Оценка транспортировки кисспептина через гематоэнцефалический барьер после интраназального введения

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Заболевания центральной нервной системы (ЦНС) являются основной причиной заболеваний во всем мире и в настоящее время приобретают все большую актуальность из-за роста численности населения, увеличения продолжительности жизни и пандемии COVID-19 [1]. Данные расстройства, в том числе неопластические, нейродегенеративные (болезнь Паркинсона и Альцгеймера) и психические расстройства (депрессия, шизофрения и биполярное расстройство) сложно поддаются лечению фармакологическими методами из-за гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). ГЭБ—микроциркуляторная система головного мозга, которая жестко регулирует движение ионов, молекул и клеток между плазмой крови и мозгом [2]. Хотя ГЭБ служит для защиты мозга от токсинов и патогенов, он также создает существенное препятствие для доставки терапевтических средств, поскольку 98% малых молекул и почти 100% крупных молекул не могут проникнуть в мозг [3]. Таким образом, сохраняется потребность в разработке инновационных стратегий, которые помогут доставлять терапевтические средства в мозг для лечения заболеваний ЦНС [4]. Интраназальная (ИН) доставка все чаще рассматривается как альтернативный подход к доставке терапевтических средств в ЦНС для лечения сопутствующих заболеваний. Интраназальный путь имеет несколько преимуществ при доставке лекарственного средства по сравнению с традиционным пероральным введением: ИН путь обходит основные фармакокинетические препятствия, обычно связанные с пероральной доставкой лекарственного средства в ЦНС, включая pH желудочно-кишечного тракта, ферменты, эффект первого прохождения в печени, почечная фильтрация и ГЭБ [5]; носовой эпителий обеспечивает оптимальную поглощающую поверхность для доставка лекарственного средства, благодаря его высокой проницаемости, неплотному межклеточному функциональному комплексу и обширной васкуляризации [6]; пути обонятельного и тройничного нервов, которые иннервируют эпителий носа, обеспечивают прямой путь к мозгу, что приводит к повышению терапевтической биодоступности ЦНС, уменьшению периферических побочных эффектов, снижению дозы и быстрому наступлению эффекта [5]; и с точки зрения ухода за пациентами, ИН путь является неинвазивным, простым для самостоятельного введения и лучше подходит для пациентов с двигательными расстройствами, симптомами тошноты, нарушением функции желудочно-кишечного тракта и/или дисфункция слюнных желез (сухость во рту). Одним из перспективных и неизученных семейств с точки зрения интраназальной доставки является семейство пептидов, кодируемых геном kiss1- кисспептины [7, 8]. Один из возможных механизмов действия связывают с тем, что нейроны кисспептина взаимодействуют с нейронами, синтезирующими оксид азота в вентромедиальном гипоталамусе, выступая центральным регуляторным узлом гипоталамо-гипофизарной репродуктивной оси [9]. Экспрессия кисспептина была выявлена в лимбической системе, что делает его участником не только репродуктивной функции, но и возможным регулятором поведенческих, эмоциональных и когнитивных реакций [10]. На сегодняшний день нет ни одного фундаментального исследования, оценивающего возможность применения интраназального пути введения для кисспептинов.

В связи с этим целью настоящей работы был анализ кисспептина-10 на транспортировку его через ГЭБ при интраназальном введении. Задачами было оценить влияние различных доз кисспептина-10 после интраназального и периферического введений на поведение экспериментальных животных

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные. В работе использовали 45 беспородных мышей массой 20–30 г, полученных из питомника Рапполово (Ленинградская область). Животных содержали в стандартных пластмассовых клетках в условиях вивария при свободном доступе к воде и пище в условиях инвертированного освещения с 8.00 до 20.00 при температуре 22 ± 2 °C.

Тестирование животных. Поведение животных исследовали с помощью тестов «открытое поле», «приподнятый крестообразный лабиринт» и «половая мотивация».

Тест «приподнятый крестообразный лабиринт». Данный тест выполняется для выявления тревожного поведения у экспериментальных животных. Беспородных мышей помещали в центр экспериментальной камеры — крестообразного лабиринта, который состоит из 4 рукавов длиной 30 см и шириной 6 см, соединенных под прямым углом. Два рукава имеют с 2 сторон стенки высотой 30 см, а 2 других открыты и освещены рассеянным искусственным светом. Лабиринт расположен на подставке высотой 40 см над уровнем пола. В течение 5 мин систематически проводили визуальную регистрацию следующих параметров: время нахождения в освещенных рукавах; количество выходов из темных рукавов в освещенные; время, которое мыши проводили на центральной площадке; количество свешиваний с открытых рукавов.

Тест «открытое поле».

Данным тестом исследовали свободную двигательную активность животных. Конструкция представляла собой круглую площадку диаметром 80 см, ограниченную по окружности непрозрачными стенами высотой 30 см. По всей площади открытого поля равномерно расположены 16 ходов (норок). Диаметр отдельной норки составлял 3 см каждая. Они предназначены для выявления элемента исследовательской активности у крыс (норковый рефлекс). Освещенность открытого поля равнялась 100 лк. Продолжительность одного опыта составляла 5 мин. На основании характерологического поведенческого атласа для грызунов извлекали ряд двигательных актов и поз, совокупность которых характеризует целостное поведение в «открытом поле». Для определения ориентировочной реакции мышь помещали в открытое поле, пол которого разделен на секторы. Подсчитывали число вставаний на задние лапы (вертикальная составляющая ориентировочной реакции), число пересеченных квадратов (горизонтальная компонента), количество обнюхиваний (исследовательская компонента), груминг, фризинг и болюсные выделения, а также число заглядываний в отверстия в полу (норковое поведение, отражающее исследовательскую активность) за 5 мин наблюдения.

Тест «Половая мотивация». Для оценки половой мотивации использовали установку, состоящую из 4 экспериментальных камер (15 × 30 см 2), к каждой из которых прилегала стимулирующая клетка, разделенная проницаемой стенкой [11]. Перфорированная перегородка позволяла самцам крыс исследовать (обонять) потенциального партнера (самку в стадии эструса) в камере, но препятствовала тактильному взаимодействию или копуляции. За день до тестирования мотивационного поведения все экспериментальные животные были адаптированы к условиям установки в течение 30 минут. Поведение регистрировали в форме видеозаписи в темной комнате при красном свете в течение 10 минут. Между экспозициями установку и перегородку очищали 3%-ным раствором перекиси водорода для устранения запаха. Для измерения половой мотивации для каждого животного фиксировали число попыток достичь самки, время, проведенное вблизи перегородки и латентное время до начала реакции на самку.

Фармакологические средства. В работе был использован кисспептин-10 (Sigma, США), который разводили в дистиллированной воде для 3 доз: 1. 0,1 мкг в 20 мкл

2. 1 мкг в 20 мкл и 3. 10 мкг в 20 мкл и вводили интраназально. Для внутрибрюшинного введения применяли кисспептин-10 в дозах 1мкг на 0.2 мл, 10 мкг на 0.2мл и 100мкг на 0.2мл. Контролем служил 0,9 % раствор хлорида натрия. За 10–15 мин до посадки в установки для оценки поведения, крысам интраназально и внутрибрюшинно вводили кисспептин-10.

Статистические методы анализа. Оценку статистической достоверности различий проводили при помощи пакета программ GraphPad Prism 8.3.4. с использованием однофакторного дисперсионного анализа. Для сравнения контрольной и экспериментальных групп применяли однофакторный дисперсионный анализ ANOVA. Из непараметрических критериев использовали критерий Краскела–Уоллиса для сравнения групп. Различия считали статистически значимыми при значении р <0,05. Для представления полученных данных использовали такие показатели описательной статистики, как среднеарифметическое значение и ошибка среднего.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Тест «Половая мотивация»

При изучении половой мотивации у каждого животного фиксировалось время, проведенное вблизи перегородки и латентное время до начала реакции на самку (рис. 1-2). Первая группа экспериментальных животных не подвергалась никакому воздействию - интактная группа. Во второй, третьей и четвертой группе животные получали кисспептин-10 интраназально в дозах 0,1, 1 и 10 мкг (в 20 мкл, по 10 мкл в каждую ноздрю) соответственно. В пятой, шестой и седьмой группе экспериментальные животные получали кисспептин-10 в дозах 1, 10, 100 мкг внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл соответственно. В восьмой группе животные получали физиологический раствор интраназально 20 мкл (10 мкл в каждую ноздрю) (ложно интраназальная группа), девятая группа животных «ложно внутрибрюшинная группа» получала физиологический раствор внутрибрюшинно 0,2 мл. Контрольное латентное время до начала реакции самца на самку составило 9,1±1,0 сек. Интраназальное введение кисспептина-10 достоверно сократило латентное время. При введении 1 мкг кисспептина латентное время достоверно отличалось от интактной группы мышей (р≤0,05) и составило 4,0±0,4 сек., а при введении 10 мкг латентное время уменьшалось до 3,4±0,4, по сравнению с интактной группой (р≤0,01). Внутрибрюшинное введение кисспептина-10 только максимальной дозировки достоверно сократило латентное время (р≤0,05) по сравнению с интактной группой и составило 4,1±0,5 сек. Остальные дозировки внутрибрюшинного введения кисспептина-10 (1 и 10 мкг) достоверно не изменяли контрольное латентное время. Интраназальное и внутрибрюшинное введения физиологических растворов достоверных изменений по сравнению с интактной группой не показало, что говорит о том, что уровень тревожности у животных значительно не повысился и манипуляции проведены правильно. Таким образом, интраназально введенный кисспептин-10 в дозировке 1 мкг вызывал уменьшение времени до начала реакции, как и при внутрибрюшинном введении, но при дозировке, в 10 раз превышающей иинтраназальную.

Таблица 1. Поведение животных в тесте «Половая мотивация» по показателю после интраназального и внутрибрюшинного введений физиологического раствора и кисспептина-10;

Table 1. The behavior of animals in the test “Sexual motivation” according to the indicator after intranasal and intra-Brushyes of the physiological solution and kisspeptin-10;

Группа	Интактные	Физ.р. ВБ	Физ.р. ИН	Кисспептин ИН 0,1	Кисспептин ИН 1	Кисспептин ИН 10	Кисспептин ВБ 1	Кисспептин ВБ 10	Кисспептин ВБ 100
Латентное время, сек	9,1±1,0	8,3±1,1	8,5±1,4	6,7±1,1	4,0±0,4*	3,4±0,4**	8,7±1,1	8,0±1,3	4,1±0,5*
Число попыток	13,5±1,0	14,0±1,2	12,5±1,2	13,4±1,2	22,2±2,0*	22,8±1,8**	11,1±1,2	13,0±2,2##	15,7±2,1

 

1. Интактные – Интактная группа животных без воздействия,
2. Физ.р. ВБ – внутрибрюшинное введение физиологического раствора
3. Физ.р. ИН – интраназальное введение физиологического раствора
4. Кисспептин ИН 0,1 – интраназальное введение кисспептина-10 в дозировке 0,1 мкг
5. Кисспептин ИН 1 – интраназальное введение кисспептина-10 в дозировке 1 мкг
6. Кисспептин ИН 10 – интраназальное введение кисспептина-10 в дозировке 10 мкг
7. Кисспептин ВБ 1 – внутрибрюшинное введение кисспептина-10 в дозировке 1 мкг
8. Кисспептин ВБ 10 – внутрибрюшинное введение кисспептина-10 в дозировке 10 мкг
9. Кисспептин ВБ 100 – внутрибрюшинное введение кисспептина-10 в дозировке 100 мкг

Примечание: результаты исследования представлены в виде M±m;
* – р≤0,05, ** – р≤0,01- различие между группой с введением кисспептина-10 и интактной группой;

## – р≤0,01, различие между интраназально введенным кисспептином и внутрибрюшинно введенным кисспептином одной дозировки

1. Intact - an intact group of animals without influence,
2. Phys.r. WB - intra -Brushyine administration of a physiological solution
3. Phys.r. IN - intranasal administration of physiological solution
4. Kisspeptin IN 0.1-intranasal administration of Kisspeptin-10 in a dosage of 0.1 μg
5. Kisspeptin IN 1-intranasal administration of Kisspeptin-10 in a dosage of 1 μg
6. Kisspeptin IN 10-intranasal administration of Kisspeptin-10 in a dosage of 10 μg
7. Kisspeptin IP 1- intraperitoneal administration of Kisspeptin-10 in a dosage of 1 μg
8. Kisspeptin IP 10- intraperitoneal administration of Kisspeptin-10 in a dosage of 10 μg
9. Kisspeptin IP 100- intraperitoneal administration of Kisspeptin-10 in a dosage of 100 μg

Note: The results of the study are presented in the form of M ± M;

*- p≤0.05, **- p≤0.01- The difference between the group with the introduction of Kisspeptin-10 and the intact group;

## - p≤0.01, the difference between intranasally introduced by Kisspeptin and intra -abdominal kisspeptin of one dosage

 

Следующая задача эксперимента в исследовании полового поведения у крыс самцов заключалась в определении количества попыток достижения самки самцом у перегородки. Каждая экспериментальная группа получала аналогичные препараты, как и в предыдущем исследовании. Количество попыток достижения самки самцом у перегородки в интактной группе составило 13,5±1,0. Интраназальное введение кисспептина-10 достоверно (р≤0,05 и р≤0,01 соответственно) увеличило количество попыток достижения самки самцом у перегородки в дозировках 1 и 10 мкг по сравнению с интактной группой и составило 22,2±2,0 и 22,8±1,8 сек. Внутрибрюшинное введение кисспептина-10 в дозировке 100 мкг недостоверно увеличило количество попыток достижения самки самцом у перегородки по сравнению с интактной группой и составило 15,7±2,1 сек. При сравнении групп мышей после интраназального и внутрибрюшинного введений кисспептина было установлено достоверное увеличение количества подходов к самке почти вдвое по сравнению с внутрибрюшинной группой при одинаковой дозировке 10 мкг.  Таким образом, интраназальное введение кисспептина-10 в дозировках 1 и 10 мкг увеличило в 1.5 раза (22,2±2,0 сек. и 22,8±1,8) количество попыток достижения самки самцом у перегородки по сравнению с интактной группой (13,5±1,0 сек.). Внутрибрюшинное введение кисспептина-10 в дозировках 1 и 10 мкг не повлияло на количество попыток достижения самки самцом у перегородки по сравнению с интактной группой. Интраназальное и внутрибрюшинное введение физиологического раствора достоверных изменений по сравнению с интактной группой не показало и составило 12,5±1,2 и 14,0±1,2 соответственно, что говорит о том, что уровень тревожности у животных значительно не повысился и манипуляции введения проведены правильно. Интраназально введенный кисспептин-10 достоверно увеличил количество попыток достижения самки самцом у перегородки в двух дозировках 1 и 10 мкг, в то время как внутрибрюшинное введение даже 100 мкг не вызвало достоверных изменений по данному показателю. Кисспептин-10 заметно усиливает предпочтение крыс самцов к самкам после интраназального введения. Интраназальное введение кисспептина-10 оказало влияние на половое поведение крыс-самцов, уменьшив латентное время до начала реакции на самку и увеличив количество попыток достижения самки в концентрациях в 10 раз меньше необходимых при внутрибрюшинном введении. Доза 100 мкг при внутрибрюшинном введении оказалась недостаточно эффективной для изменения поведения мышей в тесте «Половая мотивация».

Тест «приподнятый крестообразный лабиринт». 

При интраназальном введении кисспептина-10 во всех трех дозировках наблюдалось увеличение числа перебежек по сравнению с интактной группой животных, однако достоверное увеличение было в группах после введения кисспептина-10 1 мкг и 10 мкг, что говорит об уменьшении тревожности и повышении исследовательской активности у группы крыс после интраназального введения кисспептина-10 (Рис. 1). После интраназального введения кисспептина-10 в количестве 1 мкг количество перебежек увеличилось с 2,2±0,3 у интактной группы до 5,7±1,0. После интраназального введения кисспептина-10 в количестве 10 мкг количество перебежек достоверно увеличилось до 6,1±0,9. Прослеживался дозозависимый эффект после введения кисспептина-10 интраназально. Различий в количестве перебежек у группы интраназального введения физиологического раствора (2,5±0,4) и внутрибрюшинного введения физиологического раствора (2,4±0,3) и интактной группой (2,2±0,3) обнаружено не было. Внутрибрюшинное введение кисспептина в дозах 1 и 10 мкг достоверных изменений по сравнению с интактной группой не показало и составило 2,0±0,3. При повышении дозировки до 100 мкг внутрибрюшинно наблюдалось достоверное увеличение перебежек до 5,1±1,1 по сравнению с интактной группой.

Следующим оцениваемым показателем было время, проведенное в открытых рукавах.

При интраназальном введении кисспептина-10 в двух дозировках наблюдалось увеличение времени в открытых рукавах по сравнению с интактной группой животных, в то время как внутрибрюшинное введение вызвало эффект лишь при одной дозировке. (Рис. 2). Достоверное увеличение показателя было в группах после введения 1 мкг кисспептина, которое составило 32,8±5,4 с по сравнению с интактной группой 15,1±2,1 с.

При введении 10 мкг кисспептина интраназально, время, проведенное в открытых рукавах, достоверно увеличивалось до 35,8±6,0 по сравнению с интактной группой 15,1±2,1 с. При внутрибрюшинном введении кисспептина достоверные изменения наблюдались только при максимальной дозировке, показав увеличение времени в открытых рукавах до 32,5±2,5 по сравнению с интактной группой 15,1±2,1 с. Остальные группы - интраназального и внутрибрюшинного введений физиологического раствора, внутрибрюшинного введения 1 и 10 мкг кисспептина, а также интраназальное введение кисспептина-10 в дозе 1 мкг достоверных изменений по сравнению с интактной группой не показало.

При оценке показателя количество свешиваний с рукава было обнаружено, что интраназальное введение 1 и 10 мкг кисспептина-10 вызывали достоверное увеличение в связи с возможным уменьшением уровня стресса и повышением исследовательской и двигательной активностей. Показатель после интраназального введения средней дозировки увеличился до 4,1±0,3 (1мкг), а после максимальной дозировки (10 мкг)- до 4,4±0,5, по сравнению с интактной группой 1,7±0,2. Кисспептин-10, вводимый внутрибрюшинно в количестве 100 мкг также вызывал достоверное изменение в поведении, увеличив количество свешиваний до 4,4±0,5 по сравнению с интактной группой. 

Можно предположить, что дозировка 1 мкг при интраназальном введении и 1 и 10 мкг при внутрибрюшинном введении являются неэффективными, поскольку не вызывали изменений в поведении. Дозировка 10 мкг при интраназальном введении фармакологического агента вызывало достоверные изменения по всем оцениваемым параметрам, как и после внутрибрюшинного введения 100 мкг. Таким образом, для достоверного изменения поведения мышей в тесте приподнятый крестообразный лабиринт кисспептина-10 потребовалось в 10 раз меньше, чем при внутрибрюшинном введении.   

По остальным оцениваемым показателям- время в закрытых рукавах и число актов груминга достоверных различий между группами выявлено не было 

Рисунок 1 - Количество перебежек между рукавами в тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт»
1. Интактные – Интактная группа животных без воздействия,

2. Физ.р. ВБ – внутрибрюшинное введение физиологического раствора
3. Физ.р. ИН – интраназальное введение физиологического раствора
4. Кисспептин ИН 0,1 – интраназальное введение кисспептина-10 в дозировке 0,1 мкг
5. Кисспептин ИН 1 – интраназальное введение кисспептина-10 в дозировке 1 мкг
6. Кисспептин ИН 10 – интраназальное введение кисспептина-10 в дозировке 10 мкг
7. Кисспептин ВБ 1 – внутрибрюшинное введение кисспептина-10 в дозировке 1 мкг
8. Кисспептин ВБ 10 – внутрибрюшинное введение кисспептина-10 в дозировке 10 мкг
9. Кисспептин ВБ 100 – внутрибрюшинное введение кисспептина-10 в дозировке 100 мкг

 * – p≤0,05, ** – p≤0,01- различия между интактными и экспериментальными животными

Figure 1 - the number of dashes between the sleeves in the dough "Raised Cross Labyrinth"

1. Intact - an intact group of animals without influence,
2. Phys.r. IP - intraperitoneal administration of a physiological solution
3. Phys.r. IN - intranasal administration of physiological solution
4. Kisspeptin IN 0.1-intranasal administration of Kisspeptin-10 in a dosage of 0.1 μg
5. Kisspeptin IN 1-intranasal administration of Kisspeptin-10 in a dosage of 1 μg
6. Kisspeptin IN 10-intranasal administration of Kisspeptin-10 in a dosage of 10 μg
7. Kisspeptin IP 1- intraperitoneal administration of Kisspeptin-10 in a dosage of 1 μg
8. Kisspeptin IP 10- intraperitoneal administration of Kisspeptin-10 in a dosage of 10 μg
9. Kisspeptin IP 100- intraperitoneal administration of Kisspeptin-10 in a dosage of 100 μg

  * - p≤0,05, ** – p≤0,01 - differences between intact and experimental animals

Рисунок 2 – Результаты теста «Приподнятый крестообразный лабиринт»

I- оцениваемый параметр: время, проведенное в открытых рукавах
II- оцениваемый параметр: количество свешиваний с рукава
1. Интактные – Интактная группа животных без воздействия,

2. Физ.р. ВБ – внутрибрюшинное введение физиологического раствора
3. Физ.р. ИН – интраназальное введение физиологического раствора
4. Кисспептин ИН 0,1 – интраназальное введение кисспептина-10 в дозировке 0,1 мкг
5. Кисспептин ИН 1 – интраназальное введение кисспептина-10 в дозировке 1 мкг
6. Кисспептин ИН 10 – интраназальное введение кисспептина-10 в дозировке 10 мкг
7. Кисспептин ВБ 1 – внутрибрюшинное введение кисспептина-10 в дозировке 1 мкг
8. Кисспептин ВБ 10 – внутрибрюшинное введение кисспептина-10 в дозировке 10 мкг
9. Кисспептин ВБ 100 – внутрибрюшинное введение кисспептина-10 в дозировке 100 мкг

* – p≤0,05, ** – p≤0,01, различия между интактными и экспериментальными животными

Figure 2 - Results of the test "Raised Cross Labyrinth"

I- Evaluated parameter: time spent in open sleeves

II- Assessed parameter: The amount of might from the sleeve

1. Intact - an intact group of animals without influence,
2. Phys.r. IP - intraperitoneal administration of a physiological solution
3. Phys.r. IN - intranasal administration of physiological solution
4. Kisspeptin IN 0.1-intranasal administration of Kisspeptin-10 in a dosage of 0.1 μg
5. Kisspeptin IN 1-intranasal administration of Kisspeptin-10 in a dosage of 1 μg
6. Kisspeptin IN 10-intranasal administration of Kisspeptin-10 in a dosage of 10 μg
7. Kisspeptin IP 1- intraperitoneal administration of Kisspeptin-10 in a dosage of 1 μg
8. Kisspeptin IP 10- intraperitoneal administration of Kisspeptin-10 in a dosage of 10 μg
9. Kisspeptin IP 100- intraperitoneal administration of Kisspeptin-10 in a dosage of 100 μg

* - p≤0.05, ** - p≤0.01, differences between intact and experimental animals

Тест «Открытое поле»

По литературе известно, что нейроны кисспептина-10 локализуются в заднедорсальной медиальной миндалине головного мозга, которая в свою очередь отвечает за эмоциональное поведение и мотивацию полового поведения, а также функционально связана со страхом и тревогой. Поэтому, было проведено исследование влияния интраназального кисспептина-10 на эмоционально-исследовательское и двигательное поведение у крыс самцов. Результаты исследования поведения самцов крыс в тесте «Открытое поле» представлены на рис. 3 и 4. У группы животных, которым вводили интраназально 1 мг кисспептина-10, наблюдалось небольшое увеличение горизонтальной двигательной активности (возрастание количества пересеченных квадратов) по сравнению с интактной группой, увеличение исследовательской активности: достоверно увеличивалось количество обнюхиваний (р≤0,05), количество исследованных норок (р≤0,05) и пересеченных квадратов (р≤0,05) по сравнению с интактной группой.

Выявлено, что после интраназального введения 10 мкг кисспептина-10 у животных наблюдалось достоверное увеличение исследовательской деятельности (увеличение количества исследований норок (р≤0,01), обнюхиваний (р≤0,01), вертикальных стоек (р≤0,05), пересеченных квадратов (р≤0,01)) по сравнению с интактной группой.

У групп животных интраназального и внутрибрюшинного введения физиологического раствора достоверных различий с интактной группой ни по одному параметру обнаружено не было. При определении параметров стоек с упором, груминга и количества болюсов достоверных различий экспериментальные группы не показали.

Поведение животных, которым вводили кисспептин-10 в дозах 1 и 10 мкг достоверно не изменялось ни по одному параметру. Внутрибрюшинное введение 100 мкг кисспептина-10 характеризуется достоверным увеличением горизонтальной активности, вертикальных стоек, исследований норок и пересеченных квадратов (р≤0,05), по сравнению с интактными мышами. Остальные показатели не показали достоверных отличий от интактной группы.

Таким образом, эмоционально-исследовательское и двигательное поведения после интраназального введения кисспептина-10 изменялись достоверно и дозозависимо, по сравнению с интактной группой. Внутрибрюшинное введение кисспептина-10 в дозировке в 10 раз превышающей дозировку при интраназальном введении достоверно меньше влияло на поведение животных, что указывает на эффективность интраназального метода доставки кисспептина-10 в ЦНС в более низких дозах по сравнению с периферическими методами введения. 

Рисунок 3 – Результаты теста «Открытое поле» по показателям обнюхивание (I), локомоция (II), вертикальные стойки (III) и стойки с упором (IV)

1. Интактные – Интактная группа животных без воздействия,
2. Физ.р. ВБ – внутрибрюшинное введение физиологического раствора
   3. Физ.р. ИН – интраназальное введение физиологического раствора
   4. Кисспептин ИН 0,1 – интраназальное введение кисспептина-10 в дозировке 0,1 мкг
   5. Кисспептин ИН 1 – интраназальное введение кисспептина-10 в дозировке 1 мкг
   6. Кисспептин ИН 10 – интраназальное введение кисспептина-10 в дозировке 10 мкг
   7. Кисспептин ВБ 1 – внутрибрюшинное введение кисспептина-10 в дозировке 1 мкг
   8. Кисспептин ВБ 10 – внутрибрюшинное введение кисспептина-10 в дозировке 10 мкг
   9. Кисспептин ВБ 100 – внутрибрюшинное введение кисспептина-10 в дозировке 100 мкг

Примечание: * – p≤0,05, ** – p≤0,01, различия между интактными и экспериментальными животными

Figure 3 - Results of the “Open Field” test according to the indicators of sniffing (I), locomotion (II), vertical racks (III) and racks with emphasis (IV)

1. Intact - an intact group of animals without influence,
2. Phys.r. IP - intraperitoneal administration of a physiological solution
3. Phys.r. IN - intranasal administration of physiological solution
4. Kisspeptin IN 0.1-intranasal administration of Kisspeptin-10 in a dosage of 0.1 μg
5. Kisspeptin IN 1-intranasal administration of Kisspeptin-10 in a dosage of 1 μg
6. Kisspeptin IN 10-intranasal administration of Kisspeptin-10 in a dosage of 10 μg
7. Kisspeptin IP 1- intraperitoneal administration of Kisspeptin-10 in a dosage of 1 μg
8. Kisspeptin IP 10- intraperitoneal administration of Kisspeptin-10 in a dosage of 10 μg
9. Kisspeptin IP 100- intraperitoneal administration of Kisspeptin-10 in a dosage of 100 μg

Note: * - p≤0.05, ** - p≤0.01, differences between intact and experimental animals

Рисунок 4 – Результаты теста «Открытое поле» по показателям исследование норок (I), пересеченные квадраты (II), количество болюсов (III) и груминг (IV)

1. Интактные – Интактная группа животных без воздействия,
2. Физ.р. ВБ – внутрибрюшинное введение физиологического раствора
3. Физ.р. ИН – интраназальное введение физиологического раствора
   4. Кисспептин ИН 0,1 – интраназальное введение кисспептина-10 в дозировке 0,1 мкг
   5. Кисспептин ИН 1 – интраназальное введение кисспептина-10 в дозировке 1 мкг
   6. Кисспептин ИН 10 – интраназальное введение кисспептина-10 в дозировке 10 мкг
   7. Кисспептин ВБ 1 – внутрибрюшинное введение кисспептина-10 в дозировке 1 мкг
   8. Кисспептин ВБ 10 – внутрибрюшинное введение кисспептина-10 в дозировке 10 мкг
   9. Кисспептин ВБ 100 – внутрибрюшинное введение кисспептина-10 в дозировке 100 мкг

Примечание: * – p≤0,05, ** – p≤0,01, различия между интактными и экспериментальными животными

Figure 4 - Results of the Open Field test according to the indicators of the study of minks (I), crossed squares (II), the number of pain (III) and grooming (IV)

1. Intact - an intact group of animals without influence,
2. Phys.r. IP - intraperitoneal administration of a physiological solution
3. Phys.r. IN - intranasal administration of physiological solution
4. Kisspeptin IN 0.1-intranasal administration of Kisspeptin-10 in a dosage of 0.1 μg
5. Kisspeptin IN 1-intranasal administration of Kisspeptin-10 in a dosage of 1 μg
6. Kisspeptin IN 10-intranasal administration of Kisspeptin-10 in a dosage of 10 μg
7. Kisspeptin IP 1- intraperitoneal administration of Kisspeptin-10 in a dosage of 1 μg
8. Kisspeptin IP 10- intraperitoneal administration of Kisspeptin-10 in a dosage of 10 μg
9. Kisspeptin IP 100- intraperitoneal administration of Kisspeptin-10 in a dosage of 100 μg

Note: * - p≤0.05, ** - p≤0.01, differences between intact and experimental animals

ОБСУЖДЕНИЕ

В работе впервые показана принципиальная возможность доставки кисспептина-10 в ЦНС при помощи интраназального введения, а также дозозависимость исследованного эффекта препарата. Это подтверждается увеличением горизонтальной и вертикальной двигательной активности (возрастание количества пересеченных квадратов, обнюхиваний, исследований норок) в тесте «Открытое поле» после введения 1 мкг исследованного вещества интраназально по сравнению с интактной группой. При увеличении концентрации кисспептина-10 до 10 мкг достоверно изменяются дополнительно к вышеперечисленным показателям горизонтальная активность и стойки с упором (р≤0,01).  

 В то время как внутрибрюшинное введение кисспептина-10 в дозировках 1 и 10 мкг достоверных различий не продемонстрировало, а введение 100 мкг оказало влияние на показатели норки, пересеченные квадраты, вертикальные стойки и горизонтальная активность по сравнению с интактными мышами (р≤0,05).

Таким образом, тестирование в открытом поле продемонстрировало достоверное повышение исследовательской и двигательной активности у крыс после интраназального введения исследуемого вещества и увеличение эффекта при увеличении дозы. Группа крыс после внутрибрюшинного введения вещества показала достоверные различия в тесте по 4 показателям из 8, в то время как интраназальное введение в дозировке в 10 раз меньше показало изменения по 5 показателям из 8 с большей достоверностью.

В тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт» при интраназальном введении кисспептина-10 0,1 мкг достоверных изменений не наблюдалось. При введении 1 мкг интраназально было отмечено достоверное увеличение двух показателей: времени, проведенного в открытых рукавах и количества свешиваний с рукава (р≤0,05) по сравнению с интактными мышами. После введения 10 мкг исследуемого вещества, наблюдались изменения по трем показателям: количество перебежек между рукавами, время в открытых рукавах и количество свешиваний с рукава (р≤0,01), что указывает на дозозависимый эффект кисспептина-10. Наиболее эффективной концентрацией оказалась 10 мкг.

Внутрибрюшинное введение 1 и 10 мкг кисспептина-10 не влияло на поведение животных, однако введение 100 мкг вызывало увеличение времени проведения в открытых рукавах, количество свешиваний и количество перебежек между рукавами (р≤0,05), данные эффекты сопоставимы интраназальному введению кисспептина в дозировке 1 мкг.

Увеличение данных показателей опосредовано уменьшением тревожности и/или повышением исследовательской активности у группы крыс после интраназального введения кисспептина-10.

По остальным оцениваемым показателям время в закрытых рукавах и число актов груминга достоверных различий между группами выявлено не было.

Таким образом, кисспептин, доставляемый интраназальным методом доставки проникает в ЦНС, в результате чего достоверно изменял поведение в тесте приподнятый крестообразный лабиринт. Эффекты кисспептина-10 при внутрибрюшинном введении сопоставимы интраназальному введению кисспептина в дозировке 1 мкг. Наибольший эффект вызывает интраназальное введение кисспептина в дозировке 10 мкг.

В тесте «Половая мотивация» оба исследуемых показателя продемонстрировали изменения у группы мышей после интраназального метода доставки кисспептина-10. Интраназальное введение фармакологического агента достоверно сократило латентное время и увеличило количество попыток достижения самки самцом у перегородки в дозе 1 мкг (р≤0,05) и 10 мкг (р≤0,01) соответственно по сравнению с интактной группой.

Что касается внутрибрюшинного введения, достоверные изменения наблюдались только после введения 100 мкг и только по одному показателю. Наблюдалось уменьшение латентного времени (р≤0,05) по сравнению с интактной группой мышей. Действие кисспептина после периферического введения может быть связано с его опосредованным 

влиянием на половое поведение или проникновением части вещества в центральные структуры. Таким образом, можно предположить, что кисспептин-10 при интраназальном введении проникал в мозг и оказывал центральное действие, за счет чего вызывал повышение половой мотивации у половозрелых самцов крыс по обоим параметрам. Кисспептин-10 заметно усиливал предпочтение крыс самцов к самкам, в то время как внутрибрюшинное введение кисспептина-10 показало изменение по одному из параметров. Результаты настоящего исследования демонстрируют возможность доставки кисспептина в мозг после интраназального введения.

Таким образом, в каждом из трех поведенческих тестов наблюдались достоверные изменения после интраназального введения кисспептина-10, который проявлял дозозависимый эффект. В то время как показатели после внутрибрюшинного введения кисспептина-10 практически не вызывало изменений в поведении при дозах 1 и 10 мкг.

Повышение дозировки до 100 мкг внутрибрюшинно показывало достоверное изменение в поведении, однако не такое сильное, как после интраназального введения вещества в количестве 10 мкг. Суммируя, можно предположить, что интраназальный метод доставки можно рассматривать в качестве метода доставки исследуемых веществ в ЦНС, минуя ГЭБ и заслуживает дальнейшего изучения. Интраназальный метод доставки требовал более низких доз фармацевтического агента для достижения эффектов. 

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Интраназальный путь доставки имеет множество преимуществ и заслуживает дальнейшего изучения. Одним из главных преимуществ метода является обход ГЭБ. В настоящем исследовании впервые было продемонстрировано центральное действие кисспептина-10 на мозг после интраназального введения, в сравнении с группами животных после внутрибрюшинного введения, а также введения физиологического раствора аналогичными способами, и показана дозозависимость наблюдаемого эффекта. Были получены стабильные и дозозависимые эффекты кисспептина-10 на поведение крыс после интраназального введения. Интраназальный кисспептин-10 вызывал достоверное повышение половой мотивации, повышение горизонтальной и вертикальной двигательной активности, уменьшение стресса и увеличение исследовательской активности у половозрелых самцов крыс. Исходя из очевидных эффектов кисспептина-10 после интраназального введения в каждом тесте, можно предположить, что кисспептин-10 проникал в мозг, минуя ГЭБ и оказывал центральное действие. Данные подтверждают потенциальную возможность и значимость данного способа доставки для регуляции полового поведения и для воздействия процессы эмоциональной природы (например, уменьшение тревожности).

Вторым преимуществом интраназального пути доставки является низкая дозировка активного вещества. В данной работе использовали 3 дозы кисспептина-10 интраназально, которые меньше внутрибрюшинных доз в 10 раз. Даже высокая концентрация вещества не показала значительных изменений в поведении при периферическом введении, в отличие от интраназального введения.

Создание интраназальных лекарственных препаратов для лечения заболеваний ЦНС - перспективное направление современной фармакологии, но на пути стоит ряд проблем, ограничивающих его применение, это и невозможность интраназального введения некоторых препаратов, и сложность в обеспечении стабильной концентрации интраназальных препаратов, и сложность точного дозирования. В связи с этим, существует большая необходимость в фундаментальных исследованиях интраназального метода доставки.

Об авторах

Мария Владимировна Литвинова

Автор, ответственный за переписку.
Email: litvinova-masha@bk.ru
ORCID iD: 0000-0002-2924-7475

Андрей Андреевич Лебедев

Институт экспериментальной медицины

Email: aalebedev-iem@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0003-0297-0425
SPIN-код: 4998-5204

доктор биол. наук, профессор

Россия, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12

Евгений Рудольфович Бычков

Институт экспериментальной медицины

Email: bychkov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8911-6805
SPIN-код: 9408-0799

канд. мед. наук

Россия, Санкт-Петербург

Петр Дмитриевич Шабанов

Институт экспериментальной медицины; Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова

Email: pdshabanov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1464-1127
SPIN-код: 8974-7477

доктор мед. наук, профессор

Россия, 197022,Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12; 194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, 6

Список литературы