Сравнительная оценка антиконвульсантной активности кумаринов умбеллиферона, oбтусифола и отвара из надземной части Haplofillum obtusifolium

Полный текст

Более полутора сотен лекарственных растений используют в традиционных медицинах стран Азии и в народных медицинах для лечения больных эпилепсией. Однако фитотерапия этих больных в научно-европейской медицине не осуществляется. Стандартом является длительное, порою пожизненное назначение синтетических антиконвульсантов, оказывающих отрицательное действие на когнитивно-мнестические функции, адаптивные, творческие, сексуальные потенции человека. Предпринятые нами экспериментальные исследования фармакологических свойств природных соединений, галеновых препаратов из лекарственных растений, относящихся к разным семействам и родам, имеющих твердую репутацию средств, эффективных при эпилепсии, подтвержденную нашими клиническими наблюдениями [1], позволили констатировать отсутствие у последних выраженных антиконвульсантных, но наличие церебропротективных свойств. В традиционных медицинах стран Азии одним из растений рода Haplophyllum, применяемых по широким показаниям [2], но в частности при эпилепcии, является цельнолистник туполистный Haplophyllum obtusifolium Ledeb. Химический состав его приведен в справочнике «Растительные ресурсы СССР» [3]. Из надземной части его фитохимиком Н. Ф. Гашимовым выделены кумарины умбеллиферон и его производное обтусифол [4], которые предположительно могут быть ответственны за эффективность растения при эпилепсии за счет антиконвульсантного действия. Цель исследований: сравнить противосудорожную активность, токсичность, влияние на амнезию условного рефлекса пассивного избегания, нормальное безусловнорефлекторное исследовательское поведение мышей умбеллиферона, обтусифола, отвара надземной части цельнолистника туполистного. Материал и методы исследований Н. Ф. Гашимовым были любезно представлены для исследований спектрографически чистые кумарины (рис. 1). Если обтусифол (хаптусинол) ограниченно растворим в воде (до 0,5 % в холодной, до 1 % при подогревании, возможно выпадение осадка), то умбеллиферон в воде практически не растворим. Поэтому приготавливали для каждого вещества 1 % водную эмульсию, используя в качестве эмульгатора Tween-80. Отвар 1 : 10 надземной части (н. ч.) цельнолистника туполистного (сем. Рутовые) готовили по правилам Государственной Фармакопеи. В контрольных группах вводили энтерально эмульсию Tween-80. Во всех группах использовали не менее 15-20 животных. Cамцам мышей (19-25 г) линии SHR вводили превентивно через зонд в желудок эмульсии кумаринов в дозах 10-250 мг/кг или отвар в дозе 5 г/кг в пересчете на массу воздушно-сухого сырья. Недопустимость парентерального, в частности общепринятого внутрибрюшинного введения галеновых препаратов доказана нами ранее [5]. Существенным аргументом изучения последствий именно энтерального введения препаратов в эксперименте является и тот факт, что в клинической практике предназначаются они для перорального приема. Изучены последствия однократного за 30 мин до опыта и 7-дневного введения препаратов. Общепринятый метод максимального электрошока (МЭШ) несколько модифицирован нами [5]. Вместо неудобных игольчатых, наглазничных электродов разработали пероральные электроды, позволяющие значительно сократить безопасность, время эксперимента, в 2 раза уменьшить параметры тока до 25-30 мА при частоте 50 гц, длительности воздействия 0,1 сек и вызывать тонические судороги у 100 % животных без смачивания электродов и подкожного введения игл. Регистрировали количество выживших, не имевших судорог мышей, а также не утративших условный рефлекс пассивного избегания (УРПИ), выработанный у них за сутки до опыта. УРПИ вызывали общепринятым методом, помещая мышь на ярко освещенную площадку. Уходя сразу же в темное помещение, мышь получала болевое воздействие (электроток на сетке пола) и возвращалась на освещенную арену. Рефлекс вырабатывается с одного предъявления, при повторе ситуации животное в темное помещение не уходит. МЭШ «стирает» память о болевом раздражении и собственно УРПИ [6, 7]. После МЭШ регистрировали также время бокового положения, полной адинамии мышей. Метод внутривенного «титрования» LD100 коразола применяли в его общепринятом варианте: 0,5 % раствор его вводили медленно по 0,1 мл/20 сек в хвостовую вену мыши до наступления судорог. Предупреждение: чувствительность метода снижается при повышении концентрации раствора коразола. Тиосемикарбазид, блокатор синтеза гамма-аминомасляной кислоты, инъецировали мышам внутривенно в дозе 17 мг/кг (супрамаксимальный тест). Учитывали латентный период (ЛП), количество судорожных припадков, время жизни. Раствор стрихнина инъецировали внутрибрюшинно в дозе 2 мг/кг (супрамаксимальный тест). Учитывали ЛП, время жизни. Токсичность препаратов рассчитывали графически по методу Миллера-Тэйтнера [8]. Нейротоксичность регистрировали по подсчету двигательного компонента ориентировочного рефлекса (ДКОР) общепринятым методом «открытого поля», которым служило дно ванночки 30 × 50 см. В течение 3 мин регистрировали количество ориентировочных вставаний (вертикальный компонент ДКОР, наиболее уязвимый) и посещенных четвертей поля (горизонтальный компонент ДКОР). Выбор лекарств, угнетающих ЦНС, по их способности снижать и подавлять ориентировочный рефлекс, павловский рефлекс «что такое?», исследовательское поведение, адаптацию к новизне считаем грубой методической ошибкой. Такие препараты в первую очередь подавляют более уязвимые когнитивно-мнестические функции, интеллектуальные, творческие, сексуальные потенции. Поэтому подавление препаратом адаптации к новизне, безусловнорефлекторного поведения животных, лежащего в основе выживания особи и вида, считаем показателем его нейротоксичности. При статистической обработке результатов использовали преимущественно критерий t-Фишера-Стьюдента, а также контингентный критерий χ2 и другие непараметрические методы статистики [9]. В качестве контрольных препаратов использовали слабый антиконвульсант триметин и бензодиазепиновое производное седуксен (диазепам). Результаты и их обсуждение При энтеральном введении LD50 обтусифола колебалась в значительных пределах. Представление о 50 %-ной летальной дозе вещества как о какой-то постоянной величине ошибочно. LD50 меняется в зависимости от пола, возраста, состояния животных, времени суток, а порою необъяснимо. Поэтому правильнее оценивать LD50 лишь с точки зрения отнесения вещества к группам высоко-, средне- и малотоксичных веществ. Внутрибрющинное, с нашей точки зрения, абсолютно не физиологичное введение позволило установить следующие LD50 обтусифола: 1030 ± 64, 334 ± 20, 334 ± 40 мг/кг (здесь и далее приведены средние ± доверительный интервал). В дозе 120 мг/кг внутрибрюшинно обтусифол вызывает наркоз. Четырехкратное изучение острой токсичности обтусифола при энтеральном введении в казалось бы одинаковых условиях дало следующие цифры LD50: 1280 ± 282, 1455 ± 295, 705 ± 234, 690 ± 96 мг/кг. Следовательно, обтусифол не является высокотоксичным веществом и находится в пограничной зоне средне- и малотоксичных веществ. Те же выводы можно сделать и относительно умбеллиферона, LD50 которого варьировало при энтеральном однократном введении в пределах 745 ± 238-1050 ± 273 мг/кг. Даже минимальные летальные дозы для отвара н. ч. цельнолистника туполистного при энтеральном введении недостижимы. Поэтому продолжили исследование нейротоксичности сравниваемых препратов. Обтусифол в дозе 10 мг/кг внутрь уменьшал количество вставании и переходов в «открытом поле» через 30 мин. до 45 и 47 % от контроля, а через 60 мин. его действие уже не обнаруживалось. В дозе 50 и 100 мг/кг он достоверно угнетал исследовательское поведение соответственно в течение 70 и 90-100 мин. Поскольку в дозах 100-120 мг/кг внутрибрюшинно обтусифол вызывает наркоз, все эти данные позволяют отнести его к нейротоксическим веществам. Умбеллиферон достоверно снижал вертикальный и горизонтальный компоненты ДКОР в дозах 50 и 100 мг/кг на 20 и 40 мин., уступая по нейротоксичности обтусифолу. В единичных опытах и не у всех животных в высоких дозах 250-300 мг/кг внутрибрюшинно умбеллиферон вызывал наркоз. Отвар н. ч. растения не влиял на исследовательское поведение животных, т. е. не проявлял нейротоксических свойств. Результаты, приведенные в таблице 1, позволяют отметить отсутствие антиконвульсантной активности умбелиферона при однократном и 7-дневном введении. Обтусифол в высокой дозе при однократном и недельном введении оказал умеренное противосудорожное действие, уступая в этом отношении триметину, который в дозе 100 мг/кг внутрь однократно предупредил гибель и тонические судороги у 17 из 20 мышей, не влияя на сохранность УРПИ и время адинамии. То же мы наблюдаем и у обтусифола, не увеличившего количество животных, сохранивших УРПИ и не сократившего время адинамии. Очевидно, что антиконвульсантная активность не сопряжена с предупреждением повреждающего действия электротравмы на поведение животных, т. е. с церебропротективной активностью. Отвар надземной части цельнолистника только при 7-дневном введении повысил толерантность мышей к повреждающему действию МЭШ как в отношении выживаемости, конвульсий, так и в отношении амнезии УРПИ и времени адинамии. Эти результаты подкрепляют теорию состояния неспецифической сопротивляемости (СНПС) организма, разработанную отечественным фармакологом Н. В. Лазаревым и его школой [10, 11]. Такое состояние вызывают классические адаптогены и другие растения при хроническом потреблении их препаратов. СНПС характеризуется повышением толерантности к ряду повреждающих воздействий и агентов, что подтверждается результататми, приведенными в таблице 2: отвар н. ч. цельнолистника увеличил LD100 коразола, ЛП судорог и время жизни мышей после инъекции стрихнина при 7-дневном, но не однократном введении. Церебропротективное действие отвара манифестируется защитой исследовательского, безусловнорефлекторного поведения (сохранностью УРПИ у 15 из 20 мышей), укорочением времени бокового положения и адинамии после МЭШ, а также увеличением количества выживших животных (табл. 1). Этими же свойствами можно объяснить и повышение толерантности животных к судорожно-смертельному действию коразола и стрихнина (табл. 2). Кумарины даже в высоких дозах (200-250 мг/кг) при однократном и курсовом введениях не влияли на ЛП судорог, вызванных тиосемикарбазидом, и время жизни животных. Отвар цельнолистника только при 7-дневном, но не однократном введении продлил время жизни с 61,5 ± 5,8 до 89,6 ± 17,2 мин., что сравнимо с действием седуксена в дозе 0,5 мг/кг внутрь однократно. В дозе 2,5 мг/кг седуксен, блокатор NMDA глутаматных рецепторов, полностью защищал всех животных от судорог и гибели при инъекции тиосемикарбазида. Приведенные результаты совпадают со сведениями о депрессивном влиянии на ЦНС различных природных соединений, выделенных из видов цельнолистника [12]. Предположительно сочетание слабых антиконвульсантных и выраженных церебропротективных свойств отвара цельнолистника туполистного легло в основу его применения при эпилепсии в традиционных и народных медицинах. Выводы 1. Антиконвульсантная активность отсутствует у умбеллиферона и слабо выражена у обтусифола даже в высоких дозах. Изученные кумарины проявляют свое нейротоксическое действие, снижая адаптацию мышей к новизне. Обтусифол и умбеллиферон в больших дозах при внутрибрюшинном введении вызывают наркоз. Как антиконвульсанты кумарины не могут конкурировать с триметином и седуксеном. 2. Отвар надземной части Haplophyllum obtusifolium при превентивном энтеральном курсовом 7-дневном введении мышам повышал резистентность мышей к коразолу, стрихнину, тиосемикарбазиду, максимальному электрошоку, увеличивая количество выживших после него животных, сохранивших условный рефлекс пассивного избегания, а также сокращая время адинамии. Экспериментально подтверждена правомерность применения в традиционных медицинах отвара надземной части Haplophyllum obtusifolium при эпилепсии, которое основано на наличии у него церебропротективных свойств.

Об авторах

Олег Дмитриевич Барнаулов

Институт мозга человека им. Н. П. Бехтеревой РАН

Email: barnaulovod@rambler.ru
д. м. н., ведущий научный сотрудник

Список литературы