Некоторые особенности реагирования иммунной системы при новой коронавирусной инфекции COVID-19

Полный текст

АКТУАЛЬНОСТЬ

Результаты научных исследований, касающиеся коронавирусной инфекциии COVID-19, вызванной вирусом SARS-CoV-2, по сей день остаются актуальными [1–3]. Исследования COVID-19, проведенные в разных странах мира, позволили установить наиболее уязвимые для этой инфекции группы населения, изучить течение инфекции и разработать методы профилактики и лечения [4–7].

Инфицирование новым коронавирусом SARS-CoV-2 приводит к развитию острого инфекционного заболевания респираторного тракта с типичными катаральными симптомами и клинически может протекать как сезонные острые респираторные вирусные инфекции. У большинства пациентов с COVID-19 имеются слабые клинические проявления или симптомы средней тяжести, но примерно у 15 % больных развивается тяжелая пневмония, а у 5 % — острый респираторный дистресс-синдром и полиорганная недостаточность [8–11].

В ответ на инфицирование SARS-CoV-2 развиваются защитные реакции, обусловленные активацией врожденного и приобретенного иммунитета и направленные против вируса, однако иммунопатогенез COVID-19 связан с формированием несбалансированного иммунного ответа, в особо тяжелых случаях приводящего к респираторному дистресс-синдрому и нарушению функции легких [11, 12]. Понятие защитных реакций не ограничивается только участием клеточного звена иммунного ответа. Организующей системой, которая формирует и регулирует весь комплекс защитных реакций организма при внедрении патогенов, служат цитокины, осуществляя в рамках иммунной системы взаимосвязь между неспецифическими защитными реакциями и специфическим иммунитетом, действуя в обоих направлениях. Некоторые цитокины в небольших количествах синтезируются постоянно, регулируя различные этапы нормального гемопоэза, однако большинство цитокинов не играют никакой роли в нормальной физиологии организма, они синтезируются лишь при развитии защитных реакций. Цитокины в низких концентрациях нужны для правильного формирования местного воспаления, более высокие дозы вызывают развитие системной воспалительной реакции, но патологически высокие концентрации приводят к развитию так называемого «цитокинового шторма» и гибели организма.

Доказано, что несбалансированный иммунный ответ на вирус, сопровождающийся недостаточным синтезом интерферона в начале заболевания, с последующей гиперпродукцией провоспалительных цитокинов, является причиной неадекватно сильного воспаления в легочной ткани с развитием острого поражения легких. В этой связи мы сочли интересным и важным исследование цитокинового профиля у больных COVID-19 с различными клиническими формами заболевания и у бессимптомных носителей SARS-CoV-2.

Цель исследования — изучение цитокинового звена иммунитета у больных новой коронавирусной инфекцией COVID-19 и возможности использования этих данных для прогнозирования риска развития поражения легочной ткани.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Были обследованы 74 мужчины в возрасте 22–45 лет с диагностированной новой коронавирусной инфекцией COVID-19. Пациенты были разделены на 4 группы в зависимости от степени поражения легочной ткани: группу с бессимптомным течением заболевания (Б/С) составили 19 человек с положительным тестом полимеразной цепной реакции (ПЦР-тестом) на рибонуклеиновую кислоту вируса без клинических признаков инфекции; группу КТ-1 — 19 человек с поражением легочной ткани по результатам компьютерной томографии в объеме 25 %; группу КТ-2 — 23 человека с поражением легочной ткани 50 % и группу КТ-3 — 13 человек с поражением легочной ткани 75 %. Отбор венозной крови для иммунологических исследований осуществлялся трижды — при поступлении в клинику («точка 1», в среднем через 1 нед после появления клинических симптомов заболевания), затем через 7 дней («точка 2») и перед выпиской («точка 3», в среднем через 3 нед после появления клинических симптомов заболевания). Обследованные из группы Б/С попадали в клинику после получения положительного ПЦР-теста и находились в ней в среднем 1,5–2 нед.

Методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием наборов реагентов фирмы «Вектор Бест» определяли концентрации фактора некроза опухоли (TNF), интерферона (IFN)-γ, интерлейкина (IL)-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10.

Математическую обработку результатов исследования проводили на персональном компьютере с использованием стандартного пакета программ STATISTICA for Windows, версия 10.0. Для описания полученных данных использовалось минимальное и максимальное значения показателя, вычислялись медиана (Ме) и квартильный размах. Поскольку распределение значений многих показателей отличалось от нормального, значимость различий оценивали с использованием непараметрического критерия Манна–Уитни и точного критерия Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты анализа основных провоспалительных цитокинов в сыворотке крови больных COVID-19 с различными клиническими формами заболевания приведены в табл. 1.

 

Таблица 1. Концентрация основных провоспалительных цитокинов в сыворотке крови больных COVID-19 с различными клиническими формами заболевания

Показатель (референсные значения)	Группа	Точка 1		Точка 2		Точка 3
		Mе	квартильный размах, min-max	Mе	квартильный размах, min-max	Mе	квартильный размах, min-max
IFN-γ (0–15 пг/мл)	Б/С	0,00	0,00–3,32 0,00–3,60	0,00	0,00–2,48 0,00–2,49	0,63	0,00–3,74 0,00–3,99
	КТ-1	0,00	0,00–0,00 0,00–0,00	0,63	0,00–1,75 0,00–2,66	0,02	0,00–0,36 0,00–3,61
	КТ-2	0,62	0,00–2,14 0,00–6,76	0,00	0,00–1,55 0,00–3,28	0,00	0,00–0,32 0,00–2,72
	КТ-3	0,00	0,00–0,50 0,00–7,10	0,00	0,00–0,30 0,00–3,67	0,00	0,00–0,45 0,00–0,99
TNF (0–6 пг/мл)	Б/С	2,47	1,11–3,36 0,78–3,50	2,70	1,79–2,83 1,65–3,37	2,26	1,69–3,43 0,32–3,75
	КТ-1	2,23	1,81–2,73 1,40–3,19	2,38	1,81–2,85 0,59–4,43	2,77	1,96–2,90 1,82–4,59
	КТ-2	2,73	1,81–3,72 0,65–5,23	2,50	1,64–3,16 0,93–7,29	3,13	2,41–4,56 1,85–6,59
	КТ-3	2,17	1,65–2,99 1,14–6,67	2,39	2,22–3,84 0,84–5,16	2,59	1,86–3,21 1,39–4,32
IL-1 (0–11 пг/мл)	КТ-1	3,79	1,51–5,26 0,27–6,38	1,28	0,50–2,77 0,00–5,24	2,53	1,26–3,52 0,0–5,16
	КТ-2	1,84	0,04–4,41 0,00–9,69	1,07	0,29–2,43 0,00–4,48	0,62	0,36–1,81 0,00–47,78
	КТ-3	0,76	0,00–2,25 0,00–3,40	1,09	0,63–2,27 0,10–3,70	1,50	0,22–3,44 0,00–8,57
IL-2 (0–10 пг/мл)	Б/С	1,36	0,00–1,65 0,00–1,78	0,18	0,15–0,78 0,14–0,83	1,00	0,58–1,33 0,37–1,78
	КТ-1	1,23	0,00–1,65 0,00–1,76	0,87	0,51–1,18 0,34–1,51	0,69	0,33–0,90 0,00–1,54
	КТ-2	1,27	0,25–1,62 0,00–2,84	0,61	0,55–1,15 0,00–2,04	1,05	0,46–1,70 0,00–2,06
	КТ-3	0,91	0,68–1,80 0,20–2,11	0,26	0,00–0,46 0,00–0,80	0,25	0,00–1,02 0,00–1,54
IL-6 (0–10 пг/мл)	Б/С	1,68	1,07–3,44 0,00–6,08	1,39	0,00–2,29 0,00–3,51	2,06	1,68–2,66 1,33–4,89
	КТ-1	2,59	0,68–6,27 0,00–353,00	2,36	0,77–4,47 0,24–5,51	1,21	0,78–1,29 0,00–3,97
	КТ-2	4,03	1,44–7,44 0,00–27,92	1,88	0,67–4,67 0,00–43,98	1,62	1,16–3,70 0,06–59,60
	КТ-3	5,63	1,09–7,78 0,50–482,00	2,39	1,36–19,8 0,64–458,26	1,68	1,45–1,98 0,85–408,50
IL-8 (0–10 пг/мл)	Б/С	4,89	3,45–8,83 1,84–65,89	4,00	3,38–5,72 2,49–269,00	4,66 ± 5,55	3,28–12,40 2,97–16,87
	КТ-1	9,49	3,79–28,07 1,18–385,21	7,99	4,51–13,93 1,86–240,40	6,76	5,97–22,48 0,99–129,10
	КТ-2	16,51	9,89–85,82 0,51–466,39	12,47	8,05–34,33 2,15–89,27	13,91	7,53–31,71 3,57–493,90
	КТ-3	11,74	6,78–17,35 5,41–42,04	17,89	9,58–35,28 2,71–41,78	18,74	7,68–59,43 2,76–453,70

 

Как видно из представленных в ней данных, при поступлении в стационар не только медианные значения концентрации IFN-γ в различных группах не превышали должных значений, но и при персонификации у всех обследованных уровень показателя находился в рамках референсных величин.

Наибольшие индивидуальные значения при поступлении в стационар зарегистрированы в группе КТ-3 (7,10 пг/мл), что было в 2 раза ниже верхнего предела нормальных значений. Статистически значимых различий между группами не было, при дальнейшем наблюдении никаких серьезных изменений концентрации IFN-γ также не отмечено.

INF-γ секретируется клетками как врожденной (натуральные киллеры), так и адаптивной иммунной системы (Т-хелперные лимфоциты первого типа). Секретируемый киллерными клетками IFN-γ повышает экспрессию молекул II класса главного комплекса гистосовместимости на поверхности клеток, усиливает фагоцитоз и механизмы уничтожения.

При репликации вируса в клетке усиливается продукция интерферонов, оказывающих различные эффекты на синтез IFN-γ и вызывающих прекращение синтеза белка в инфицированной клетке, тем самым не допуская продукцию вирусных белков. Продуцируемый Т-хелперными лимфоцитами первого типа IFN-γ участвует в активации цитотоксических Т-клеток и макрофагов, играя важную роль в иммунном ответе на вирусную инфекцию.

Сходная картина наблюдалась при анализе концентрации TNF, одного из важных факторов противовирусной защиты. Медианные значения показателя при поступлении в стационар находились в пределах нормы. Индивидуальные значения показателя незначительно превышали референсные только у одного человека из группы КТ-3 (6,67 пг/мл). Статистически значимых различий между группами не было, при дальнейшем наблюдении никаких серьезных изменений концентрации TNF не отмечено.

Помимо IFN-γ и TNF в нашем исследовании изучалась концентрация следующих провоспалительных цитокинов: IL-1, IL-2, IL-6 и IL-8.

При анализе концентрации IL-1 в сыворотке обследованных при поступлении в стационар установлено, что как медианные, так и индивидуальные значения показателя находились в пределах референсных величин. В группе Б/С данный показатель не определялся. В группе КТ-3 концентрация IL-1 была самой низкой и значимо (р = 0,007) отличалась от уровня, отмеченного в группе КТ-1. При статистической обработке данных значимым фактором риска тяжелого течения заболевания оказалась величина IL-1 ниже 3,58 пг/мл (р = 0,004).

В динамике отмечены незначимые разнонаправленные колебания уровня IL-1, в результате которых при выписке из стационара различия перестали быть значимыми. Самые высокие значения показателя (существенно превышающие нормальный уровень) — 47,78 пг/мл зафиксированы в группе КТ-2 при выписке из стационара.

На следующей стадии развития иммунного ответа решающая роль принадлежит IL-2. Он вырабатывается активированными Т-лимфоцитами и стимулирует деление и рост Т- и В-лимфоцитов, а также стимулирует натуральные киллеры и моноциты. В нашем исследовании медианная концентрация IL-2 при поступлении в стационар во всех группах находилась около нижней границы референсных значений. В динамике значимых изменений не отмечено, и при выписке из стационара уровень IL-2 оставался достаточно низким во всех группах обследованных, индивидуальных значений, превышающих порог нормальных значений, не зафиксировано.

На изучении уровня IL-6 следует остановиться особо. Смертность при коронавирусной инфекции связывают в первую очередь с лавинообразным повышением именно этого провоспалительного цитокина, координирующего иммунный ответ. В нашем исследовании не было зафиксировано смертельных случаев, как и случаев так называемого «цитокинового шторма». Несмотря на достаточно высокий уровень IL-6 у отдельных обследованных, при поступлении в стационар (даже в группе КТ-3) медианные значения показателя находились в пределах нормальных значений, хотя и с широким разбросом показателей, составив 5,63 с квартильным размахом 1,09–7,78 пг/мл. Несмотря на нормальные медианные величины, концентрация IL-6 при поступлении в стационар соответствовала выраженности клинических признаков заболевания, однако статистически значимая разница отмечена только между уровнем показателя в группах Б/С и КТ-2 (р = 0,046). При этом в группе Б/С ни один человек не имел уровня IL-6 выше нормальных значений, в группах сравнения превышение нормального диапазона показателя отмечено у 15–17 % обследованных. Лишь у двоих обследованных концентрация IL-6 многократно превышала порог нормы: у одного из группы КТ-1 отмечен уровень 353,87 пг/мл и у одного из группы КТ-3 — 482,25 пг/мл. В процессе лечения уровень IL-6 несколько снижался, однако при выписке из стационара со значительным улучшением оставался крайне высоким (408,46 пг/мл).

При анализе концентрации IL-8, получены следующие данные. При поступлении в стационар в группе Б/С медианный уровень IL-8 был в пределах нормы (4,89 пг/мл, квартильный размах 3,45–8,83 пг/мл), однако 20 % обследованных этой группы имели повышенный уровень IL-8 (от 14,02 до 65,89 пг/мл). В группе КТ-1 повышенный уровень IL-8 (в том числе многократно, от 10,55 до 385,21 пг/мл) имела половина обследованных, а медианная концентрация находилась на верхней границе референсного интервала и составила 9,49 пг/мл (квартильный размах 3,79–28,07 пг/мл). В группах КТ-2 и КТ-3 зарегистрирован повышенный медианный уровень показателя, а повышенный индивидуальный уровень IL-8 отмечен у 74 % обследованных в группе КТ-2 (от 10,52 до 466,39 пг/мл) и 64 % — в группе КТ-3 (в этой группе превышение было наименьшим, от 10,62 до 42,04 пг/мл). Различия были значимыми между группой Б/С и группами КТ-2 (р = 0,004) и КТ-3 (р = 0,014). При наблюдении в динамике отмеченная ситуация существенно не менялась. Уровень IL-8 в группах КТ-2 и КТ-3 оставался высоким при выписке из стационара. Статистическая значимость различий сохранялась для группы Б/С с КТ-2 (р = 0,015) и КТ-3 (р = 0,029).

Нами также был проведен в динамике анализ противоспалительных цитокинов в сыворотке крови больных COVID-19 с различными клиническими формами заболевания — IL-4 и IL-10. IL-4 продуцируется Т-хелперными лимфоцитами второго типа, является фактором дифференцировки Т- и В-клеток и ограничивает синтез макрофагами провоспалительных IL-1, IL-6, IL-8 и TNF, образование высокоактивных метаболитов кислорода и азота. IL-10 продуцируется Т-хелперными лимфоцитами первого и второго типов, моноцитами, макрофагами и цитотоксическими клетками и имеет широкий спектр действия с выраженным иммуносупрессивным эффектом. В своем ингибирующем действии на клеточный иммунитет IL-10 синергичен с IL-4, обладает способностью подавлять иммунное воспаление и является важнейшим регулятором цитокинов, во многом определяющим направленность иммунных реакций. Результаты исследования приведены в табл. 2. Как следует из представленных в ней данных, медианный уровень противовоспалительных цитокинов находился в пределах нормальных значений.

 

Таблица 2. Концентрация основных противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови больных COVID-19 с различными клиническими формами заболевания

Показатель (референсные значения)	Группа	Точка 1		Точка 2		Точка 3
		Mе	квартильный размах, min-max	Mе	квартильный размах, min-max	Mе	квартильный размах, min-max
IL-4 (0–4 пг/мл)	Б/С	0,79	0,24–1,69 0,00–2,28	0,43	00,00–1,03 0,00–1,20	1,27	0,81–2,48 0,41–3,62
	КТ-1	1,09	0,22–2,17 0,00–2,59	1,16	0,89–5,40 0,66–9,61	2,42	0,52–4,60 0,30–5,11
	КТ-2	1,65	0,29–3,29 0,00–5,89	1,26	0,66–3,99 0,00–5,75	1,10	0,00–2,17 0,00–7,90
	КТ-3	0,95	0,70–1,17 0,63–1,44	0,32	0,00–1,46 0,00–1,86	1,20	0,31–2,07 0,00–3,72
IL-10 (0–31 пг/мл)	Б/С	2,21	0,97–3,60 0,96–4,35	1,47	0,71–2,84 0,17–3,11	0,84	0,11–2,88 0,00–4,05
	КТ-1	4,23	3,75–5,68 1,21–7,32	3,90	3,43–4,81 1,94–5,95	5,11	3,44–6,34 3,15–7,54
	КТ-2	6,46	4,05–8,02 1,18–13,26	4,35	3,18–7,99 1,36–12,89	3,55	2,26–4,75 1,03–10,74
	КТ-3	6,55	3,61–14,41 0,00–22,88	6,03	5,21–10,56 2,17–24,35	5,49	3,56–6,42 2,51–9,73

 

Индивидуальный уровень IL-4, превышающий нормальные значения, при поступлении в стационар отмечен только у двоих обследованных из группы КТ-2 (5,35 и 5,89 пг/мл), причем у одного из них превышение референсных значений сохранялось вплоть до выписки из стационара. При этом статистически значимых различий между группами не зафиксировано. При наблюдении в динамике значительных колебаний уровня показателя не было.

Медианный уровень IL-10 при поступлении в стационар также находился в пределах должного интервала, однако был значимо выше в группах с клинически выраженными признаками заболевания. Статистическая значимость различий между группой бессимптомных больных и группами с клинически выраженными признаками заболевания составила р = 0,046, р = 0,008 и р = 0,025 по сравнению с группами КТ-1, КТ-2 и КТ-3 соответственно.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

У всех обследованных групп установлено низкое содержание провоспалительных цитокинов TNF и IFN-γ, ведущих в ходе реализации противовирусного иммунитета при классическом иммунном ответе; а также низкое содержание IL-1, модулирующего активность нейтрофилов, и низкое содержание IL-2, провоцирующего клональную экспансию клеток адаптивного иммунитета. Уровень провоспалительного цитокина IL-6, считающегося одним из ведущих в патогенезе тяжелых форм СOVID-19, во всех группах в течение всего времени наблюдения находился в пределах нормы, с многократным превышением уровня у отдельных обследованных. Статистически значимой разницы между группами не зафиксировано. Такие результаты, на наш взгляд, объясняются выборкой обследованного контингента. Наши исследования цитокинового профиля проведены у молодых военнослужащих мужчин, не попадающих в группу риска тяжелого развития заболевания. Ни у одного из обследуемых не было таких отягощающих заболеваний, как ожирение, сахарный диабет, хронические болезни сердца и дыхательных путей. Даже в группе КТ-3 не отмечено клинически тяжелого протекания COVID-19. И это еще раз подтверждает как индивидуальность каждого живого организма, так и роль общего состояния иммунитета в возможности противостоять инфекции.

В группах с 50 и 75 % поражением легочной ткани показано увеличение концентрации IL-8, формирующего градиент концентрации для привлечения активированных нейтрофилов. Уровень IL-8 в этих группах был выше нормального, а различия с уровнем, отмеченным в группе с бессимптомной формой инфекции, были значимыми.

Показано, что величина IL-1 ниже 3,58 пг/мл является значимым фактором риска тяжелого течения заболевания.

Во всех группах показано низкое содержание противовоспалительных цитокинов IL-4 и IL-10, при этом значимой разницы между группами не отмечено.

Таким образом, на основании полученных нами данных можно сказать, что у обследованного контингента на фоне выраженных клинических признаков заболевания не выявлено достоверной активации цитокинового звена адаптивного противовирусного иммунитета. Уровни провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови находились в пределах нормальных значений и не имели значимых межгрупповых различий. При сопоставлении полученных данных степень поражения легочной ткани положительно коррелировала с уровнем провоспалительных цитокинов IL-6 (0,169), IL-2 (0,241) и IL-8 (0,228). Отрицательные значимые корреляционные связи выявлены между степенью поражения легочной ткани и концентрацией провоспалительного цитокина IL-1 (–0,459) в сыворотке крови. Увеличение IL-8 в группах с клинически выраженными признаками инфекции косвенно указывает на активацию показателей, характеризующих врожденный иммунитет.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Этическая экспертиза. Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом ФГБВОУ ВО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» (протокол от 07.05.2020).

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией

Об авторах

Олег Вячеславович Протасов

Военно-медицинская академия

Автор, ответственный за переписку.
Email: olegprotasov025@gmail.com
SPIN-код: 8452-9089
Scopus Author ID: 881632

канд. мед. наук, подполковник мед. службы старший научный сотрудник НИЛ (военной терапии) НИО (экспериментальной медицины) научно-исследовательского центра

Россия, Санкт-Петербург

Анна Владимировна Болехан

Военно-медицинская академия

Email: a.bolekhan@gmail.com
SPIN-код: 5182-8600
Scopus Author ID: 572884

канд. биол. наук, старший научный сотрудник НИЛ (лекарственной и экологической токсикологии) НИО (экспериментальной медицины) научно-исследовательского центра

Россия, Санкт-Петербург

Лейла Гусейновна Аржавкина

Военно-медицинская академия; Северо-Западный государственный медицинский университет имени И. И. Мечникова

Email: vanadzor_@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0001-5198-874X
SPIN-код: 8359-4200
Scopus Author ID: 881269

канд. биол. наук, старший научный сотрудник НИЛ (военной терапии) НИО (экспериментальной медицины) научно-исследовательского центра

Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург

Елена Геннадиевна Богданова

Военно-медицинская академия

Email: belena-san@bk.ru
SPIN-код: 7726-8614
Scopus Author ID: 881510

канд. биол. наук, научный сотрудник НИЛ (военной терапии) НИО (экспериментальной медицины) научно-исследовательского центра

Россия, Санкт-Петербург

Александр Алексеевич Чугунов

Военно-медицинская академия

Email: alexandrchugun@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2532-6133
SPIN-код: 3839-7619
Scopus Author ID: 1077745

адъюнкт при 1 кафедре (терапии усовершенствования врачей)

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы