Biological activity of fullerenes - reality and prospects

Full Text

Введение

Изучение молекулярных механизмов взаимодействия в биологических системах — очень важная и очень интересная задача. Особую ценность имеют исследования с использованием принципиально новых и оригинальных структур. К таким структурам относятся наноструктуры углерода, открытые немногим более 30 лет тому назад. В настоящее время они представлены фуллеренами, нанотрубками, нанохорнами, наноалмазами и графеном. Все эти наноструктуры в той или иной степени рассматриваются как возможные синтоны при создании биологически активных веществ [1].

Особое место среди наноструктур занимают фуллерены. Это связано с тем, что они, и только они, представляют собой молекулярную форму углерода. Следовательно, как и всякие молекулы, они характеризуются молекулярной массой и стабильностью состава. Наиболее легко получается и поэтому широко используется наименьший по размеру фуллерен С60, затем фуллерен С70. Среди других выделенных и хоть минимально изученных фуллеренов можно упомянуть С74, С76, С78, С80, С82 и С84 и т. д.

Биологические свойства представителей любого класса соединений определяются их физическими и химическими свойствами. Однако это не совсем так в приложении к наноструктурам углерода вообще и фуллеренам в частности. Суть проблемы заключается в том, что, работая с ними, мы переходим от «обычных» систем к системам наноразмеров. А хорошо известно, что в области наномира действуют иные законы, согласно которым свойства вещества зависят не только и не столько от его  состава, сколько от геометрии, формы и размера наночастиц [2]. В частности, фуллерены, склонность к агрегации которых высока за счет поверхностных липофильных атомов, способны действовать на живые системы и как отдельные молекулы, и как нано частицы. Именно поэтому фуллерены назы вают символом нанонауки [3]. Так как все на ноструктуры углерода, за исключением наноалмазов, построены из атомов углерода в sp2-гибридизации, то и некоторые свойства у них одинаковые, как, например, характерное проявление фотодинамических свойств при освещении видимым светом [4].

Строение и свойства фуллеренов

Фуллерены занимают особое место среди других наноструктур углерода, так как они представляют собой единственную молекулярную форму углерода, то есть химическое соединение. Уникальность фуллеренов как класса химических соединений определяется особенностями их строения, а именно тем, что они представляют собой выпуклые замкнутые многогранники, образованные только четным числом атомов углерода в sp2-гибридизации, состоящие из шести- и пятичленных циклов. Они представляют собой чистый углерод, поскольку у всех других углеродных структур (алмаза, графита и т. п.) внешние валентности атомов углерода, находящихся на поверхности кристаллов, насыщены за счет присоединения инородных атомов или групп (H, OH и т. п.). Фуллерены же состоят исклю чительно из атомов углерода, и, в отличие от других наноструктур, в фуллеренах все атомы углерода связаны только с атомами углерода. Можно сказать, что фуллерены — это химические соединения, состоящие из одинаковых молекул, тогда как остальные углеродные наноструктуры — это материалы [2]. К «исключениям», казалось бы, можно отнести лишь замкнутые однослойные нанотрубки. Но в действительности эти замкнутые углеродные структуры следует рассматривать как фуллерены, но не сферической, а цилиндрической, палочко образной формы.

Как уже указывалось выше, молекулы фуллеренов построены из гекса- и пентагонов, образованных атомами углерода в sp2-гибридизации, то есть из фрагментов ароматических структур, и должны бы проявлять свойства ароматических соединений. Вначале так и казалось — ведь молекула фуллерена С60 была открыта на «кончике пера» в двух независимых работах [5, 6]. И один из первооткрывателей, Е. Осава, считал ее суперароматичной. Однако в действительности фуллерены являются не ароматическими, а алициклическими сопряженными полиненасыщенными системами, для которых характерны реакции присоединения.

Еще одно уникальное свойство фуллеренов — это существование в молекуле внутренней полости. Так как сами молекулы фуллеренов небольшие (например, молекула С60 в диаметре всего около 1 нм [7]), то и внутренние полости невелики. Туда помещаются лишь отдельные атомы или небольшие атомные кластеры. Такие соединения называются эндо эдральными фуллеренами. Необходимо подчеркнуть, что никакие молекулы, тем более биологически активные, поместить внутрь фуллеренов (даже относительно больших типа С84) невозможно. Например, в случае фуллерена С60 это могут быть атомы (именно атомы, а не молекулы) водорода и гелия. Подробности получения эндофуллеренов см. ниже.

Прежде чем перейти к конкрентным примерам, остановимся коротко на некоторых проблемах номенклатуры. Так как для молекул фуллеренов возможны только реакции присоединения, то, соответственно, молекула замещенной быть не может и заместителей в ней быть не может. Поэтому  экзо производные фуллеренов, то есть имеющие какие-либо радикалы снаружи углеродного кора, называются функционализированными производными (или аддуктами), а сами «заместители» — аддендами.

На сегодняшний день наиболее доступен и поэтому наиболее изучен, в том числе и с точки зрения биологических свойств, фуллерен С60.

Одним из физических свойств молекул фуллеренов является то, что при облучении видимым светом они переходят в возбужденное триплетное состояние (3С60*). Такая молекула может играть роль фотосенситизатора, так как способна передавать энергию молекуле обычного триплетного кислорода 3O2, превращая его в синглетный кислород 1O2. В биологических системах в присутствии доноров электронов могут образовываться и другие активные формы кислорода (АФК) [8].

С химической точки зрения поведение фуллеренов определяет наличие в молекулах сопряженных, и к тому же напряженных, связей. Поэтому наиболее важным свойством является электронодефицитность этих молекул, приводящая к необычайной легкости присоединения свободных радикалов. Молекула фуллерена С60 способна присоединять до 15 радикалов, что позволило даже назвать ее «губкой для радикалов». Причем по силе антиоксидантного действия фуллерен С60 превосходит такой хорошо известный антиоксидант, как витамин С [8]. Следовательно, фуллерен может, особенно в биологических системах, проявлять себя как «двуликий Янус» — быть одновременно и антиоксидантом, и «окислителем».

Еще один важный для проявления биологических свойств параметр фуллерена — липофильность. Вещества, для которых коэффициент распределения log P меньше нуля (высокогидрофильные вещества), легко проходят во внеклеточные области, но не могут проникнуть через мембраны клеток и/или биологические барьеры. Если же величина log P ≥ 0–3 (липофильные вещества), то такие вещества быстро проходят через мембрану и обычно быстро распространяются по всему организму. Дальнейшее повышение этой величины снова приводит к снижению адсорбции вещества, так как резко падает растворимость в воде и становится трудно подвести вещество к мембране. Кроме того, высоколипофильное вещество, попав в мембрану, там и остается, и на этом его распределение по организму заканчивается. Для фуллерена С60 в системах октанол – вода и толуол – вода величины коэффициента распределения равны 6,67 и 8,44 соответственно [9]. Это очень высокие величины, указывающие на высокое сродство молекул к липофильным биологическим фазам. Поэтому следует в принципе ожидать накопления молекул С60 в жировых депо организма. Однако такая высокая липофильность определяет и мембранотропный механизм противовирусного действия фуллерена и его производных [10].

Выше уже отмечалось, что распределение данного вещества, а, следовательно, и его биологические свойства зависят от его липофильности. И изменения последней могут не только менять распределение вещества в организме, но и влиять на спектр его биологического действия. В этом случае молекулы фуллерена могут играть исключительную роль, так как введение сравнительно небольшого по размерам, но высоколипофильного остатка в данную молекулу (аминокислоту, нуклеиновую кислоту, белки и др.) изменяет их функции, обеспечивая встраивание в мембраны, проникновение в клеточные орга неллы и т. д. А образование супрамолекулярных комплексов на основе фуллеренов с терапевтическими агентами может улучшать биодоступность и фармакокинетику последних, что открывает путь к созданию систем адресной доставки лекарственных веществ [11].

В настоящее время объем работ по биологической активности фуллеренов достиг тысяч статей в год. Во многих работах были показаны перспективы эффективного использования фуллеренов в медико-биологических исследованиях.

 

Первая работа, посвященная использованию фуллеренов в медицинской химии, появилась уже в 1993 г. [12]. В ней описывалось производное фуллерена (I), способное стерически блокировать цилиндрическую полость в протеазе вируса СПИДа.

Основная проблема изучения биологических свойств фуллеренов связана с их нерастворимостью в воде и других полярных растворителях. По данным C.T. Jafvert и P.P. Kulkarni [9], растворимость фуллерена С60 в воде составляет 7,96 нг/л (1,11 · 10–11 M), поэтому приходится придумывать различные обходные пути. В настоящее время в литературе описаны введение в биологические системы суспензии микронизированного кристаллического фуллерена (фуллерита), стабильные «гидрофильные» коллоидные дисперсии в воде (наноС60), образование водорастворимых комплексов с полимерами и синтез водорастворимых производных [8].

Суспензия фуллерита с размером частиц примерно от 150 до 1500 нм была использована, например, для определения токсичности фуллерена C60 in vivo. Стабильные коллоидные дисперсии могут быть получены или методом замены растворителей, или же при длительном контакте фуллерита с водой. В случае коллоидных суспензий наноС60 размер частиц лежит в интервале примерно от 50 до 600 нм и зависит от способа их получения. При этом показано, что эти наночастицы несут на поверхности отрицательный заряд и таким образом становятся гидрофильными [8].

Для биологических исследований часто используются водорастворимые полимерные композиции, комплексы включения с фуллеренами, образованные нековалентными взаимодействиями [13].

Хорошо известно, что изменение физико-хими ческих характеристик фуллеренов, переход от инди видуальных молекул к агрегированным формам, приводит к изменению их свойств, что в конечном счете в значительной степени изменяет ответ  биологической системы. Например, в комплексе C60/поли винилпирролидон (С60/ПВП) степень агрегации молекул фуллерена зависит от молекулярной массы ПВП и концентрации фуллерена, а в комплексе C60/гамма-циклодекстрин (С60/2γ-ЦД) молекула фуллерена мономолекулярна [2].

Особое место, конечно, занимает использование водорастворимых ковалентных производных. Если вышеперечисленными методами можно изучать лишь свойства самого фуллерена, свойства его кора, то при использовании производных возможно также изучать влияние введения фуллеренового остатка в биологически активную молекулу или же вообще использовать фуллереновый кор как достаточно нейтральный носитель какого-либо фармакофора.

Растворимость функциональных производных фуллерена (аддуктов) определяется наличием в их молекулах достаточного количества полярных гидрофильных групп, удерживающих гидрофобный остаток фуллерена в растворе и препятствующих ассо циации молекул. Для того чтобы достичь приемлемой для биологических исследований растворимости аддукта фуллерена в воде, необходимо ввести в него как минимум три ионогенные группы [14].

Одним из возможных решений является синтез аддуктов дендримерного типа — соединений, содержащих один (или несколько) разветвленных аддендов, содержащих, в свою очередь, несколько полярных групп. При этом увеличение числа полярных групп достигается не столько количеством введенных аддендов, сколько количеством полярных групп в каждом из них.

Например, соединение (II) содержит 18 карбо ксильных групп и прекрасно растворимо в воде [15]. Хотя, казалось бы, что один адденд не сильно экранирует фуллереновый кор, в действительности его липофильность практически не проявляется, и в растворе соединение (II) существует в виде мономера даже при нейтральных значениях рН. Очевидно, что 18 заряженных групп делают невозможным «слипание» фуллереновых коров.

 

 

В пользу этого предположения говорит и тот факт, что замена только «половины» адденда с 9 заряженными группами на липофильный октадециловый остаток приводит к соединению (III), легко обра зующему крупные кластеры. Если же полимерный адденд вообще не содержит заряженных групп, как в соединении (IV), содержащем две полиэтиленгликолиевые цепи, то такой аддукт практически нерастворим в воде, что почти сводит на нет возможность его использования в биологических экспериментах.

 

 

 

Еще одним примером растворимости таких аддук тов фуллерена может служить моноаддукт (V) с тремя положительными зарядами и триэти ленгликолевыми цепями, растворяющийся в воде до концентрации около 10–5 M, но, к сожалению, склонный к образованию значительного числа агрегатов. Отсю да однозначно следует, что чем менее экранирован фуллереновый кор, тем выше в целом липофильность соединения и его склонность к агрегации.

 

 

Следовательно, подбор аддендов позволяет получать соединения, резко отличающиеся друг от друга как по растворимости и способности к агрегации, так и по химическому строению (заряженные или нейтральные структуры).

В биологических исследованиях очень часто исполь зуются гидроксилсодержащие производные фуллеренов — фуллеренолы. Формула C60(OH)n  отражает общую структуру, в которую входят как  соединения с разным количеством гидроксиль ных групп, так и разные стереоизомеры. Растворимость этих соединений определяется числом гидроксильных групп, введенных в молекулу фуллерена. В во де растворимы соединения, содержащие более 20 групп ОН. Растворимость фуллеренолов C60(OH)36 и C60(OH)44 в воде составляет 17 и 65 мг/мл соответственно. Фуллеренолы, содержащие 10–12 или 12–14 групп ОН, в воде растворяются плохо [16].

К сожалению, существенным недостатком фуллеренолов является плохая воспроизводимость данных, полученных с их использованием. При синтезе фуллеренолов различными методами образуются сложные смеси продуктов с нечетко определенной структурой [16], отличающиеся по растворимости и биологическим эффектам, что, вероятно, отражает неконтролируемые отличия в числе и положении гидроксильных групп, а также возможное присутствие других содержащих кислород групп (=О, O<). Хотя недавно появилась работа, в которой предложен метод определения распределения гидроксильных групп на поверхности кора с помощью рамановской спектроскопии [17].

Производные фуллерена с определенным расположением гидроксильных групп можно получить через хлорпроизводные фуллеренoв С60 и С70 [18]. Однако в этом случае гидроксильные группы отделены от кора линкерами, да и сам метод имеет существенные ограничения по структуре получаемых соединений.

Одним из путей решения проблемы агрегации фуллерена является возможная иммобилизация С60 на поверхности твердой фазы [19], которая предотвращает агрегацию молекул С60 и позволяет регенерировать иммобилизированный фотокатализатор [20].

Индивидуальные молекулы и наночастицы по-разному взаимодействуют с биологическими структурами не только из-за разницы химических свойств, но и просто вследствие различий в размерах. Размеры молекул фуллеренов вполне биологичны (с учетом вандерваальсовых радиусов около 1 нм для фуллерена С60), и это позволяет им легко проникать в молекулы белков. Однако размер агрегированных молекул фуллерена (частицы наноС60 более 50 нм) не позволяет им проникать в молекулы или биологические мембраны, имеющие размеры в несколько нанометров. Поэтому изолированные молекулы фуллерена образуют комплексы включения с белками [21], тогда как частицы наноС60 ведут себя совершенно иначе — они адсорбируют бычий сывороточный альбумин (БСА) на своей поверхности. При этом молекулы белка сорбируются в растянутой конформации. Аналогично процесс происходит и при взаимодействии с нуклеиновыми кислотами. Так, молекулы фуллеренов, содержащие на поверхности аминогруппы, могут образовывать с нуклеиновыми кислотами ионные связи, и полученные комплексы можно использовать для доставки генов. Несмотря на то что частицы наноС60 заряжены отрицательно, ДНК прикрепляются к ним благодаря чрезвычайно сильному π–π-стекинг-взаимодействию между осно ваниями ДНК и наноС60 [22].

Фуллерены в фотодинамической терапии

Свойство молекул фуллеренов (как уже указывалось выше) под действием видимого света переходить в возбужденное состояние, превращая триплетный кислород 3O2 в синглетный 1O2, позволяет использовать их в фотодинамической терапии (ФДТ) в качестве фотосенситизаторов [8].

Фуллерены как фотосенситизаторы имеют ряд серьезных преимуществ, к ним относится в первую очередь высокая фотостабильность. Они могут участвовать в обоих типах фотохимических реакций: типе I, протекающем по свободнорадикальному механизму, и типе II, связанному с образованием синглетного кислорода [23].

Ослабление фотосенситизирующего действия вызывается «самотушением» триплетного состояния С60, в результате чего понижается степень продуцирования АФК [24]. Этим объясняется установленная в биологических системах зависимость фототоксичности производных С60 от их дисперсионного состояния, обусловленного изменением молекулы С60 путем химической модификации или образованием комплекса [23]. В некоторых случаях при длительном взаимодействии фуллерена с водой кластер наноС60 вообще теряет свойства фотосенсибилизатора [20]. Известно также, что хорошо диспергируемые производные С60 легко вызывают окислительный стресс под действием УФ-облучения [23]. Отметим тут же, что снижение (ослабление) антиоксидантной активности при агрегации происходит также из-за «снижения концентрации», уменьшения площади доступной поверхности.

Фотодинамические свойства фуллеренов обусловили широкий фронт исследований их противовирусного и противоракового действия [25, 26]. Неоднократно описано фотодинамическое действие фуллерена для инактивации оболочечных вирусов [10].

Фуллерены проявляют свойства фотосенситизаторов не только в «свободном состоянии», но и в составе сложных комплексов. Так, было показано, что немодифицированный фуллерен C60 проявляет эти свойства, будучи включен как в липосомы с катионной поверхностью, так и в простые липосомы [27].

В некоторых случаях для создания систем для фотодинамической терапии на основе фуллерена полезно использовать полимеры. Так, конъюгат фуллерена С60 с полиэтиленгликолем (ПЭГ) накапливается преимущественно в опухолевой ткани и поэтому может быть использован для избирательного фотодинамического воздействия на опухоль. Эффект зависит от концентрации и дозы облучения и не проявляется без облучения или при облучении в отсутствие фуллерена, подтверждая тем самым, что воздействие на раковые клетки оказывает фуллерен C60 в конъюгате [28].

Оценивать относительную эффективность производных фуллерена С60 как фотосенситизаторов в зависимости от степени функционализации удобно на близких по строению соединениях, например, на трех малонатных производных C60 (VI). На клетках HeLa был установлен следующий ряд эффективности: DMA C60 > TMA C60 > QMA C60 [29]. Тем самым подтверждается вывод о том, что увеличение числа аддендов приводит к снижению фотодинамической активности всей молекулы.

 

 

Достаточно широко исследовались и фотодинамические свойства фуллерена С70. Сравнение ФДТ-активности C60 и C70, инкапсулированного в димиристоилфосфатидил-холиновые липосомы, против клеток HeLa показало, что C70 как фотосенситизатор был в пять раз активнее C60 [30]. При изучении комплекса С70 /2γ-CD было продемонстрировано, что молекулы фуллерена переходят из комплекса в клеточную мембрану, проявляя при этом свойства фотосенситизатора [31]. Описано также использование для фотодинамической терапии функционализированных производных С70 и C84O2 [32], которые в зависимости от длины волны облучения индуцировали апоптоз раковых клеток HeLa, одновременно повреждая митохондрии и лизосомы.

Моно- и поликатионные производные фуллерена С60 типа (VII) и (VIII) эффективны как антимикробные фотосенситизаторы широкого спектра.

 

Изучение связи структуры функционализированных фуллеренов с их антимикробной фотодинамической активностью было проведено K. Mizuno et al. [33]. Применение этих соединений возможно при лечении кожных инфекций, например ран и ожогов, где проникновение облучения в ткань не является проблемой. Однако во многих случаях поглощение и рассеивание облучения биологическими тканями может существенно ограничивать использование метода. Это актуально в случае солидных опухолей, подействовать на которые не удается при использовании коротковолнового облучения (УФ и синий свет). Поэтому для воздействия на глубокорасположенные ткани необходимо применять фотосенситизаторы, поглощающие излу чение в области больших длин волн (в красной  области спектра), и увеличивать поглощение вещества присоединением к нему светособирающей антен ны [34].

Фуллерены как антиоксиданты

Антиоксидантным свойствам фуллеренов посвящено множество обзоров. Фуллерен С60 сам по себе мощная ловушка для радикалов — в основе его антиоксидантных свойств лежит уже упоминавшаяся выше электронодефицитность его молекул и легкость присоединения свободных радикалов. Эта способность фуллеренов, в том числе и в биологических системах, документирована очень хорошо, и не стоит повторяться [8].

Поэтому рассмотрим лишь некоторые примеры. Антиоксидантное действие присуще не только самому фуллерену C60, но и его производным, причем как in vitro, так и in vivo [35]. В частности, фуллерен (в виде наноС60) защищает in vivo печень мышей от действия циклофосфамида [36]. Также гепатопротекторным действием обладают и фуллеренолы С60 и С70 [37].

Относительно широко в качестве антиоксидантов используются нековалентные водорастворимые комплексы с биосовместимыми полимерами — ПВП, ПЭГ, γ-ЦД и др. Эти полимерные композиции фуллерена показали себя мощными ловушками радикалов в клеточных культурах кератиноцитов человека и могут защищать кожу от ультрафиолетового облучения и окислительного повреждения трет-бутилгидропероксидом. Радикальная антиоксидантная активность дендрофуллерена может найти применение в радиа ционной защите в естественных условиях [8].

Известны данные, указывающие на связь антиоксидантного действия фуллерена С60 с продолжительностью жизни. Показано, что пероральное применение раствора фуллерена С60 в оливковом масле удлиняет жизнь крыс [38], причем авторы связывают это с антиоксидантным действием фуллерена.

Производные фуллерена, встроенные в липосомы, легко проникают через кожу, оказывая высокое антиоксидантное действие и не обладая выраженной токсичностью, а гели, содержащие фуллерен, можно использовать для лечения угрей и воспалительных заболеваний, вызванных окислительным стрессом [39]. Такие композиции действуют как ловушки радикалов на клетках кожи, предотвращая повреждение митохондрий и фрагментацию ДНК, не оказывая токсического действия. Именно на этом основано использование фуллерена С60в косметике, в виде Radical Sponge® (комплекс C60/ПВП) [40] либо LipoFullerene® (раствор C60 в сквалане) компании Vitamin С60 Bioresearch Corparation [41]. Эти препараты не обладают фотоцитотоксичностью и прооксидантной активностью, и поэтому применение их совершенно безопасно. Вообще следует отметить, что эта компания была одной из первых, выпустивших на рынок косметику с фуллеренами. На сегодняшний день она выпускает следующие фуллеренсодержащие ингредиенты для создания косметических композиций: это уже упоминавшиеся Radical Sponge® и LipoFullerene®, а также Moist Fullerene™ (набор косметических ингредиентов для приготовления фуллеренсодержащих липосом), Veil Fullerene™ (фуллерен, сорбированный на кремнеземе), раствор фуллерена в органическом растворителе Sun Guard Fullerene™ A и Hair Shiny Fullerene™, содержащий, кроме фуллерена С60, гамма-докозалактон, неионные сурфактанты и другие компо ненты.

Другие применения фуллерена в косметике и дерматологии см. [42].

Фуллерен и биологические молекулы

Для исследований применения фуллеренов в биологии необходимо отдельно рассмотреть их взаимодействие с биологическими молекулами, а именно белками и нуклеиновыми кислотами.

То, что в основе биологических эффектов фуллерена С60 лежит его комплементарное взаимодействие с белком, впервые было высказано в работе [12]. Было показано, что молекула фуллерена чисто стерически блокирует липофильный канал протеазы вируса HIV-1.

Прямое взаимодействие фуллерена с пептидами было впервые показано A. Bianco et al. [43]. Авторы описали «пептидный» рецептор для фуллерена С60 — нонапептид, содержащий шесть остатков α-аминогексановой кислоты, глициновый спейсер и два остатка L-Tyr в положении 2- и 8-, где гидро ксильные группы в боковой цепи были замещены остатками ферроценоила.

Одним из наиболее ярких доказательств спо собности фуллеренов взаимодействовать с бел ками является образование фуллеренспецифических антител. Данные рентгеноструктурного анализа Fab-фрагмента этих антител показывают, что фуллерен взаимодействует с белками по механизму индуцированного соответствия. Гидрофобность фуллеренового кора при образовании комплекса антиген – антитело способствует взаимодействию С60 с неполярными радикалами аминокислот, особенно содержащими ароматические остатки, при возникновении π-π-стекинг-взаимодействия. Следует отме тить, что сам факт образования антител к фуллеренам свидетельствует о неограниченных возможностях иммунной системы, способной узнавать и продуцировать иммунный ответ даже на такую необычную геодезическую структуру, как молекула фуллерена. Но он же свидетельствует и о том, что все-таки фуллерены не чужды организмам [8].

Было показано прямое взаимодействие фуллерена С60 и его производных c белками плазмы крови, в частности сывороточным альбумином. Однако в первых работах нет ни слова об изменении конформаций белковых молекул при взаимодействии с фуллереном. В дальнейшем при использовании фосфорсодержащего водорастворимого производ ного C60Om(ОН)n[C(PO3Et2)2]p (m ~ 8, n ~ 12, p ~ 1) выявили, что связывание с ним вызывает в мо лекуле альбумина существенные конформационные изменения: процентное содержание α-спирали и β-складчатой структуры молекулы белка увеличивается, а β-изгибов становится меньше, что свидетельствует об увеличении компактности белка в процессе ассоциации [8].

Возможные центры докинга молекулы С60 с белковыми структурами (для более чем 1200 структур) с учетом имеющихся экспериментальных данных о взаимодействии белков с фуллереном С60 рассмотрены M. Calvaresi и F. Zerbetto [21]. Существуют опосредованные указания на взаимодействие фуллерена или его производных с белками и в работах, в которых приводятся данные по действию фуллерена и его производных как агонистов или антагонистов различных рецепторов или блокаторов ферментов. Например, показано ингибирование глутатионредуктазы производными фуллерена; фуллеренолы, содержащие 18–20 гидроксилов, являются дозозависимыми антагонистами глута матных рецепторов, ингибируя на 50 % связывание с рецептором, а катионные соли бис-N,N-диметилфуллеропирролидиния — неконкурентные ингибиторы ацетилхолинэстеразы [8]. Среди производных фуллеренов известны ингибиторы ферментов, например тирозин-фосфатазы [44] и полимеразы вируса гепатита [45].

Фуллеренол C60(OH)20 образует комплекс включения с белками микротрубочек, основного компонента цитоскелета [46]. Фуллеренол ингибировал полимеризацию микротрубочек при низких микромолярных концентрациях, образуя комплекс включения фуллеренол – тубулин (9 : 1). Образование водородной связи между фуллеренолом и тубулином вызывало вторичные структурные изменения в тубулине и предотвращало полимеризацию микротрубочек.

Производные фуллерена могут не только ингибировать действие ферментов, но и увеличивать их экспрессию. Так, показано, что концентрация аденозин-А1- и А2А-рецепторов в клетках SK-N-MC увеличивалась после обработки производными фуллерена, при этом существенно не влияя на жизнеспособность клеток [47].

Описаны примеры специфического взаимодействия не только для изолированных молекул фуллеренов, но и для наночастиц. НаноC60 модулирует Ca2+/кальмодулинзависимую протеинкиназу II (CaMKII), мультимерную внутриклеточную серин/треонинспецифичную протеинкиназу, необходимую для трансдукции сигнала Ca2+, конкурируя со взаимодействием субъединицы рецептора NMDA NR2B и CaMKII [48]. Способность наноC60 поддерживать киназную активность CaMKII может в перспективе оказаться полезной для терапевтического использования фуллерена C60.

Установлено, что производные фуллерена С60 способны ингибировать ранние стадии агрегации β-амилоидных пептидов [49–51]. Введение фуллерена в виде наноС60 в гиппокамп защищает нейроны от амилоидоза [52], также антиамилоидную активность могут проявлять и фуллеренолы [53].

Фуллерены и нуклеиновые кислоты

При изуче нии взаимодействия фуллерена с нуклеиновыми кислотами методом молекулярной динамики было показано, что фуллерены прочно связываются с нуклеотидами. При этом в одноцепочечной ДНК происходит значительная деформация нуклеотидов. В отличие от ДНК, связывание C60 с РНК осуществляется только с большими канавками РНК-спирали, стабилизируя структуру РНК или трансформируя конфигурацию от вытянутой к скрученной [54]. Другими словами, методы молекулярной динамики указывают, что молекулы C60могут отрицательно влиять на структуру, стабильность и биологические эффекты молекул ДНК. Правда, не очень понятно, как в реальности доставить изолированную молекулу фуллерена к ДНК или РНК.

Структурные изменения происходят и при инги бировании Taq ДНК-полимеразы производными фуллерена, C60(OH)20 и трисмалонатом C60, что препятствует связыванию ДНК с белком и вызывает инги бирование процесса ПЦР [55].

Изучение комплекса фуллеренола C60(OH)24 с ДНК показало, что фуллеренол связывается с фосфатным скелетом нативной двухцепочечной ДНК и с парами оснований в большой канавке натриевой соли ДНК, усиливая флуоресценцию [56]. Кроме того, водорастворимые фуллеренолы могут связываться с лямбда-ДНК, дозозависимо повышая стабильность ДНК против термической деградации [57].

Фуллерены как мембранотропные соединения

Мембранотропные свойства фуллеренов определяются высокой липофильностью фуллеренового кора. Введение аддендов в кор, при которых сохраняется общая липофильность молекул, лишь незначительно влияет на расположение соединений в мембране: вследствие дисперсионных взаимодействий между высокополяризуемым фуллереновым кором и жесткими углеводородными цепями [58].

Одним из наиболее ярких примеров вклада мембранотропных эффектов в проявление биологической активности является действие изомерных трисмалонатных производных фуллерена С60 — С3 (транс3,транс3,транс3-C63((COOH)2)3) и D3 (e,e,e-C63((COOH)2)3). Оба соединения представляют собой мощные ловушки для гидроксильного радикала и супероксид-анион-радикала. Но уже по нейропротективному, противовирусному действию и действию на культуры тканей они заметно различаются, что вызвано различием их взаимодействия с мембранами [59]. Мембранотропные свойства производных фуллерена определяют и их противомикробное действие [60].

Противовирусное действие, в основе которого лежит взаимодействие с мембранами, фуллерен С60 проявляет также и в составе комплекса с ПВП. Было показано, что этот комплекс ингибирует репродукцию вирусов гриппа и способен ингибировать репродукцию ДНК-содержащих вирусов, в частности вируса простого герпеса (HSV-1). После обработки вируса гриппа типа A комплексом C60/ПВП морфология вируса была изменена: присутствовало большое количество дефектных вирионов и вирионов с поврежденной «кистью» и нарушениями липидной оболочки. Полученные данные позволяют предположить, что комплекс мешает процессу сборки в цикле репликации вируса и блокирует самонастраивание зрелых вирусных частиц [10].

Таким образом, липофильность фуллеренового кора может играть, а в некоторых случаях и играет, решающую роль во взаимодействии фуллерена и его производных с биологическими объектами как in vitro, так и in vivo.

Системы доставки лекарственных веществ  на основе фуллеренов

Важнейшее направление современной химии лекарственных веществ и фармакологии представляет собой адресная доставка лекарственных препаратов, способствующая повышению эффективности их действия за счет оптимизации биораспределения. Уникальные свойства наноматериалов и их биологическая активность могут быть использованы для адресной доставки лекарственных препаратов и вакцин в ЦНС, для борьбы с онко логическими, кардиологическими и другими заболеваниями.

Существуют различные подходы к созданию подобных систем доставки, отличающиеся сложностью структур наночастиц, выступающих в роли «носителя» активного вещества. Одним из возможных носителей лекарственных веществ может служить фуллереновый модифицированный кор. Размер, форма и высокая липофильность фуллерена позволяют его молекуле довольно легко проникать в клетки и представляют собой идеальное сочетание свойств для использования его в качестве вектора для адресной доставки лекарственных веществ и трансфекции генов [2]. Одна из первых работ по медицинской химии фуллеренов была посвящена целенаправленной доставке фуллерена-фотосенситизатора к мишени с помощью олигонуклеотидной последовательности, ковалентно связанной с фуллереновым кором [61]. Для повышения эффективности действия был синтезирован конъюгат фуллерена С60 с 14-мерным олигонуклеотидом — он связывался с одноцепочечной ДНК и фиксировал фотосенситизатор (остаток фуллерена) вблизи ДНК. Естественно, это резко увеличивало эффективность действия. Для увеличения специфичности связывания фуллерена были также синтезированы соединения, содержащие в его молекуле остаток, связывающийся с малой бороздкой ДНК [62].

Для целенаправленной доставки препарата центрального действия гексаметония был использован конъюгат фуллерена С60 с 6-аминогексановой кислотой, образующий ионные пары-комплексы с гексаметонием. В результате образования комплекса высокополярная молекула периферического ацетилхолинового блокатора проникает в ЦНС, блокируя центральные эффекты, вызываемые никотином. Это является свидетельством того, что на основе функционализированной молекулы фуллерена С60 возможно создание систем транспорта полярных веществ в ЦНС [11].

Для расширения возможности использования остатка фуллерена в качестве носителя можно модифицировать его молекулу. Производные фуллерена, не обладающие цитотоксичностью и поглощающиеся клетками, были применены в качестве носителя для противоракового средства паклитаксела и подавляли рост клеток линии MCF-7 рака молочной железы человека [63]. Для обеспечения целенаправленной доставки противоопухолевого препрата доцетаксела (DTX) был создан дендримероподобный переносчик на основе фуллерена С60-PEI-FAc, представлявший собой дендример с внешним слоем из молекул фолиевой кислоты (FAc). Система доставки лекарства была получена введением в корону молекулы доцетаксела. На культивированных раковых клетках РС3 in vitro была показана высокая эффективность проникновения этой системы через клеточные мембраны, усиление апоптоза и повышение противоопухолевого действия. Аналогичное повышение активности по сравнению с немодифицированным DTX было показано в экcпериментах in vivo [64].

Конъюгат трисмалоната фуллерена С70 (TF70) с аптамером R13 представляет собой еще одну систему направленной доставки на основе полинуклеотидов. Он значительно усиливает фотодинамическую активность TF70 по отношению к клеткам карциномы легких человека А549. Этот конъюгат локализуется в липосомах и может продуцировать внутриклеточные АФК, уничтожающие опухолевые клетки [65].

На основе фуллерена возможно также создание модульных несущих систем, состоящих из тройки блоков: терапевтический блок (собственно биологически активный компонент), блок, обеспечивающий направленность действия, и блок, способный увеличивать количество биологически активных фрагментов, которые способна переносить система. В качестве такой системы предложен гексааддукт фуллерена С60, содержащий пять малонатных остатков для связывания двух терапевтических начал (фотосенситизатор пирофеофорбид-α) каждый, то есть всего десять. А шестой спейсер используется для присоединения «адресующего» остатка, в данном случае моноклонального антитела ритуксимаба [66]. Такая модульная система доставки с повторяющимися фрагментами может использоваться в ФДТ и применяться при терапии, где требуется высокая избирательность и сродство к мишени.

Липофильный характер фуллеренового кора можно использовать для создания композитных систем, проникающих через липофильные барьеры. Например, с участием некоторых производных С60С(СООН)2 были созданы системы для переноса богатых аргинином пептидов типа олигоаргининов, проникающих через двуслойные мембраны [67]. Кроме того, на основе фуллеренов можно создавать и средства для трансфекции генов. В качестве примеров можно привести так называемое «двурукое» производное фуллерена (IX) и два положительно заряженных производных — октаамино- и додека аминопроизводных фуллерена С60 [68].

 

 

Еще одна новая система доставки включает в себя фуллереновый кор, соединенный через остаток глицина с N-дезметилтамоксифеном [26].

Тераностики

Тераностики — соединения, объединяющие в одной частице два начала: терапевтическое и диагностическое (визуализирующее). В настоящее время создаются тераностики на осно ве объединения углеродных наноструктур и полимеров [69], а также на основе эндофуллеренов [70].

Фуллерены могут служить и в качестве терапевтических, и в качестве вспомогательных средств при создании тераностиков. При этом благодаря фуллерену тераностики могут быть не наночастицами, как обычно считается, а отдельными молекулами. В качестве примера можно привести метанофуллерен, к циклопропильному циклу которого с по мощью гидрофильных цепочек были ковалентно присоединены две молекулы доксорубицина. Тем самым в одной  молекуле, а не наночастице были объединены и средство доставки, и действующее начало [71].

Еще один противораковый препарат-тераностик был создан на основе фуллеренола С60(ОН)24. Опухоли, в которые вводили препарат, визуализировали с использованием фотоакустической томографии, затем термически обрабатывали ИК-лазером. В результате размер опухоли уменьшился на 72 % уже в первые два часа, а через 20 часов на месте опухоли был только небольшой пузырек [72].

Эндометаллофуллерены

Как уже отмечалось, уникальной особенностью молекул фуллеренов являет ся наличие в них внутренней полости. Однако эта полость относительно невелика и в лучшем случае у фуллеренов размером больше С80 может включать не просто атомы, а группы атомов. Такие соединения были обнаружены одним из открывателей фуллеренов Р. Смолли и названы эндофуллерены [73]. При высокотемпературном испарении стержней из композита La2O3/графита были получены лантансодержащие металлофуллерены [74]. Одна ко в толуол экстрагировался только La@C82, хотя в масс-спектре наблюдались La@C60 и La@C70, но они оказались нестабильны на воздухе и в растворах. Другими атомами, которые включаются в эндофуллерены, могут быть H, He, Ne, Ar, N, Li, Sc, Y, La, Ca, Sr, Ba, так же как и некоторые кластеры, например карбиды металлов, азотсодержащие карбиды металлов, оксиды и сульфиды металлов.

Было показано, что на основе эндометаллофуллеренов (ЭМФ) могут создаваться и противоопухолевые препараты. Так, полигидроксилированный эндоэдральный фуллерен Gd@C82(OH)22 образует в физиологическом растворе частицы размером примерно 22 нм. Эти частицы в дозе 10–7 мол/кг проявляли высокую антинеопластическую активность на мышах, не вызывая токсического действия как in vitro, так и in vivo, ингибировали рост опухолей, вмешиваясь в процессы инвазии опухоли в нормальную мышечную ткань. Это резко отличает их от обычных противоопухолевых препаратов, для которых характерно именно цитотоксическое действие. Эти результаты свидетельствуют о том, что с помощью производных фуллеренов с соответствующим образом модифицированной поверхностью может быть реализована мечта онкологов-химиотерапевтов о создании высокоэффективного, но низкотоксичного противоопухолевого препарата [8]. Противоопухолевые средства могут быть разработаны и на основе ЭМФ, не содержащих радиоактивные атомы, что повышает ценность таких препаратов для лечения рака [75].

Эндометаллофуллерены используются в радиоиммунотерапии [76]. В контрастных агентах для МРТ на основе фуллеренов сочетаются эффективная диа гностика и лечебный эффект. Например, контрастирующий препарат Gd-DTPA-HSA можно модифицировать трисмалонатом С60 [77]. И тогда в действии препарата объединятся оба направления — лечебное (фуллереновый кор как фотосенсибилизатор) и диагностическое (гадолиний как контрастный агент для МРТ). В этом конъюгате HSA и карбоксифуллерен проявляют синергический эффект . Возможна разработка таких препаратов и на основе ЭМФ, включающих радиоактивные атомы, например атома 177Lu [78].

Использование эндофуллеренов для разработки контрастных агентов чрезвычайно привлекательно. Углеродный каркас этих молекул защищает атом металла, предотвращая его высвобождение в организме, поэтому такие агенты нетоксичы. При этом к фуллереновому кору возможно присоединить гидрофильные функциональные группы и «нацеливающие» агенты. С участием ЭМФ можно получать контрастные агенты не только для различных типов томографии, но и для других методов исследований. Применение ЭМФ подробно рассмотрено в обзо ре [79].

Токсичность, биостабильность и биораспределение фуллеренов и их производных

Литература по изучению токсичности фуллеренов достаточно обширна. Упомянем лишь несколько обзоров [8, 80]. В них делается достаточно однозначный вывод, что сам фуллерен С60 можно отнести к безвредным соединениям. Исключение может составлять лишь ингаляционное воздействие, однако неоднократно показано, что при таком пути введения токсичность связана с размером, формой и плотностью частиц, а не с их составом [81].

Что касается конкретных токсикологических эффек тов фуллерена в организме, то отметим сначала работу N. Gharbi et al. [82], которые изучали действие водной суспензии С60 (~250–1000 нм) при внутрибрюшинном введении. Не было найдено никаких проявлений ни острой, ни хронической токсичности. При этом оказалось, что фуллерен С60 проникает в печень и защищает ее от поражения свободными радикалами (на модели с ССl4). Не обна ружено никаких токсических эффектов и при исследовании токсичности комплекса фуллерена С60 с поливинилпирролидоном (С60/ПВП) [83, 84].

Одним из факторов, осложняющих применение фуллеренов в практических целях, является недостаток данных об их судьбе в организме. Такие иссле дования ведутся, однако их относительно немного. Большинство аналитических методов — ВЭЖХ, масс-спектрометрия и др. — далеко не всегда дают адекватные результаты. Так, если в биологической системе (организме или органе) не найден фуллерен после его введения, это не значит, что его там нет. Чаще всего это связано с методом обработки биологического материала или низкой чувствительностью метода.

Радиоизотопный метод был и остается самым надежным, однако получать меченый фуллерен — задача не простая и не дешевая. Тем не менее с исполь зованием меченого 14С-С60 (X) было исследовано биораспределение in vivo у крыс и показано, в частности, что он проникает в мозг [85].

При пероральном введении соединение (X) очень плохо абсорбируется, в печени и в других органах наблюдаются только следы метки. А почти вся радио активность (до 97 %) выводится с фекалиями через 48 часов. Однако при внутривенном введении через 160 часов выводится только около 5 % активности. Эта фуллереновая кислота «слишком» липофильна для карбоновых кислот и приближается по этому показателю к «обычным» неполярным соединениям. Величина log P для свободной кислоты равна 4,5, что сравнимо с величиной для дифенилэтана (log P 4,8). Исследования биораспределения после внутривенного введения показали, что метка быстро достигает различных органов (печень, селезенка, легкие, почки, сердце и т. д., включая мозг), что указывает на способность (X), несмотря на высокую молекулярную массу (995 Да), проникать через гематоэнцефалический барьер. Как отмечают авторы, высокая липофильность этого карбоксифуллерена приводит к медленной кинетике экскреции и накоп лению в определенных органах [85]. Это вызывает обеспокоенность по поводу возможного возникновения у подобных веществ долговременной токсичности или токсичности после хронического введения, поскольку со временем внутри определенных участков может достигаться токсическая концентрация или самого вещества, или продуктов его деградации.

 

 

Недавно появилось несколько работ, в которых использовался меченый фуллерен С60. Было показано, что у беременных крыс фуллерен 14С-C60, введенный в хвостовую вену в физиологическом растворе, содержащем ПВП, может проникать через плаценту [86].

С использованием 13С-меченого С60 и двух его производных [13C-пирролидинофуллерен-61,63-ди карбоновой кислоты и 13C-С60(OH)x] на мышах было показано, что производные накапливаются в основном в печени, костной и мышечной тканях и коже, тогда как немодифицированный фуллерен в основном накапливается в печени, селезенке и легких. Наблюдаются некоторые различия в зависимости от способа введения (внутривенного, внутрибрюшинного или перорального), но все выводятся через 7 дней. Таким образом, модификация фуллеренового кора оказывает значительное влияние на его биораспределение [87].

V.A. Shipelin et al. [88], после системного введения фуллерена, исследовали состояние внутренних органов-мишений крыс методом лазерной конфокальной микроскопии, окрашивая микропрепараты флуоресцентным красителем, и не обнаружили признаков воспаления.

Следует отметить, что флуоресцентные методы при исследовании биораспределения фуллеренов нужно применять с осторожностью. С одной стороны, это связано и с тем, что фуллерены хотя и обладают свойствами флюорофора, но выражены они очень слабо и практически не могут использоваться [89]. С другой стороны, сам фуллерен может гасить в растворе флуоресценцию флуорофора, например, фульвовой кислоты [90] или порфириновых структур [91]. А в некоторых конъюгатах с флуоресцентными красителями фуллереновый кор способен гасить флуоресценцию связанного с ним остатка [92]. Считается, что это обусловлено перераспределением заряда между фуллереном и флуорофорным остатком и фотоиндуцированным внутримолекулярным переносом электрона [93].

На способности фуллеренового кора тушить флуо ресценцию основана весьма любопытная структура — зонд, описанный K. Xu et al. [94]. Он состоит из двух функциональных фрагментов: флуоресцеина, играющего роль флуорофора и донора электронов, и фуллерена С60, действующего как акцептор электронов и аналог субстрата для трипсина. В присутствии трипсина обнаруживается усиление флуо ресценции, так как комплексообразование остатка С60 с трипсином ингибирует перенос электронов.

Однако C. Schuetze et al. [95] показали, что в N-флуоресцеин-5-изотиоцианате пирролидинофуллерена С60 (XI) тушения флуоресценции не происходит.

 

 

Этот конъюгат захватывается опухолевыми клетками и проявляет фотосенситизирующие свойства. Правда, не очень понятно, почему авторы говорят о проникновении в клетки фуллерена — вышеупомянутый конъюгат нельзя сравнивать с фуллереном, так как остаток флуоресцеина как минимум не меньше остатка фуллерена (что отчетливо видно из приведенного рисунка), и весьма вероятно, что именно он и «протаскивает» фуллерен в клетку.

Работы по изучению ферментативной устойчивости наноструктур углерода ведутся уже в течение нескольких лет. Незамещенный фуллерен С60 очень медленно разлагается в природе — меченый (14С) С60 наблюдается в почве и через 12 недель [96]. Другие наноструктуры углерода (одно- и многостенные нанотрубки, нанохорны и др.) биодеградируют под действием ферментов [97]. Что же касается самого фуллерена С60, то лишь недавно появились прямые доказательства действия на него ферментов млекопитающих [98]. Поэтому следует тщательно исследовать свойства фуллеренов при разработке лекарственных препаратов.

В последнее время появляются новые методы, дающие возможность отслеживать распределение наночастиц в целом и фуллеренов в частности в живых системах. Мощным инструментом, позволяющим получать подробную информацию о взаимодействиях с опухолью и лекарством или наночастицей с течением времени, является прижизненная микроскопия. С использованием этого метода была проведена непрерывная количественная оценка динамики фуллеренов в опухолях и нормальных тканях. В частности, прижизненная микроскопия применялась для изучения внутриутробной кинетики биотрансляции производного C60-ser, вводимого внутривенно, в подкожных опухолях рака груди 4T1-luc в сравнении с нормальной тканью у живых мышей. Конъюгация C60-ser с флуоресцентным красителем PromoFluoro-633 (C60-serPF) позволила отслеживать флуоресценцию и относительную количественную оценку C60-ser in vivo [99]. Авторы считают, что, поскольку этот флуорофор (~ 650 Да) сопоставим по размеру и структуре с низкомолекулярными препаратами для лечения рака, такими как паклитаксел (854 Да), его можно рассматривать как стерически модельный препарат для исследования C60-serPF в качестве носителя лекарственного средства.

Подводя итог обсуждения биораспределения, биодеградации (биостабильности) и токсичности фуллеренов, подчеркнем, что, хотя фуллерен С60 достаточно долго остается в организме неизменным, большинство водорастворимых производных выводятся в течение нескольких недель. Такой длинный период полувыведения должен настораживать, так как биоаккумуляция может в принципе приводить к развитию отсроченных эффектов. Хотя в общем острая оральная, дермальная и ингаля ционная токсичности невелики, еще слишком мало экспериментальных исследований хронической токсичности, репродуктивной токсичности и канцерогенного эффек та. При этом фуллерены и функ цио нализированные фуллерены с более высокой растворимостью могут вести себя по-разному. Поэтому необходимо очень ответственно подходить к исследованию токсичности каждого нового производного фуллерена.

Заключение

В настоящее время фуллерены, их производные и комплексы находят все большее и большее применение. Изучение биологических свойств производных фуллеренов показало, что они обладают следующими видами активности: антиоксидантной, антибактериальной, противораковой, радиозащитной, мембранотропной, могут служить ингибиторами белков, вектором для доставки лекарств, контрастирующими агентами для МРТ и для фотодинамической терапии. При поиске лекарственных препаратов, изменяя структуру производных фуллерена, возможно обеспечить точную «подстройку» их структуры для получения лекарственного вещества с определенным биологическим эффектом или для создания средств доставки лекарственного препарата к месту воздействия без побочных эффектов в других тканях и органах. При этом остается плохо исследованным вопрос об их биораспределении и метаболизме. И так как все остальные данные свидетельствуют о перспективности дальнейшего развития исследований биологической активности фуллеренов, необходимо, на наш взгляд, усилить работы по исследованию судьбы фуллеренов в орга низме.

About the authors

Marina A. Dumpis

Institute of Experimental Medicine

Author for correspondence.
Email: mardoom@mail.ru

PhD (Chemistry), Leading Researcher, Laboratory of Synthesis and Nanothechnology of Drugs

Russian Federation, Saint Petersburg

Dmitrii N. Nikolayev

Institute of Experimental Medicine

Email: pp225@yandex.ru

Scientific Researcher, Laboratory of Synthesis and Nanothechnology of Drugs, S.V. Anichkov Dept. of Neuropharmacology

Russian Federation, Saint Petersburg

Elena V. Litasova

Institute of Experimental Medicine

Email: llitasova@mail.ru

PhD (Biology), Senior Researcher, Laboratory of Synthesis and Nanothechnology of Drugs, S.V. Anichkov Dept. of Neuropharmacology

Russian Federation, Saint Petersburg

Viktor V. Iljin

Institute of Experimental Medicine

Email: victor.iljin@mail.ru

PhD (Chemistry), Scientific Researcher, Laboratory of Synthesis and Nanothechnology of Drugs, S.V. Anichkov Dept. of Neuropharmacology

Russian Federation, Saint Petersburg

Mariya A. Brusina

Institute of Experimental Medicine

Email: mashasemen@mail.ru

Junior Researcher, Laboratory of Synthesis and Nanothechnology of Drugs, S.V. Anichkov Dept. of Neuropharmacology

Russian Federation, Saint Petersburg

Levon B. Piotrovsky

Institute of Experimental Medicine

Email: levon-piotrovsky@yandex.ru

Dr. Biol. Sci., Professor, Head, Laboratory of Synthesis and Nanothechnology of Drugs, S.V. Anichkov Dept. of Neuropharmacology

Russian Federation, Saint Petersburg

References