The levels of middle-weight molecules (in optical density units) in rat blood serum under normal conditions, isolated acute stress, chronic hypokinetic stress, and various combinations of these factors with extremely high-frequency electromagnetic radiation and the nitric oxide blocker L-NAME, M ± SEM
Длина волны	Группа
	интактная (n = 20)	ОС (n = 20)	КВЧ-ОС (n = 20)	L-NAME-КВЧ-ОС (n = 20)	ГК (n = 20)	КВЧ-ГК (n = 20)	L-NAME-КВЧ-ГК (n = 20)
254 нм	0,218 ± 0,024, 100,0 %	0,224 ± 0,028, 103,0 %, р = 0,98	0,221 ± 0,025, 102,0 %, р = 1,00	0,282 ± 0,031, 129,4 %, р = 0,07	0,178 ± 0,021, 81,7 %, р = 0,84	0,192 ± 0,020, 88,1 %, р = 0,53	0,298 ± 0,034, 136,7 %, р = 0,04
275 нм	0,179 ± 0,018, 100,0 %	0,185 ± 0,026, 103,3 %, р = 0,97	0,195 ± 0,019, 108,9 %, р = 0,93	0,229 ± 0,033, 127,9 %, р = 0,08	0,150 ± 0,026, 83,8 %, р = 0,86	0,167 ± 0,013, 93,3 %, р = 0,92	0,210 ± 0,026, 117,3 %, р = 0,74
280 нм	0,174 ± 0,020, 100,0 %	0,188 ± 0,023, 108,1 %, р = 0,98	0,194 ± 0,022, 111,5 %, р = 0,96	0,240 ± 0,027, 137,9 %, р = 0,03	0,141 ± 0,016, 81,0 %, р < 0,05	0,155 ± 0,018, 89,1 %, р = 0,49	0,227 ± 0,024, 130,5 %, р = 0,04
Примечание. р —достоверность различий по сравнению с интактной группой, установленная с помощью непараметрического критерия множественных сравнений Данна. Note. р is the significance of differences compared to the intact group, determined using Dunn’s nonparametric multiple comparison test.

 

При длине волны регистрации 280 нм в группе ГК уровень содержания МСМ снижался на 19,0 % (р < 0,05) относительно интактной группы. Комбинация КВЧ-ГК ослабляла этот эффект до незначимых величин относительно интактной группы. В условиях ГК наблюдаемое снижение МСМ может быть отражением снижения метаболитов-предшественников, ответственных за функциональную активность серотонинергической стресс-лимитирующей системы [15, 16].

При этой же длине волны регистрации при использовании блокатора NO в двух группах — L-NAME-КВЧ-ОС и L-NAME-КВЧ-ГК — происходило значительное повышение веществ из пула МСМ на 37,9 % (р = 0,03) и 30,5 % (р = 0,04) соответственно относительно интактной группы. Это может быть как проявлением эндотоксикоза (возрастают патологические продукты обмена белков, обладающие токсическим действием), так и возрастанием уровня регуляторных пептидов, влияющих на различные функции организма. Повышение уровня содержания МСМ в сыворотке крови может быть обусловлено нарушением распада белков и экскреции из организма, либо усиленным образованием в тканях [17]. Следовательно, наличие NO необходимо для нормализации уровня МСМ. Блокада NO, напротив, способствует накоплению патологических продуктов белкового обмена в виде МСМ.

Таким образом, можно сделать вывод, что NO — необходимый фактор для снижения процессов интоксикации в условиях действия низкоинтенсивного ЭМИ КВЧ, которое реализует стресс-протекторное действие при ОС и ГК за счет снижения/нормализации патологического пула МСМ в сыворотке крови.

Уровень содержания циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови крыс

При изучении уровня ЦИК установлено, что в группе ОС не было выявлено достоверных изменений ЦИК по сравнению с интактными животными. Следует, однако, отметить, что в условиях комбинации с ОС уровень ЦИК был ниже, чем в случае изолированного применения ОС, хотя эти изменения и не были достоверны (табл. 3).

 

Таблица 3. Содержание циркулирующих иммунных комплексов (у. е.) в сыворотке крови крыс в условиях нормы, изолированного острого стресса, хронического гипокинетического стресса, а также различных комбинаций этих факторов c электромагнитным излучением крайне высокой частоты и блокатором оксида азота L-NAME, M ± SEM Table 3. The levels of circulating immune complexes (in conventional units) in rat blood serum under normal conditions, isolated acute stress, chronic hypokinetic stress and various combinations of these factors with extremely high-frequency electromagnetic radiation and the nitric oxide blocker L-NAME, M ± SEM
Группа	Значение
Интактная (n = 20)	221,7 ± 25,1, 100,0 %
ОС (n = 20)	283,6 ± 35,8, 127,9 %, р = 0,06
КВЧ-ОС (n = 20)	247,9 ± 22,2, 111,8 %, р = 0,92
L-NAME-КВЧ-ОС (n = 20)	323,0 ± 26,2, 145,7 %, р < 0,01
ГК (n = 20)	318,6 ± 24,1, 143,7 %, р < 0,01
КВЧ-ГК (n = 20)	261,5 ± 17,2, 118,0 %, р = 0,82
L-NAME-КВЧ-ГК (n = 20)	261,5 ± 17,2, 189,9 %, р < 0,001
Примечание. р — достоверность различий по сравнению с интактной группой, установленная с помощью непараметрического критерия множественных сравнений Данна. Note. р is the significance of differences compared to the intact group, determined using Dunn’s nonparametric multiple comparison test.

 

В группе L-NAME-КВЧ-ОС (табл. 3) в условиях превентивного применения блокатора NO, напротив, наблюдался выраженный рост уровня ЦИК на 45,7 % (р < 0,01) по сравнению с интактной группой. Это свидетельствует о существенных нарушениях функций иммунной системы, в частности, образования антител, в условиях отсутствия NO согласно [18]. Таким образом, полученные результаты продемонстрировали, что NO необходим для реализации стресс-протекторного эффекта превентивного воздействия ЭМИ КВЧ в условиях ОС.

Уровень ЦИК увеличивался у крыс в группе ГК на 43,7 % (р < 0,01; табл. 3) по сравнению с интактными животными. По сведениям, повышенная концентрация ЦИК свидетельствует о низком уровне генерации антител в ответ на возрастающее количество антигенов [18]. Повышение ЦИК является индикатором чрезмерной интенсивности окислительных процессов в тканях организма и снижения способностей иммунной системы инактивировать и выводить ЦИК. То есть высокий уровень ЦИК отражает нарушение функционирования иммунной системы.

В группе КВЧ-ГК данный эффект исчезал, поскольку показатель ЦИК здесь достоверно не отличался от интактной группы (табл. 3). Из литературных данных также известно, что в условиях коррекции ЭМИ КВЧ не происходит активации инфекционно-воспалительных процессов [19, 20]. Как проиллюстрировали полученные выше результаты, превентивное воздействие ЭМИ КВЧ ослабляло эффект ГК, снижая уровень ЦИК, оказывая стресс-протекторное действие.

В группе L-NAME-КВЧ-ГК в условиях превентивной блокады NO с помощью L-NAME, напротив, наблюдался выраженный рост уровня ЦИК на 89,9 % (р < 0,001) по сравнению с интактной группой, что в соответствии с работой [18] приводит к мысли о серьезных нарушениях гуморального иммунитета, связанных со снижением адекватной продукции антител в ответ на антигены (табл. 3).

Полученные данные в отношении групп ГК и L-NAME-КВЧ-ГК также свидетельствуют о более сильном повреждающем эффекте ГК в отношении функций иммунной системы, чем в случае с ОС. Как и в случае с ОС, можно видеть, что NO необходим для реализации стресс-протекторного эффекта превентивного воздействия ЭМИ КВЧ в условиях ОС. Блокада NO приводит к исчезновению стресс-протекторного эффекта ЭМИ КВЧ в отношении функций иммунной системы и усугубляет последствия ГК, что выражается в существенном росте ЦИК в сыворотке крови.

Известно, что продукция ЦИК — важный показатель гуморального иммунного ответа при воспалении [21]. Она представляет собой важный физиологический механизм защиты организма, ответственный за элиминацию, уничтожение эндо- и экзогенных антигенов, токсических продуктов белкового метаболизма, чужеродных и потенциально опасных вирусов и бактерий ретикулоэндотелиальной системой. В норме ЦИК, сформировавшиеся на основе антигенов, антител и компонентов комплемента, уничтожаются фагоцитами. Но при инфекционных, воспалительных, аллергических процессах скорость их разрушения может быть нарушена. В результате их накопление и отложение в периваскулярном пространстве и корковом слое почек может дополнительно активировать систему комплемента и воспалительные реакции, усугубляя их течение.

Таким образом, NO в отсутствие его блокады необходим для нормального иммунного ответа организма и для реализации стресс-протекторного действия низкоинтенсивного ЭМИ КВЧ в условиях его превентивного применения, одним из механизмов которого является снижение уровня ЦИК в крови.

Содержание малонового диальдегида в сыворотке крови крыс

Концентрация малонового диальдегида (МДА) увеличивалась в группе ОС на 29,5 % (р < 0,05; табл. 4) по сравнению с интактной группой, а в сыворотке крови группы КВЧ-ОС данный показатель достоверно не отличался от контрольной группы. Как известно, высокий уровень МДА является показателем интенсивного окислительного стресса в организме и, в частности, возрастания продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) [22, 23].

Таким образом, ОС приводил к интенсификации окислительных процессов в организме и к повышению содержания продуктов ПОЛ, а в условиях превентивного применения ЭМИ КВЧ в группе КВЧ-ОС процессы свободнорадикального окисления находились в физиологически допустимых пределах.

В группе L-NAME-КВЧ-ОС (табл. 4), в условиях превентивного применения блокатора NO, уровень МДА возрастал в 2 раза — на 101,6 % (р < 0,001) — по сравнению с интактной группой. Это свидетельствует о существенных нарушениях окислительного метаболизма, сопровождающегося увеличением свободных радикалов согласно [22, 23]. Таким образом, было показано, что NO необходим для реализации стресс-протекторного эффекта превентивного воздействия ЭМИ КВЧ в условиях ОС в отношении процессов ПОЛ.

 

Таблица 4. Содержание малонового диальдегида (мкмоль/л) в сыворотке крови крыс в условиях нормы, изолированного острого стресса, хронического гипокинетического стресса, а также различных комбинаций этих факторов c электромагнитным излучением крайне высокой частоты и блокатором оксида азота L-NAME, M ± SEM Table 4. The levels of malondialdehyde (in μmol/L) in rat blood serum under normal conditions, isolated acute stress, chronic hypokinetic stress, and various combinations of these factors with extremely high-frequency electromagnetic radiation and the nitric oxide blocker L-NAME, M ± SEM
Группа	Значение
Интактная (n = 20)	1,29 ± 0,11, 100,0 %
ОС (n = 20)	1,67 ± 0,10, 129,5 %, р < 0,05
КВЧ-ОС (n = 20)	1,38 ± 0,12, 107,0 %, р = 0,96
L-NAME-КВЧ-ОС (n = 20)	2,60 ± 0,24, 201,6 %, р < 0,001
ГК (n = 20)	2,41 ± 0,13, 186,8 %, р < 0,001
КВЧ-ГК (n = 20)	1,44 ± 0,15, 111,6 %, р = 0,90
L-NAME-КВЧ-ГК (n = 20)	2,75 ± 0,22, 213,2 %, р < 0,001
Примечание. р — достоверность различий по сравнению с интактной группой, установленная с помощью непараметрического критерия множественных сравнений Данна. Note. р is the significance of differences compared to the intact group, determined using Dunn’s nonparametric multiple comparison test.

 

Уровень МДА увеличивался у крыс и в группе ГК на 86,8 % (р < 0,001) по сравнению с интактными животными. В группе КВЧ-ГК этот эффект пропадал, поскольку концентрация МДА здесь достоверно не отличалась от интактной группы (р = 0,90; табл. 4). Как показали полученные выше результаты, превентивное воздействие ЭМИ КВЧ ослабляло эффект ГК, снижая концентрацию МДА, оказывая стресс-протекторное действие.

В группе L-NAME-КВЧ-ГК, в условиях превентивной блокады NO с помощью L-NAME наблюдался интенсивный рост концентрации МДА более чем в 2 раза — на 113,2 % (р < 0,001; табл. 4) по сравнению с интактной группой, что в соответствии с работами [22, 23] свидетельствует о значительном возрастании ПОЛ, еще более выраженном, чем в случае ОС. Таким образом, блокирование NO L-NAME существенно увеличивает МДА, что свидетельствует об интенсификации процессов ПОЛ в крови. Следовательно, нормальный уровень NO необходим для реализации стресс-протекторного эффекта ЭМИ КВЧ в условиях его превентивного применения при ОС и ГК. Один из механизмов этого эффекта заключается в снижении процессов ПОЛ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты настоящего исследования позволяют заключить, что NO играет важную роль в реализации стресс-протекторного эффекта низкоинтенсивного ЭМИ КВЧ в условиях ОС и ГК. ОС относительно интактной группы существенно повышал только уровень МДА — на 29,5 % (р < 0,05), что свидетельствует об интенсификации процессов ПОЛ. Превентивное КВЧ-воздействие оказывало стресс-протекторный эффект, снижая ПОЛ, поскольку у животных в группе КВЧ-ОС концентрация МДА возвращалась к уровню, характерному для интактных животных.

В условиях блокады NO стресс-протекторный эффект ЭМИ КВЧ при ОС не проявлялся, поскольку в группе L-NAME-КВЧ-ОС повышался уровень МСМ при длине волны регистрации 280 нм на 37,9 % (р = 0,03), содержание ЦИК и МДА в сыворотке крови повышалось на 45,7 (р < 0,01) и 101,6 % (р < 0,001) соответственно относительно интактной группы. Это свидетельствует об интенсификации в отсутствие NO процессов эндотоксикации и компонентов стресс-реализующей системы организма и физиологически активных регуляторных пептидов, ингибировании процессов иммуногенеза и повышении окислительного метаболизма белков, интенсификации ПОЛ.

ГК-стресс достоверно снижал уровень МСМ при длине волны регистрации 280 нм и значимо повышал содержание ЦИК и МДА в сыворотке крови — на 43,7 % (р < 0,01) и 86,8 % (р < 0,001) соответственно. Это указывает на угнетение компонентов стресс-лимитирующей системы организма и физиологически активных регуляторных пептидов, ингибирование процессов иммуногенеза и повышение окислительного метаболизма белков, интенсификацию ПОЛ. Превентивное применение КВЧ (группа КВЧ-ГК) оказывало стресс-протекторное действие при ГК, так как значения МСМ, ЦИК и МДА возвращались к уровню интактных животных.

В условиях блокады NO с помощью L-NAME в группе L-NAME-КВЧ-ГК повышался уровень МСМ при длинах волн регистрации 254 и 280 нм — на 36,7 (р = 0,04) и 30,5 % (р = 0,04) соответственно; повышалось содержание ЦИК и МДА — на 89,9 (р < 0,001) и 113,2 % (р < 0,001) соответственно. Все это свидетельствует об интенсификации в отсутствие NO процессов эндотоксикации и компонентов стресс-реализующей и стресс-лимитирующей систем организма, физиологически активных регуляторных пептидов, ингибировании процессов иммуногенеза и повышении свободнорадикального окисления белков и липидов.

Таким образом, NO — необходимый фактор стресс-протекторного действия низкоинтенсивного ЭМИ КВЧ при его превентивном применении в условиях ОС и ГК. Механизмы его действия связаны с угнетением процессов эндотоксикации, нормализацией уровня продуктов окисления белков и содержания регуляторных пептидов, активацией гуморального иммунитета, снижением процессов ПОЛ.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Личный вклад каждого автора: М.Ю. Раваева, И.В. Черетаев, Е.Н. Чуян, П.А. Галенко-Ярошевский, А.В. Зеленская — написание статьи, анализ данных; М.Ю. Раваева — редактирование статьи, разработка общей концепции.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 23-24-00332 «Тканевая микрогемодинамика: механизмы антистрессорного действия низкоинтенсивного миллиметрового излучения»).

Этический комитет. Протокол исследования на лабораторных животных был одобрен локальным Комитетом по этике ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет им. В.И. Вернадского» (№ 10 от 06.12.2022).

ADDITIONAL INFO

Authors’ contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the study, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the article, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the study. The contribution of each author: M.Yu. Ravaeva, I.V. Cheretaev, E.N. Chuyan, P.A. Galenko-Yaroshevskii, A.V. Zelenskaya — writing an article, data analysis; M.Yu. Ravaeva — editing an article, developing a general concept.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Funding source. The work was carried out with the financial support of the Russian Science Foundation (project No. 23-24-00332 “Tissue microhemodynamics: mechanisms of antistress action of low-intensity millimeter radiation”).

Ethics approval. study on laboratory animals was approved by the local Ethics Committee of the V.I. Vernadsky Crimean Federal University (No. 10 dated 06.12.2022).

Об авторах

Марина Юрьевна Раваева

Крымский федеральный университет им. В.И. Вернадского

Автор, ответственный за переписку.
Email: ravaevam@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-6081-1628
SPIN-код: 2398-3901

канд. биол. наук

Россия, 295007, Симферополь, пр. Академика Вернадского, д. 4

Игорь Владимирович Черетаев

Крымский федеральный университет им. В.И. Вернадского

Email: cheretaev86@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1852-4323
SPIN-код: 4587-6492

канд. биол. наук

Россия, 295007, Симферополь, пр. Академика Вернадского, д. 4

Елена Николаевна Чуян

Крымский федеральный университет им. В.И. Вернадского

Email: elena-chuyan@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0001-6240-2732
SPIN-код: 8373-3871

д-р биол. наук

Россия, 295007, Симферополь, пр. Академика Вернадского, д. 4

Павел Александрович Галенко-Ярошевский

Кубанский государственный медицинский университет

Email: galenko.yarochevsky@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-0873-284X
SPIN-код: 1575-6129

д-р мед. наук, чл.-корр. Российской aкадемии наук

Россия, Краснодар

Анаит Владимировна Зеленская

Кубанский государственный медицинский университет

Email: anait_06@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9512-2526
SPIN-код: 7646-3620

канд. мед. наук

Россия, Краснодар

Список литературы