Влияние алкоголизации матерей на активность грелиновой системы в пренатальный и ранний постнатальный периоды развития у потомства крыс



Цитировать

Полный текст

Аннотация

Целью настоящей работы явилось изучение уровня дезацилгрелина в сыворотке крови и экспрессии мРНК грелинового рецептора в структурах мозга у крыс в онтогенезе в условиях хронической алкоголизации. Представлены результаты экспериментальных исследований, доказывающие, что пренатальное действие алкоголя негативно влияет на созревание ДА-ергической и грелиновой систем мозга, а так же вовлечение грелиновой системы в механизмы алкогольной зависимости. Наблюдается снижение экспрессии мРНК КОМТ, но увеличение экспрессии Д2 длинной и короткой изоформ ДА-рецепторов и дисбаланс грелиновой системы. Алкоголизация матерей приводит к снижению уровня дезацилгрелина в сыворотке в ранний постнатальный период у плодов, однако экспрессия мРНК рецептора грелина в мозге увеличивается. Хроническая алкоголизация взрослых крыс также влияет на грелиновую систему. В процессе алкоголизации происходит уменьшение содержания дезацилгрелина в сыворотке крови с компенсаторным увеличением экспрессии грелинового рецептора в мозге. В условиях отмены алкоголя наблюдается увеличение содержания дезацилгрелина (тенденция к нормализации).

Полный текст

В головном мозге существует специализированная система нейронов, дофаминергических (ДА-ергических) по своей химической организации, которая опосредует эффекты психостимулирующих средств [3, 4]. Эта система имеет довольно четкую структурно-функциональную организацию и включает передний мозговой пучок, прилежащее ядро, вентральную область покрышки и медиальную префронтальную кору [3, 4, 8]. Она описывается как мезокортиколимбическая система мозга. По сути, эта система является жестко детерминированной исполнительной системой, которая в большинстве случаев отвечает на раздражение активацией (введение психостимуляторов) или угнетением (под действием, например, нейролептиков). Возможности изменения активности мезокортиколимбической системы повышаются при действии на нее различных нейромодуляторов, прежде всего, пептидной природы, рецепторы которых колокализованы на аксонах ДА-ергической проводящей системы [2]. В последние годы в качестве возможного эндогенного нейромодулятора подкрепляющих систем мозга рассматривается нейропептид грелин и исследуется его роль в процессах алкогольной зависимости [10]. Первоначально считалось, что грелиновая система ответственна исключительно за контроль потребления пищи [12] и регуляцию энергетического баланса [6, 12]. Однако последними исследованиями, показано, что система грелина вовлекается не только в регуляцию аппетита, но и в подкрепляющие эффекты наркогенных субстанций [1]. В настоящей работе исследовали уровень грелина в плазме крови и экспрессию мРНК грелинового рецептора в структурах мозга в онтогенезе у крыс, рожденных от алкоголизрованных матерей. Методы исследования В работе использовали 62 крысы Вистар, полученные из питомника Рапполово РАМН (Ленинградская область). Животных содержали в стандартных пластмассовых клетках в условиях вивария при свободном доступе к воде и пище в условиях инвертированного света 8.00-20.00 при температуре 22±2 °C. Все опыты проведены в осенне-зимний период. Самок крыс подвергали полунасильственной хронической алкоголизации 15%-ным раствором этанола в качестве единственного источника жидкости при свободном доступе к брикетированному сухому корму, начиная с 1-го дня беременности до ее окончания (21-22-й день). Половину животных после рождения ими детенышей переводили на водный режим, вторую половину крыс продолжали алкоголизировать до 17-го дня постнатального развития крысят. Контролем служили 17 самок крыс, содержавшихся на обычном водном режиме. Детеныши, рожденные от них, служили контролем крыс, матери которых были подвергнуты алкоголизации. Беременных крыс на 13-й и 17-й дни гестации декапитировали, извлекали плоды, у них выделяли мозг на холоду, немедленно замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -80 °C до проведения анализа. Аналогично выделяли мозг у крысят в возрасте 4-х, 10-ти и 17-ти дней жизни. У крысят так же тотально собирали вытекшую кровь. Суммарную РНК выделяли с использованием реагента TRIzol («Ambion», США) в полном соответствии с инструкцией производителя. Обработку проб ДНКазой проводили с использованием ДНКазы («Promega», США) в полном соответствии с инструкцией производителя. После обработки ДНКазой концентрацию полученной РНК измеряли на спектрофотометре «Implen NanoPhotometer P330» («Implen», Германия), по отношению А260/А280 (в норме ≥ 1,9) оценивали чистоту выделенного препарата. Для последующей работы пробы выравнивали по концентрации РНК. Обратную транскрипцию проводили с использованием M-MuLV обратной транскриптазы («Promega», США). Мультиплексную ПЦР с детекцией в режиме реального времени проводили методом Taq-Man с использованием Taq-полимеразы («Медиген», Россия) и специфических праймеров (табл. 1). Расчет относительной экспрессии грелинового рецептора проводили по методу дельта-дельта Ct (ΔΔCt), используя глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу в качестве нормировочного гена. Относительный уровень экспрессии гена грелинового рецептора рассчитывали по индуктивной формуле R = 2-[ΔΔCt] [7]. Концентрации дезацилгрелина в образцах сывороток крови определяли путем твердофазного иммуноферментного анализа с использованием готовой тест-системы «Rat unacylated ghrelin enzyme immunoassay kit» («SPI-BIO», Франция) в полном соответствии с инструкцией производителя. Для статистической обработки полученных количественных данных и построения графиков применяли пакеты программ GraphPadPrizmv.4; SPSSSigmaStat 3,0 и Minitab 14. В качестве статистических критериев использовали традиционные показатели описательной статистики (однофакторный дисперсионный анализ ANOVA, критерии попарных сравнений групп Стьюдента-Ньюмена-Кейлса и Данна, критерий Краскела-Уоллиса). Для оценки соответствия распределений случайных величин гауссовым применяли критерий нормальности Колмогорова - Смирнова. Различия считали статистически значимыми при значении р < 0,05. Результаты и обсуждение Онтогенез грелиновой системы изучен недостаточно, а влияние алкоголя на ее развитие вообще не освещено в литературе. У грызунов грелин и мРНК рецептора грелина обнаруживаются в эмбрионах уже на стадии морулы и продолжают быть выраженными в процессе внутриутробного развития [5]. У крыс высокий уровень экспрессии мРНК грелина обнаруживается на 12-й день гестации, а на 17-й день плод содержит уже значительные уровни ацилированного и деацилированного грелина в крови [9, 11]. В пренатальный период концентрацию дезацилгрелина определить не удалось в связи с недостаточным количеством крови у плодов для постановки пробы. В наших экспериментах показано, что в раннем постнатальном развитии в физиологических условиях отмечается рост концентрации сывороточного дезацилгрелина (табл. 2). Так, на 4-й день после рождения в контрольной группе содержание дезацилгрелина в сыворотке составляет 5,49 ± 0,09 нг/мл и на 17-й день достигает 9,50 ± 2,29 нг/мл. В группе плодов крыс, рожденных от матерей, употребляющих алкоголь на 17-й день после рождения выявлялось достоверное снижение уровня сывороточного грелина по сравнению с контролем соответственно до 5,36 ± 0,05 нг/мг при алкоголизации во время беременности и кормления и 5,69 ± 0,19 нг/мг при отмене алкоголя после рождения детенышей. Алкоголизация матерей приводит к снижению уровня дезацилгрелина в сыворотке крови в ранний постнатальный период у плодов. Однако экспрессия мРНК грелина в мозге компенсаторно увеличивается только на 17-й день после рождения (табл. 3). Это свидетельствует о нарушении формирования грелиновой системы и ее дисрегуляции. Видно, что в группе плодов, матери которых продолжали потреблять алкоголь после рождения детенышей, изменения были сильнее, чем в группе плодов, матери которых перешли на потребление воды после рождения детенышей (хотя и не достоверно). Таким образом, в раннем постнатальном периоде при алкоголизации происходит дисрегуляция формирования грелиновой системы, что характеризуется снижение уровня грелина сыворотки и увеличением экспрессии мРНК рецептора в структурах мозга.
×

Об авторах

Марат Игоревич Айрапетов

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»

Email: pdshabanov@mail.ru
младший научный сотрудник отдела нейрофармакологии им. С. В. Аничкова

Платон Платонович Хохлов

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»

к. биол. н., старший научный сотрудник отдела нейрофармакологии им. С. В. Аничкова

Евгений Рудольфович Бычков

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»

Email: bychkov@mail.ru
к. м. н., старший научный сотрудник отдела нейрофармакологии им. С. В. Аничкова

Эдгар Артурович Сексте

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»

к. биол. н., старший научный сотрудник отдела нейрофармакологии им. С. В. Аничкова

Наталья Дмитриевна Якушина

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»

аспирант, отдел нейрофармакологии им. С. В. Аничкова

Андрей Андреевич Лебедев

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»

Email: aalebedev-iem@rambler.ru
д. биол. н., профессор, ведущий научный сотрудник отдела нейрофармакологии им. С. В. Аничкова

Никанор Васильевич Лавров

ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М.Кирова»

к. м. н., ассистент кафедры фармакологии

Петр - Шабанов

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»

Email: pdshabanov@mail.ru
д. м. н., профессор, заведующий отделом нейрофармакологии им. С. В. Аничкова

Список литературы

  1. Айрапетов M. И., Сексте Э. A., Хохлов П. П. и др. Влияние хронической алкоголизации и отмены этанола на уровень экспрессии мРНК грелинового рецептора в мозге крыс. Наркология. 2013; 9 (141): 61-5.
  2. Лебедев А. А., Любимов А. В., Шабанов П. Д. Механизмы возобновления потребления наркогенных веществ. Обз. по клин. фармакол. и лек. терапии. 2011; 9 (4): 3-17.
  3. Beaulieu J. M., Gainetdinov R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol. Rev. 2011; 63(1): 182-217.
  4. Bjorklund A., Dunnett S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 2007; 30 (5): 194-202.
  5. Kawamura K., Sato N., Fukuda J. et al. Ghrelin inhibits the development of mouse preimplantation embryos in vitro. Endocrinology. 2003; 144: 2623-33.
  6. Lall S., Tung L. Y. C., Ohlsson C. et al. Growth hormone (GH)-independent stimulation of adiposity by GH secretagogues. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001; 280 (1): 132-8.
  7. Livak K. J., Schmittgen T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-[ΔΔCt] method. Methods; 2001: 25: 402-8.
  8. Missale C., Nash S. R., Robinson S. W. et al. Dopamine receptors: from structure to function. Physiol. Rev. 1998; 78: 189-225.
  9. Nakahara K., Nakagawa M., Baba Y. et al. Maternal ghrelin plays an important role in rat fetal development during pregnancy. Endocrinology. 2006; 147: 1333-42.
  10. Perello M., Sakata I., Birnbaum S. et al. Ghrelin increases the rewarding value of high-fat diet in an orexin-dependent manner. Biol. Psychiatry. 2010; 67 (9): 880-6.
  11. Torsello A., Scibona B., Leo G. et al. Ontogeny and tissuespecific regulation of ghrelin mRNA expression suggest that ghrelin is primarily involved in the control of extraendocrine functions in the rat. Neuroendocrinology. 2003; 77: 91-9.
  12. Wren A. M., Small C. J., Ward H. L. et al. The novel hypothalamic peptide ghrelin stimulates food intake and growth hormone secretion. Endocrinology. 2000; 141 (11); 4325-8.

© Айрапетов М.И., Хохлов П.П., Бычков Е.Р., Сексте Э.А., Якушина Н.Д., Лебедев А.А., Лавров Н.В., Шабанов П.-., 2015

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 65565 от 04.05.2016 г.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах