Мутации в генах KRAS и NRASкак биомаркеры в терапии колоректального рака и основные методы их детекции
- Авторы: Бровкина О.И.1, Никитин А.Г.1
-
Учреждения:
- Федеральный научно-клинический центр специализированных видов медицинской помощи и медицинских технологий Федерального медико-биологического агентства
- Выпуск: Том 12, № 1 (2021)
- Страницы: 66-71
- Раздел: Научные обзоры
- Статья получена: 21.03.2021
- Статья одобрена: 31.03.2021
- Статья опубликована: 15.03.2021
- URL: https://journals.eco-vector.com/clinpractice/article/view/63875
- DOI: https://doi.org/10.17816/clinpract63875
- ID: 63875
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Определение статуса мутаций в генах KRAS и NRAS является необходимым требованием в лечении пациентов с колоректальным раком (КРР). Пациенты с определенными мутациями в генах KRAS и NRAS являются резистентными к терапии анти-EGFR-препаратами и имеют медиану выживаемости ниже, чем при WT (wild type) генотипах, что говорит о негативном прогнозе в случае наличия мутаций. На настоящий момент не существует зарегистрированных таргетных препаратов для носителей мутаций в генах KRAS и NRAS, однако ведутся разработки на основе малых молекул. Золотым стандартом выявления мутаций в генах KRAS и NRAS является анализ биопсийного материала в парафиновых блоках. Однако такой метод сопряжен с существенными ограничениями, которые можно обойти с помощью анализа циркулирующей опухолевой ДНК — нового перспективного метода в диагностике КРР.
Ключевые слова
Полный текст
ОБОСНОВАНИЕ
Колоректальный рак (КРР) занимает третье место по распространенности среди онкологических заболеваний в мире [1, 2], однако его диагностика довольно затруднительна в силу ряда ограничений, связанных со сложностью сбора биопсийного материала и его анализа вследствие разрушения морфологии образцов, поэтому значительную часть случаев КРР удается выявить только на поздних стадиях. Кроме того, КРР представляет собой крайне гетерогенную группу, состоящую из подклассов с различными молекулярными и клиническими характеристиками [3–5]. Так, например, пациенты с высоким уровнем микросателлитной нестабильности (high microsatellite instability, MSI-H) имеют отличные от пациентов с низким уровнем MSI этиологию заболевания и протокол лечения [6].
Патогенез КРР основан на нарушении нескольких молекулярных механизмов — аберрантного метилирования, дисрегуляции факторов транскрипции и мутации в онкогенах (KRAS, NRAS, BRAF и PIK3CA) и онкосупрессорах (APC, TP53, SMAD4 и PTEN) [7]. Такие нарушения затрагивают ключевые сигнальные пути, включающие Wnt/β-катенин, рецептор эпидермального фактора роста (epidermal growth factor receptor, EGFR), митогенактивированную протеинкиназу (mitogen-activated protein kinase, MAPK), фосфоинозитид-3-киназу (phosphoinositide-3-kinase, PI3K), суперсемейство Ras-ГТФазы (Ras superfamily of small guanosine triphosphatases) и трансформирующий фактор роста бета (transforming growth factor beta, TGF-β). Перечисленные аберрации можно разделить на две группы:
1) КРР с хромосомной нестабильностью, ассоциированной с потерей функции белка APC и мутациями в генах, кодирующих Wnt- и Ras-сигнальные пути;
2) КРР с микросателлитной нестабильностью, которая часто связана с мутациями в генах системы репарации ошибочно спаренных нуклеотидов (mismatch repair, MMR).
КРР с хромосомной нестабильностью является наиболее распространенной группой. Мутации гена APC инициируют начальные стадии КРР: APC является негативным регулятором β-катенина, а при наличии мутации концентрация β-катенина в цитоплазме существенно вырастает и ведет к активации Wnt-сигнальных путей, которые в свою очередь стимулируют деление и миграцию опухолевых клеток [8].
Трансформация аденомы в карционому происходит при нарушении структуры ГТФаз [9–11]. ГТФазы участвуют в трансдукции внеклеточных сигналов MAPK. Аминокислотная замена в Ras-белках препятствует их гидролизу, вследствие чего активируются белковые каскады: RAF/MEK/ ERK и PI3K-AKT сигнальные пути, отвечающие за клеточный рост и деление [12]. В результате клетка находится в перманентно активированном состоянии, что позволяет ей избежать апоптоза и начать неконтролируемое деление.
В представленном обзоре описаны роль мутаций в генах KRAS и NRAS в лечении пациентов с КРР и мониторинг эффективности таргетной анти-EGFR-терапии, дано сравнение различных методов для выявления мутаций.
МУТАЦИИ В ГЕНАХ KRAS И NRAS ПРИ КОЛОРЕКТАЛЬНОМ РАКЕ
В последнее десятилетие выживаемость пациентов с метастатическим КРР существенно выросла. Такой успех связан с введением в практику лечения таргетных препаратов, таких как моноклональные антитела (MoAbs) против EGFR. Анти-EGFR MoAbs могут быть использованы как в монотерапии, так и в сочетании с традиционной химиотерапией [13]. На настоящий момент для клинической практики одобрены два таргетных анти-EGFR-препарата — цетуксимаб (Erbitux) и панитумумаб (Vectibux), которые, тем не менее, имеют высокую токсичность. Именно поэтому остро стоит вопрос о выявлении целевой группы пациентов, чувствительных к ингибиторам EGFR.
Связывание рецептора внеклеточной части EGFR приводит к блокированию внутриклеточного тирозинкиназного домена и, соответственно, деактивирует сигнальные пути Ras. Обнаружено, что мутации в генах KRAS и NRAS, выявляемые приблизительно у 50% пациентов с КРР, ассоциированы с резистентностью к анти-EGFR-терапии [14, 15]. Более того, последние исследования по развитию резистентности к анти-EGFR-терапии показывают, что у пациентов с диким типом генов KRAS и NRAS возможно наличие небольших субпопуляций клеток, несущих мутации в генах семейства RAS (Retrovirus Associated) [16]. В таких случаях резистентность к MoAbs-терапии стремительно развивается в течение нескольких месяцев.
Наиболее известными онкогенными мутациями являются мутации в экзонах 2, 3 и 4 в генах KRAS и NRAS (табл. 1). При этом KRAS-мутации встречаются чаще, что может быть обусловлено наличием большого количества редких кодонов в гене KRAS, приводящих к снижению трансляции белка [17]. Как правило, пациенты с такими мутациями имеют более агрессивный характер злокачественных новообразований и тяжело поддаются лечению [18]. Именно поэтому в настоящее время идет испытание таргетных препаратов, ингибирующих белки семейства Ras.
Таблица 1 / Table 1
Спектр мутаций в генах KRAS и NRAS
Spectrum of mutations in the KRAS and NRAS genes
KRAS | NRAS | ||||||
Экзон | Кодон | Название мутации | Локация | Экзон | Кодон | Название мутации | Локация |
KRAS | NRAS | ||||||
Экзон | Кодон | Название мутации | Локация | Экзон | Кодон | Название мутации | Локация |
2 | 12 | p.G12A | c.35G>C | 2 | 12 | p.G12A | c.35G>C |
p.G12C | c.34G>T | p.G12C | c.34G>T | ||||
p.G12C | c.33_34TG>CT | p.G12D | c.35G>A | ||||
p.G12D | c.35G>A | p.G12S | c.34G>A | ||||
p.G12F | c.34_35GG>TT | p.G12R | c.34G>C | ||||
p.G12H | c.34_35GG>CA | p.G12N | c.34_35GG>AA | ||||
p.G12R | c.34G>C | p.G12P | c.34_35GG>CC | ||||
p.G12S | c.34G>A | p.G12Y | c.34_35GG>TA | ||||
p.G12V | c.35G>T | p.G12V | c.35G>T | ||||
p.G12I | c.34_35GG>AT | p.G12E | c.35_36GT>AG | ||||
p. G12N | c.33_34GG>AA | 13 | p.G13R | c.37G>C | |||
p.G12L | c.34_35GG>CT | p.G13V | c.38G>T | ||||
p.G12Y | c.34_35GG>TA | p.G13S | c.37G>A | ||||
p.G12F | c.34_35GG>TT | p.G13C | c.37G>T | ||||
p.G12R | c.34_36GGT>AGA | p.G13N | c.37_38GG>AA | ||||
p.G12L | c.34_36GGT>CTG | p.G13Y | c.37_38GG>TA | ||||
p.G12C | c.34_36GGT>TGC | p.G13D | c.38G>A | ||||
p.G12W | c.34_36GGT>TGG | p.G13A | c.38G>C | ||||
p.G12D | c.35G>A | p.G13V | c.38_39GT >T C | ||||
p.G12A | c.35G>C | 3 | 59 | p.A59T | c.175G>A | ||
p.G12V | c.35G>T | p.A59P | c.175G>C | ||||
p.G12fs*3 | c.35delG | p.A59S | c.175G>T | ||||
13 | p.G13C | c.37G>T | p.A59D | c.176C>A | |||
p.G13S | c.37G>A | p.A59G | c.176C>G | ||||
p.G13R | c.37G>C | p.A59V | c.176C>T | ||||
p.G13C | c.36_37TG>AT | 61 | p.Q61H | c.183A>C | |||
p.G13N | c.37_38GG>AA | p.Q61K | c.181C>A | ||||
p.G13I | c.37_38GG>AT | p.Q61L | c.182A>T | ||||
p.G13Y | c.37_38GG>TA | p.Q61R | c.182A>G | ||||
p.G13F | c.37_38GG>TT | p.Q61E | c.181C>G | ||||
p.G13D | c.38G>A | p.Q61K | c.181_183CAA>AAG | ||||
p.G13R | c.37_39GGC>CGT | p.Q61P | c.182A>C | ||||
p.G13A | c.38G>C | p.Q61R | c.181_182CA>AG | ||||
p.G13V | c.38G>T | p.Q61L | c.181_182CA>TT | ||||
p.G13E | c.38_39GC>AA | p.Q61R | c.182_183AA>GG | ||||
2 | 13 | p.G13E | c.38_39GC>AG | 3 | 61 | p.Q61H | c.183A>T |
p.G13D | c.38_39GC>AT | p.Q61Q | c.183A>G | ||||
p.G13V | c.38_39GC>TG | p.Q61L | c.182_183AA>TG | ||||
p.G13V | c.38_39GC>TT | p.Q61_E62>HK | c.183_184AG>CA | ||||
p.G13_V14>DI | c.38_40GCG>ACA | 4 | 117 | p.K117R | c.350 A> G | ||
3 | 59 | p.A59T | c.175G>A | p.K117N | c.351A>C | ||
p.A59S | c.175G>T | p.K117E | c.349A>G | ||||
p.A59P | c.175G>C | p.K117Q | c.349A>C | ||||
p.A59E | c.176G>A | p.K117T | c.350A>C | ||||
p.A59G | c.176G>G | p.K117M | c.350A>T | ||||
p.A59V | c.176G>T | p.K117N | c.351A>T | ||||
p.A59del | c.176_178delCAG | 146 | p.A146P | c.436G>C | |||
61 | p.Q61K | c.181C>A | p.A146T | c.436G>A | |||
p.Q61E | c.181C>G | p.A146V | c.437C>T | ||||
p.Q61*(Ter) | c.181C>T | p.A146S | c.436G>T | ||||
p.Q61H | c.183A>C | p.A146G | c.437C>G | ||||
p.Q61H | c.183A>T | p.A146D | c.437C>A | ||||
p.Q61L | c.182A>T | ||||||
p.Q61P | c.182A>C | ||||||
p.Q61K | c.180_181TC>AA | ||||||
p.Q61R | c.182A>G | ||||||
p.Q61R | c.182_183AA>GT | ||||||
p.Q61Q | c.183A>G | ||||||
4 | 117 | p.K117R | c.350 A> G | ||||
p.K117N | c.351A>C | ||||||
p.K117E | c.349A>G | ||||||
p.K117Q | c.349A>C | ||||||
p.K117T | c.350A>C | ||||||
p.K117I | c.350A>T | ||||||
p.K117N | c.351A>T | ||||||
146 | p.A146P | c.436G>C | |||||
p.A146T | c.436G>A | ||||||
p.A146V | c.437C>T | ||||||
p.A146S | c.436G>T | ||||||
p.A146G | c.437C>G | ||||||
p.A146E | c.437C>A |
Главными соединениями, способными ингибировать белки Ras, считаются малые молекулы — химические компаунды с молекулярной массой не более 900 Дальтон [15]. Однако ингибирование мутантных белков Ras сопряжено с высокой токсичностью для нормальных тканей в силу того, что семейство Ras имеет до 300 субстратов [19]. Другая немаловажная причина для анализа спектра мутаций KRAS и NRAS заключается в том, что часть пациентов с мутациями в данных генах все же оказывается чувствительной к анти-EGFR-терапии. Например, носители мутации G13D оказываются чувствительными к терапии цетуксимабом [20, 21]. Потенциальное объяснение такого феномена заключается в том, что в клетках с G12D-мутацией активируются преимущественно RAF- и PI3K-сигнальные пути, в то время как G12V, G12C или G13D мутации влияют на активацию RAL-сигнальных путей.
Таким образом, анализ наличия и спектра мутаций генов KRAS и NRAS становится необходимым требованием для лечения пациентов с КРР. Однако эффективность различных методов для анализа может существенно отличаться.
МЕТОДЫ АНАЛИЗА МУТАЦИЙ В ГЕНАХ KRAS И NRAS
На сегодняшний день золотым стандартом диагностики КРР является колоноскопия — инвазивный метод, сопряженный с существенным неудобством для пациента и высокой себестоимостью.
Другим подходом к диагностике КРР является молекулярно-генетический анализ биопсийного материала пациента в парафинизированных образцах, фиксированных в формалине (FFPE-блоки) [22], однако метод, так же связанный с инвазивной процедурой (биопсия опухоли), может иметь ложноотрицательные результаты анализа вследствие того, что опухолевые клетки в биопсийном материале могут отсутствовать или содержаться в крайне низком количестве. Гетерогенность опухоли в большинстве случаев обусловливает различные молекулярно-генетические профили, что является еще одним ограничением метода. Наконец, сама подготовка и фиксация материала приводит к значительной деградации и ухудшению качества анализируемой ДНК, поэтому исследование биопсийного материала не всегда дает полное представление об этиологии, а оценка динамики развития злокачественных новообразований невозможна.
В связи с этим в настоящее время активно развивается новое направление в диагностике — жидкая биопсия. В данном случае анализируется опухолевая ДНК, циркулирующая в кровотоке пациента (цДНК). При этом не требуется проведения классической биопсии, а для анализа берется венозная кровь пациента. За счет лизиса опухолевых клеток количество опухолевой цДНК в плазме увеличивается: это увеличение особенно заметно на поздних стадиях развития заболевания. На ранних стадиях количество клеток с мутациями не так велико, поэтому необходимо использовать достаточно чувствительные методы [23], например избирательное выявление мутантного аллеля методами цифровой полимеразной цепной реакции (ПЦР) или подавление амплификации последовательностей дикого типа при ПЦР в режиме реального времени. Возможность подавлять амплификацию последовательностей дикого типа появляется при использовании комплементарных LNA-олигонуклеотидов (locked nucleic acids), где вместо обычных присутствуют основания с замкнутым кольцом рибозы в позициях С2 и С4 и метильная группа. За счет этого повышается температура плавления цепей примерно на 20°С по сравнению с обычными нуклеотидами, поэтому в реакции амплифицируется только мутантный аллель.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Мутации в генах KRAS и NRAS являются наиболее значимыми прогностическими и терапевтическими биомаркерами у пациентов с КРР. Наличие мутантного аллеля в одном из этих генов говорит о неблагоприятных прогнозах для пациента и нечувствительности к анти-EGFR-терапии. В настоящий момент не существует официально зарегистрированного препарата, ингибирующего ГТФазы Ras, однако анализ мутаций позволяет выявить группу пациентов, отвечающих на анти-EGFR-терапию.
Жидкая биопсия является перспективным направлением для анализа мутаций в генах KRAS и NRAS. Цифровая ПЦР либо ПЦР с подавлением амплификации последовательностей дикого типа обладает необходимой чувствительностью для анализа опухолевой цДНК и позволяет избежать ограничений, связанных с исследованием биопсийного материала в FFPE-блоках.
В настоящий момент времени остро стоит вопрос о стандартизации методов анализа опухолевой цДНК и введении их в клиническую практику.
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
Участие авторов. О.И. Бровкина — анализ литературных источников, написание статьи; А.Г. Никитин — анализ литературных источников, редактирование. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).
Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.
Об авторах
Ольга Игоревна Бровкина
Федеральный научно-клинический центр специализированных видов медицинской помощи и медицинских технологий Федерального медико-биологического агентства
Email: brov.olia@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-0946-7331
SPIN-код: 3631-1397
к.б.н.
Россия, 115682, Москва, Ореховый бульвар, д. 28Алексей Георгиевич Никитин
Федеральный научно-клинический центр специализированных видов медицинской помощи и медицинских технологий Федерального медико-биологического агентства
Автор, ответственный за переписку.
Email: avialn@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9762-3383
SPIN-код: 3367-0680
к.б.н.
Россия, 115682, Москва, Ореховый бульвар, д. 28Список литературы
- Haggar FA, Boushey RP. Colorectal cancer epidemiology: incidence, mortality, survival, and risk factors. Clin Colon Rectal Surg. 2009;22(4):191–197. doi: 10.1055/s-0029-1242458
- Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R, et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer. 2015;136(5):E359–386. doi: 10.1002/ijc.29210
- Pancione M, Remo A, Colantuoni V. Genetic and epigenetic events generate multiple pathways in colorectal cancer progression. Pathol Res Int. 2012;2012:509348. doi: 10.1155/2012/509348
- Bishehsari F, Mahdavinia M, Vacca M, et al. Epidemiological transition of colorectal cancer in developing countries: Environmental factors, molecular pathways, and opportunities for prevention. World J Gastroenterol. 2014;20(20):6055–6072. doi: 10.3748/wjg.v20.i20.6055
- Kondo Y, Issa JP. Epigenetic changes in colorectal cancer. Cancer Metastasis Rev. 2004;23(1-2):29–39. doi: 10.1023/a:1025806911782
- Cohen R, Pudlarz T, Delattre JF, et al. Molecular targets for the treatment of metastatic colorectal cancer. Cancers (Basel). 2020;12(9):2350. doi: 10.3390/cancers12092350
- Issa JP. Colon Cancer: It’s CIN or CIMP. Clin Cancer Res. 2008;14(19):5939–5940. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-08-1596
- Kwong LN, Dove WF. APC and its modifiers in colon cancer. Adv Exp Med Biol. 2009;656:85–106. doi: 10.1007/978-1-4419-1145-2_8
- Linardou H, Briasoulis E, Dahabreh IJ, et al. All about KRAS for clinical oncology practice: gene profile, clinical implications and laboratory recommendations for somatic mutational testing in colorectal cancer. Cancer Treat Rev. 2011;37(3):221–233. doi: 10.1016/j.ctrv.2010.07.008
- Писарева Е.Е., Любченко Л.Н., Коваленко С.П., Шаманин В.А. Анализ мутаций в генах KRAS и BRAF при раке толстой и прямой кишки в российской популяции // Сибирский онкологический журнал. 2016. Т. 15, № 2. С. 36–41. [Pisareva EE, Ljubchenko LN, Kovalenko SP, Shamanin VA. Analysis of mutations in kras and braf genes in colorectal cancer in Russian patients. Siberian Journal of Oncology. 2016;15(2):36–41. (In Russ).] doi: 10.21294/1814-4861-2016-15-2-36-41
- Vaughn CP, Zobell SD, Furtado LV, et al. Frequency of KRAS, BRAF, and NRAS mutations in colorectal cancer. Genes Chromosomes Cancer. 2011;50(5):307–312. doi: 10.1002/gcc.20854
- Molina JR, Adjei AA. The Ras/Raf/MAPK Pathway. J Thorac Oncol Elsevier, 2006;1(1):7–9.
- Grothey A, Lenz HJ. Explaining the unexplainable: EGFR antibodies in colorectal cancer. J Clin Oncol. 2012;30(15):1735–1737. doi: 10.1200/JCO.2011.40.4194
- Lièvre A, Bachet JB, Corre DL, et al. KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 2006;66(8):3992–3995. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-06-0191
- Cox AD, Fesik SW, Kimmelman AC, et al. Drugging the undruggable RAS: Mission Possible? Nat Rev Drug Discov. 2014;13(11):828–851. doi: 10.1038/nrd4389
- Diaz LA, Williams R, Wu J, et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 2012;486(7404):537–540. doi: 10.1038/nature11219
- Lampson BL, Pershing NL, Prinz JA, et al. Rare codons regulate KRas oncogenesis. Curr Biol. 2013;23(1):70–75. doi: 10.1016/j.cub.2012.11.031
- Porru M, Pompili L, Caruso C, et al. Targeting KRAS in metastatic colorectal cancer: current strategies and emerging opportunities. J Exp Clin Cancer Res. 2018;37(1):57. doi: 10.1186/s13046-018-0719-1
- Liu M, Sjogren AK, Karlsson C, et al. Targeting the protein prenyltransferases efficiently reduces tumor development in mice with K-RAS-induced lung cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010;107(14):6471–6476. doi: 10.1073/pnas.0908396107
- Tejpar S, Celik I, Schlichting M, et al. Association of KRAS G13D tumor mutations with outcome in patients with metastatic colorectal cancer treated with first-line chemotherapy with or without cetuximab. J Clin Oncol. 2012;30(29):3570–3577. doi: 10.1200/JCO.2012.42.2592
- Tural D, Selcukbiricik F, Erdamar S, et al. Association KRAS G13D tumor mutated outcome in patients with chemotherapy refractory metastatic colorectal cancer treated with cetuximab. Hepatogastroenterology. 2013;60(125):1035–1040. doi: 10.5754/hge12983
- Kapp JR, Diss T, Spicer J, et al. Variation in pre-PCR processing of FFPE samples leads to discrepancies in BRAF and EGFR mutation detection: a diagnostic RING trial. J Clin Pathol. 2014;68(2):111–118. doi: 10.1136/jclinpath-2014-202644
- Емельянова М.А., Мазуренко Н.Н., Гагарин И.М., и др. Определение мутаций в гене EGFR при немелкоклеточном раке легкого с помощью биологических микрочипов // Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. 2012. Т. 23, № 3. P. 15–23. [Emel’yanova MA, Mazurenko NN, Gagarin I., et al. EGFR mutation detection using biological microchips in non-small cell lung cancer. Jornal of N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS. 2012;23(3):15–23. (In Russ).]
Дополнительные файлы
![](/img/style/loading.gif)