Effects of ghrelin agonist and antagonist on endogenous desacyl-ghrelin content in the brain limbical structures under psychoemotional stress in rats

Platon P. Khokhlov; Хохлов Платон Платонович; Sergey G. Tsikunov; Цикунов Сергей Георгиевич; Ilia Yu. Tissen; Тиссен Илья Юрьевич; Andrei A. Lebedev; Лебедев Андрей Андреевич; Eugenii R. Bychkov; Бычков Евгений Рудольфович; Petr D. Shabanov; Шабанов Петр Дмитриевич

doi:10.17816/RCF15322-27

Эффекты агониста и антагониста грелина на уровень эндогенного дезацил-грелина в структурах лимбической системы мозга при психоэмоциональном стрессе у крыс

Авторы: Хохлов П.П.¹, Цикунов С.Г.¹, Тиссен И.Ю.¹, Лебедев А.А.¹, Бычков Е.Р.¹, Шабанов П.Д.¹
Учреждения:
1. ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»
Выпуск: Том 15, № 3 (2017)
Страницы: 22-27
Раздел: Статьи
Статья получена: 09.10.2017
Статья опубликована: 15.09.2017
URL: https://journals.eco-vector.com/RCF/article/view/7064
DOI: https://doi.org/10.17816/RCF15322-27
ID: 7064

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Статистика

Аннотация

В последние годы показано, что значение грелиновой системы головного мозга не ограничивается только регуляцией энергетического баланса и пищевого поведения. Наряду с другими пептидными регуляторными системами она играет важную роль в механизмах стресса, подкрепления и зависимости. Поэтому элементы данной системы целесообразно рассматривать прежде всего, как молекулярные мишени фармакологического воздействия с целью коррекции состояний зависимости и постстрессорных расстройств.

Методы. В настоящем исследовании для моделирования психоэмоционального стресса применяли острую однократную психотравмирующую ситуацию у самцов крыс Вистар. Животных помещали к тигровому питону, одно животное погибало в результате его пищевых потребностей, остальные крысы переживали ситуацию гибели партнера. После этого крыс забирали из террариума. На следующий день после стрессорного воздействия проводили 7-дневный курс введения препарата грелин или антагониста рецепторов грелина D-Lys3-GHRP-6 (Tocris, UK). Препараты вводили интраназально ежедневно, разовая доза каждого соединения составляла 20 мкл (10 мкл в каждую ноздрю) в концентрации 0,5 мг/мл. После окончания экспериментов животных экспериментальных и контрольных групп декапитировали, выделяли структуры головного мозга и замораживали в жидком азоте для последующего биохимического исследования. Замороженные образцы подвергали гомогенизации и суспендировали. Аликвоты суспензий образцов структур головного мозга исследовали на содержание дезацил-грелина (ДАГ) с помощью высокочувствительного твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА).

Результаты. ДАГ выявлялся во всех исследованных структурах мозга: миндалине, гиппокампе и гипоталамусе. Наибольшую концентрацию ДАГ отмечали в гипоталамусе (р < 0,05), что может служить косвенным подтверждением данных о присутствии в ядрах гипоталамуса грелинсодержащих нейронов. Содержание ДАГ после курса интраназального введения грелина вне стрессорного воздействия повышалось в гиппокампе в 1,5 раза (р < 0,05) и снижалось в гипоталамусе в 2 раза (р < 0,05). Содержание ДАГ после курса интраназального введения антагониста рецепторов грелина D-Lys3-GHRP-6 при этом достоверно снижалось в гипоталамусе в 3 раза (р < 0,05). После стрессорного воздействия наблюдали резкое снижение уровня ДАГ во всех исследуемых структурах мозга (в 8–12 раз, р < 0,01): миндалине, гиппокампе и гипоталамусе. Интраназальное курсовое введение как грелина, так и его антагониста D-Lys3-GHRP-6 не приводило к изменению концентраций ДАГ в исследованных структурах мозга у крыс, подвергавшихся психоэмоциональному стрессорному воздействию.

Заключение. Таким образом, можно предположить, что психоэмоциональный стресс полностью подавляет активность грелиновой системы головного мозга у крыс.

Ключевые слова

дезацил-грелин, D-Lys3-GHRP-6, психоэмоциональный стресс, миндалина, гипоталамус, гиппокамп, ИФА

Полный текст

В ряде исследований было показано, что грелиновая система, помимо регуляции энергетического баланса, потребления пищи и пищевого поведения, играет существенную роль в механизмах подкрепления [1, 5, 15], регуляции стресса и формирования зависимости [9, 11]. Грелиновая сигнальная система включает в себя грелиновые рецепторы (GHSR — growth hormone secretagogue receptor) и две формы грелиновых пептидов [8, 10]. Отличительной особенностью первой из них, так называемой ацилированной формы, является наличие боковой алкильной (ацильной) цепи, чаще всего из 8 членов. Вторая форма, неацилированная, или дезацил-грелин, представляет собой полипептидную цепь из 28 аминокислотных остатков. Процесс ацилирования, то есть превращения второй формы в первую, происходит благодаря активности фермента грелин-О-ацилтрансферазы (ghrelin-O- acyl transferase — GOAT) [8]. Грелиновый ген экспрессирует еще один пептид — обестатин, значение которого еще изучено слабо [8]. Согласно общепринятому мнению между двумя формами грелинов существует равновесие, при этом в плазме крови ДАГ составляет приблизительно 85 %, ацил-грелин — соответственно 15 % [9, 13]. Грелиновый рецептор GHSR относится к группе G-белок-сопряженных рецепторов. Как все рецепторы этой группы, GHSR представляет собой трансмембранный белок из семи доменов [8]. Было высказано предположение, что с рецептором GHSR связывается только ацилированная форма грелина. ДАГ представляет собой биологически неактивную форму и, возможно, предшественник или продукт деградации активного ацилированного грелина. Позднее появились данные, которые свидетельствовали о самостоятельной биологической активности ДАГ, в частности действии ДАГ на миокард [8, 11]. В последнее время были показаны изменения содержания ДАГ в крови и структурах мозга при длительной экспериментальной алкоголизации у крыс [9, 15] и участие грелиновой системы в механизмах подкрепления [1, 15]. Экспериментально продемонстрирована эффективность фармакологической коррекции грелиновой и других нейропептидных систем головного мозга при интраназальном введении синтетических и пептидных рекомбинантных препаратов [3, 4, 14]. Эффективность интраназального введения нейротропных средств была также показана для ряда других препаратов [6, 14]. Анализ литературных и собственных данных свидетельствует об актуальности фармакологических и биохимических исследований грелиновой системы головного мозга. Кроме того, существующие данные позволяют считать, что содержание ДАГ представляет собой характерный показатель состояния грелиновой системы в целом и ее реакции на внешние экстремальные воздействия [9, 15].

Материалы и методы

Эксперименты проведены на белых лабораторных крысах линии «Вистар» массой 200–250 г, полученных из питомника «Рапполово» (Ленинградская область). Животных содержали в стандартных условиях лабораторного вивария с нормированным режимом искусственного освещения.

Для моделирования психоэмоционального стресса использовали воздействие, суть которого состояла в переживании животным обстоятельств гибели партнера от действий хищника [2]. Применяли острую однократную психотравмирующую ситуацию. Группу крыс в количестве 10–15 животных помещали в террариум (размеры 1,2 × 0,7 × 1 м) к тигровому питону. Одно животное погибало в результате его пищевых потребностей, остальные крысы переживали ситуацию гибели партнера. После этого крыс забирали из террариума. На следующий день после стрессорного воздействия животным двух экспериментальных групп проводили 7-дневный курс введения соответственно агониста и антагониста грелина. Препараты вводили интраназально ежедневно, разовая доза каждого препарата составляла 10 мкг в 20 мкл (10 мкл в каждую ноздрю) в концентрации 0,5 мг/мл. В качестве агониста рецептора грелина использовали грелин, а в качестве антагониста — D-Lys3-GHRP-6 (Tocris, Великобритания). Через 2 ч после последнего введения животных экспериментальных и контрольных групп декапитировали, выделяли исследуемые структуры головного мозга (миндалину, гиппокамп и гипоталамус) и замораживали в жидком азоте для последующего биохимического исследования. Замороженные образцы подвергали гомогенизации при температуре жидкого азота с помощью криогенной мельницы Cryomill (Retsch, Германия). Гомогенизацию проводили в течение 3 мин после охлаждения до нужной температуры. Полученные гомогенаты суспендировали в стандартном ЗФР (рН 7,4) с добавлением 0,5 % твин-20. Аликвоты полученной суспензии замораживали до дальнейшего исследования. Размороженные аликвоты суспензий образцов структур головного мозга исследовали на содержание ДАГ с помощью высокочувствительного твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Были использованы системы Unacylated ghrelin (mouse, rat), Express enzyme immunoassay kit (SPI-BIO, Франция) с пределом чувствительности 1 пг/мл. Концентрацию белка в образцах определяли согласно традиционному методу Bredford. Для статистической обработки полученных данных применяли пакеты Stаstistica, v. 6 и Origin, v. 7.5. Нормальность распределений оценивали при помощи критерия Колмогорова – Смирнова, значимость различий между группами — при помощи t-критерия Стьюдента либо U-критерия Манна – Уитни.

Результаты исследований

С помощью высокочувствительного ИФА было выявлено содержание ДАГ во всех исследованных структурах головного мозга. Основные количественные данные представлены в таблице № 1. У животных контрольной группы содержание ДАГ достоверно различалось в разных структурах головного мозга. Минимальное значение отмечено для гиппокампа. Концентрация ДАГ в миндалине оказалась в полтора, а в гипоталамусе — в 3 раза выше, чем в гиппокампе (р < 0,05). Содержание ДАГ после курса интраназального введения грелина (вне стрессорного воздействия) в группе активного контроля повышалось в гиппокампе в 1,5 раза (р < 0,05) и снижалось в гипоталамусе в 2 раза (р < 0,05). Содержание ДАГ после курса интраназального введения антагониста рецепторов грелина D-Lys3-GHRP-6 в группе активного контроля при этом достоверно снижалось в гипоталамусе в 3 раза (р < 0,05).

Таблица 1. Содержание дезацил-грелина (ДАГ, нг/мг белка) в структурах мозга крыс после стрессорного воздействия и курсового введения грелина или его антагониста D-Lys3-GHRP-6 (M ± m)

Группы крыс	Миндалина	Гиппокамп	Гипоталамус
Контрольная группа (интактная)	0,152 ± 0,014	0,105 ± 0,023	0,347 ± 0,017&
Грелин 10 мкг в 20 мкл, интраназально, 7-дневный курс	0,140 ± 0,009	0,170 ± 0,024*	0,149 ± 0,017*
Антагонист грелина 10 мкг в 20 мкл, интраназально,7-дневный курс	0,136 ± 0,033	0,093 ± 0,005	0,125 ± 0,0018*
Психоэмоциональный стресс, через 7 дней	0,020 ± 0,001**	0,020 ± 0,001**	0,018 ± 0,001**
Стресс + грелин 10 мкг в 20 мкл, интраназально,7-дневный курс	0,020 ± 0,001**	0,016 ± 0,001**	0,016 ± 0,001**
Стресс + антагонист грелина 10 мкг в 20 мкл, интраназально, 7-дневный курс	0,020 ± 0,002**	0,016 ± 0,01**	0,016 ± 0,01**
Примечание: р < 0,05; *р < 0,01 относительно контрольной группы крыс; &р < 0,05 относительно гиппокампа

Психоэмоциональный стресс приводил к значительному снижению уровня ДАГ в миндалине, гиппокампе и гипоталамусе. По сравнению с контрольными данными концентрация ДАГ была снижена в 8–12 раз (р < 0,01). Значимых различий между структурами по концентрации ДАГ после стресса отмечено не было. Интраназальное введение препарата грелина значимо не оказывало действия на все исследованные структуры мозга у крыс, подвергавшихся стрессорному воздействию. То же самое отмечено и для антагониста грелинового рецептора D-Lys3-GHRP-6, введение которого не оказывало заметного действия на содержание ДАГ в структурах мозга у крыс, подвергавшихся стрессорному воздействию. Характерны приблизительно одинаковые концентрации ДАГ во всех группах крыс после стресса и во всех исследованных структурах, которые лежат в сравнительно узком интервале 0,015–0,020 нг/мг.

Обсуждение полученных результатов

В настоящих исследованиях с помощью высокочувствительного твердофазного ИФА был выявлен ДАГ во всех исследованных структурах мозга: миндалине, гиппокампе и гипоталамусе. Обращают на себя внимание большие различия в содержании ДАГ в разных структурах мозга в физиологических условиях (контрольная группа). В данной группе животных содержание ДАГ в образцах гипоталамуса оказалось достоверно выше в сравнении с концентрациями ДАГ в других структурах. Относительно высокие концентрации ДАГ в образцах гипоталамуса могут служить косвенным подтверждением данных о присутствии в ядрах гипоталамуса грелинсодержащих нейронов. Данный факт согласуется с данными иммуногистохимических исследований, где было показано наличие грелин-положительных нейронов в ядрах латерального гипоталамуса [8].

Выраженное многократное снижение уровня ДАГ после стресса предъявления хищника может свидетельствовать о том, что грелиновая система и ее составляющие компоненты активно участвуют в сигнальных стресс-зависимых нейронных сетях. Ответ грелиновой сигнальной системы на предъявление хищника отражается на лимбических (определяющих эмоциональный ответ) структурах головного мозга, в частности в гиппокампе, миндалине и гипоталамусе. По-видимому, ДАГ представляет собой элемент грелиновой сигнальной системы, который активно реагирует на психоэмоциональный стресс, причем сходным образам в различных структурах мозга. Исследования последних лет показали ключевую роль грелина в физиологической реакции мозга на стресс, поскольку одна из возможных мишеней грелина в стрессорной реакции — это CRF-продуцирующие нейроны паравентрикулярного ядра гипоталамуса. Существует мнение о родстве между грелином и кортиколиберином, поскольку грелиновые рецепторы были найдены в паравентрикулярном ядре, основном источнике кортиколиберина, и в ядре Вестфаля – Эдингера (Якубовича), месте экспрессии урокортина [5]. В частности, был описан механизм, по которому грелин активирует кортиколибериновые нейроны у мышей. Периферическое или внутрижелудочковое введение грелина значительно потенцировало c-fos-маркер клеточной активации в CRF-продуцирующих нейронах. Более того, центральное введение грелина вызывает гипертрофию и пролиферацию кортикотропных клеток [5]. Активация гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы — это возможный механизм, через который грелин регулирует некоторые физиологические процессы. Активация этой системы может быть важна, когда грелин играет роль защиты против депрессивных симптомов при хроническом стрессе. В опытах на мышах было показано, что у особей с генным нокаутом рецепторов GHSR-социальная изоляция происходила быстрее. Кроме того, грелин повышал экспрессию гена CRF в паравентрикулярном ядре гипоталамуса. Таким образом, возможная роль центрально образованного грелина — это модуляция CRF-продуцирующих нейронов [15].

Вероятно, сильное стрессорное воздействие приводит к подавлению грелиновой системы. Возможное предположение о неэффективности применяемых доз препаратов и способа введения маловероятно, так как интраназальное введение грелина и других нейропептидных препаратов, в том числе в указанных дозах, хорошо зарекомендовало себя в эксперименте и клинике [2, 10].

Выводы

С помощью высокочувствительного твердофазного иммуноферментного анализа дезацил-грелин выявляется во всех исследованных структурах мозга: центральном ядре миндалины, гиппокампе и гипоталамусе. Bысокая концентрация ДАГ в гипоталамусе может служить косвенным подтверждением данных о присутствии в ядрах гипоталамуса грелинсодержащих нейронов.
Психоэмоциональный стресс приводит к резкому (в 8–12 раз) снижению концентраций ДАГ в центральном ядре миндалины, гиппокампе и гипоталамусе мозга крыс.
Интраназальное курсовое введение как препарата грелина, так и его антагониста D-Lys3-GHRP-6 не приводит к изменению концентраций ДАГ в исследованных структурах мозга у крыс, подвергавшихся психоэмоциональному стрессорному воздействию.

Об авторах