Medicago lupulina lines with defects in the development of efficient arbuscular mycorrhiza

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Арбускулярная микориза (АМ) является одним из наиболее древних симбиозов в природе: согласно гипотезе формирование симбиоза АМ-грибов с древними риниофитами обеспечило завоевание растениями суши более 400 млн лет назад [1]. Этот симбиоз широко распространен в растительном мире, согласно последним данным в образовании АМ участвуют грибы подотдела Glomeromycotina и около 92 % видов наземных растений [2]. АМ значительно усиливает минеральное питание растений, но при этом до 20 % продуктов фотосинтеза поступают в АМ-гриб от растения-хозяина в виде глюкозы [3]. Наиболее существенное влияние АМ оказывает на растение в условиях слабой доступности для питания растений фосфора в почве [4]. Формирование эффективной АМ способствует повышению урожайности целого ряда сельскохозяйственных культур [5]. В связи с этим представляются весьма актуальными фундаментальные исследования и прикладные разработки в направлении создания растительно-микробных систем на основе АМ с повышенным симбиотическим потенциалом — повышенной эффективностью АМ.

Первые мутанты по АМ-симбиозу были получены из коллекции индуцированных мутантов Pisum sati vum L. с отклонениями в развитии бобоворизобиального симбиоза [6]. Полученные результаты свидетельствуют о наличии общих генов растения-хозяина, контролирующих как ризобиальный, так и микоризный симбиоз [7]. Так, было установлено, что почти половина из 50 не образующих клубеньки мутантов гороха Nod–-фенотипа [6, 8, 9] с применением мутагенеза этилметансульфонатом (ЭМС) полностью устойчивы к заражению АМ-грибами (Myc–-фенотип). Показано также, что часть симбиотических мутантов по ризобиальному симбиозу M. truncatula Gaertn. [10] и Phaseolus vulgaris L. [11] имеют аномалии в развитии АМ. Мутанты на линии J5 с. Джемалонг (M. truncatula) по микоризному симбиозу также были найдены среди мутантов по ризобиальному симбиозу [12], полученных с применением гамма-облучения. Были выделены мутанты с Myc–Nod–, Myc–/+Nod– и Myc–/+Nod–/+ фенотипами. Таким образом, более продвинутые исследования ризобиального симбиоза способствовали началу и продвижению исследований генетических основ формирования АМ-симбиоза. Тем не менее мутанты с отклонениями в развитии АМ, отобранные из коллекций мутантов по ризобиальному симбиозу, имеют ограниченное применение для изучения механизмов, управляющих активностью и эффективностью АМ. Причина этого заключается в том, что при получении линий для исследования ризобиального симбиоза не проводилась их селекция на чувствительность к дефициту доступного для питания растений фосфора (Рд) в почве и на активность АМ. Исходные линии растений, отобранные для получения мутантов по ризобиальному симбиозу, оказались слабомикотрофными и хорошо адаптрированными в условиях низкого уровня Рд в почве. С другой стороны, эти мутанты не являются специфическими по развитию АМ, они уже имеют мутации по ризобиальному симбиозу. В связи с этим вопрос о наличии генов, специфически контролирующих развитие эффективной АМ у бобовых, остался открытым. Понимание механизмов, контролирующих становление и развитие эффективной АМ, то есть АМ существенно усиливающей параметры роста и развития растения-хозяина, позволит выяснить ее роль в условиях действия стресс-факторов среды: низкого уровня доступного для питания растений фосфора в почве, засухи, засоления, влияния загрязняющих веществ, патогенных микроорганизмов и прочих стрессов биотической и абиотической природы.

Поиск специфических спонтанных мутантов с отклонениями в развитии АМ проведен среди небобовых растений. Впервые о них было сообщено А. Клингнер и др. [13]. Авторы выделили спонтанный немикоризуемый мутант кукурузы Zea mays L. по отсутствию желтого пигмента, синтезируемого в корнях при нормальном развитии АМ. Аналогичный мутант, который характеризуется резким снижением числа аппрессориев и снижением активности преинфекционного роста гриба, описан на томате Solanum lycopersicum L. [14]. Н. Ларкану и др. удалось локализовать Rmc-локус на карте генома томата, мутация по которому (rmc — reduced mycorrhizal colonization) вызывает снижение микоризной колонизации у томата [15]. С. Редди и др. провели успешный скрининг популяции транспозон-мутагенизированных растений петунии Petunia × hybrida hort. ex Vilm. для выявления мутантов с нарушениями в развитии АМ [16]. Результаты исследований на не бобовых растениях [13–16] дали основание предполагать, что гены, специфично отвечающие за развитие эффективной АМ, имеются и у бобовых растений.

Впервые специфический отбор мутантов с отклонениями в развитии АМ по фенотипу бобового растения проведен Д. Моранди и др. в 2009 г. [17]. Для этой цели была использована линия A17 люцерны слабоусеченной с. Джемалонг (M. truncatula Gaertn.), исследовано 6000 растений поколения М2 из 300 семей, полученных путем ЭМС-мутагенеза. Корни 3000 растений были исследованы на встречаемость АМ, но по результатам этого анализа (Myc–) мутанты выделить не удалось. Однако был получен мутант B9, который отличался от дикого типа значительно более слабым ростом как в условиях микоризации, так и без микоризации, но более высокой встречаемостью АМ: встречаемость АМ — 83 % (против 69 % у линии А17), обилие арбускул в корнях — 71 % (против 51 % у линии А17), но эффективность АМ у линии B9 по показателям продуктивности надземных частей была в 2 раза выше, чем у исходной линии; мутант B9 характеризовался поздней и слабой нодуляцией. Таким образом, впервые был получен мутант M. truncatula с фенотипом Myc++Nod–/+ [17]. Тем не менее из приведенных данных видно, что выход симбиотических мутантов был очень низкий (около 0,01 %), что говорит о слабой мутабельности линии A17. Полученные данные свидетельствуют о доминировании автотрофного фосфорного питания над симбиотрофным у линии А17 M. truncatula, она не являются высокомикотрофным растением, что не позволяет в дальнейшем успешно проводить на ней исследование механизмов развития эффективной АМ.

Первые положительные результаты в направлении селекции сильно микотрофного растения получены А.П. Юрковым и др. при исследовании полиморфизма дикорастущих популяций и малоокультуренных сортов люцерны Medicago lupulina L. [4, 18, 19]. По результатам этих исследований была отобрана сильно микотрофная яровая люцерна хмелевидная (сортопопуляция ВИК32), из которой в ряду шести поколений была выделена линия MlS-1, характеризующаяся в условиях низкого уровня Рд в почве признаками карликовости (низкорослость, тонкий стебель, низкая продуктивность, отсутствие бокового ветвления, мелкая листовая пластинка) в отсутствие инокуляции АМ-грибом и имеющая нормальный рост при образовании АМ [20]. В условиях инокуляции грибом R. irregularis эффективность микоризации по накоплению сухой массы стеблей составила ~3000 %, а по концентрации фосфора в надземной массе — ~150 % в фазу плодоношения. При инокуляции грибом R. irregularis (ранее называемый G. intraradices) у люцерны хмелевидной образуется микориза Arum-типа [19]. Таким образом, являясь облигатным симбиотрофом в условиях низкого уровня Рд в почве, это растение реагирует на наличие или отсутствие АМ. В связи с вышесказанным следует заключить, что применение в качестве растения дикого типа линии MlS-1 позволит вести поиск растительных линий с отклонениями в развитии и симбиотической эффективности АМ по фенотипу растений. Поэтому в задачи настоящего исследования входило проведение ЭМС-мутагенеза сильно микотрофной линии M. lupulina, анализ потомства M2-М9 на стабильность наследования симбиотических признаков: низкой/высокой активности АМ, образуемой на люцерне грибом R. irregularis, включая оценку встречаемости АМ, выявление сниженного/повышенного обилия арбускул и везикул в корне, определение наличия сниженной либо отсутствия симбиотической эффективности АМ, выраженной в прибавке сырой биомассы надземных частей растений с АМ относительно растений, не инокулированных АМ-грибом.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Биологический материал

Микосимбионтом растений выступал штамм RCAM00320 АМ-гриба Rhizophagus irregularis (ранее известный как Glomus intraradices Shenck & Smith) из коллекции лаборатории № 4 ФГБНУ ВНИИСХМ, показавший высокую эффективность в полевых условиях на множестве сельскохозяйственных культур [5, 21–25]. Поскольку АМ-грибы являются облигатными симбионтами (не растут на средах без растения-хозяина), то поддержание R. irregularis проводится в горшечной культуре на накопительной культуре плектрантуса южного (Plectranthus australis R. Br.; синонимы: P. verticillatus (L.f.) Druce, P. nummularius Briq.; шведский плющ, от англ. Swedish ivy), — многолетнике со средней активностью микоризации, но низкой симбиотической эффективностью АМ по параметрам продуктивности [26]. Для инокуляции растений использованы микоризованные корни плектрантуса, взятые через 5 мес. от инокуляции. В качестве фитосимбионта при проведении ЭМС-мутагенеза использована полученная авторами сильно микотрофная и быстроотзывчивая на микоризацию линия MlS-1 (сокр. от M. lupulina Spring) люцерны хмелевидной (Medicago lupulina L. var. vulgaris Koch), которая была выделена в результате скрининга индивидуальных растений сортопопуляции ВИК32 с последующей проверкой стабильности симбиотических признаков в ряду шести поколений. M. lupulina — самоопылитель (автогамия, сопряженная с автотриппингом и клейстогамией) с коротким жизненным циклом (однолетник), диплоид (2n = 16), относится к С3-растениям, имеет размер генома ~500 Мб, рано созревающее растение с высокой семенной продуктивностью — до 2500 семян с растения. Представленные характеристики позволяют заключить, что данное растений является удобным новым объектом для проведения молекулярно-генетических исследований. При выращивании на почве с низким уровнем Рд без инокуляции АМ-грибом растение имеет признаки карликовости, а в условиях инокуляции — отличается высокой продуктивностью [20]. Это дает возможность использовать показатели роста растений в качестве признаков характеризующих симбиотическую эффективность АМ и вести по ним отбор растительных линий с отклонениями в развитии и эффективности АМ.

Мутагенез этилметансульфонатом

Общая схема проведения мутагенеза представлена на рис. 1. Выбрано несколько режимов обработки ЭМС по следующим параметрам: обрабатываемый материал (в частности, влажные набухшие семена получены путем предварительной скарификации в серной кислоте); четыре различные концентрации ЭМС; различная длительность обработки. Определяли всхожесть семян и жизнеспособность проростков. Полноценные проростки для получения семян М2 высаживали в сосуды со стерилизованной хорошо окультуренной почвой с высоким содержанием макро- и микроэлементов, содержание Рд — среднее (172 мг Рд/кг почвы). На третьем этапе (см. рис. 1) проводилось выращивали потомство М2 на селективном субстрате с низким Рд (очень низким — по Кирсанову; 39 мг Рд/кг) для отбора мутантов с отклонениями в формировании и развитии АМ. Характеристика условий опыта представлена в статье А.П. Юркова и др. [20]. Эксперимент по отбору растительных линий проведен в стерилизованном ультрафиолетовом световом боксе с неактивной вентиляцией для предотвращения спонтанного заражения ризобиями и другими симбиотическими микроорганизмами. Режим смены дня и ночи: 18 и 6 ч при температуре +24–26 °С, световой поток — ~1400 лм, полив растений в стаканах проведен из расчета 60 % от полной влагоемкости субстрата весом — 200 г/растение. В качестве контроля высаживали проростки исходной линии MlS-1 — wt (дикого типа, от англ. wild type) с инокуляцией и без инокуляции АМ-грибом. На 60-е сут от посадки и инокуляции в фазу цветения оценивали встречаемость АМ, наличие арбускул и везикул у потомства М2, отклик на микоризацию. Проведен морфологический анализ и отбор растительных линий в М2 по следующим критериям:

1) отклонения в развитии надземных частей (признаки карликовости, наличие укороченных/удлиненных междоузлий, наличие хлорофилльных мутантов с отклонениями в С-метаболизме — желтых листовых пластинок и стебля, наличие бесхлорофилльных мутантов — белых семядолей);

2) наличие линий, неспособных к развитию АМ-сим биоза (встречаемость АМ равна нулю) либо имеющих сниженную встречаемость АМ относительно wt; отбирали часть корней растения, оставляя его на доращивание для получения семян).

На четвертом этапе (см. рис. 1) селектированные на третьем этапе предполагаемые мутанты с отклонениями в развитии и эффективности АМ пересаживали в сосуды со стерилизованной хорошо окультуренной дерново-подзолистой почвой со средним уровнем Рд для получения урожая семян М3 (аналогично этапу 2; см. рис. 1).

 

Рис. 1. Схема отбора линий с отклонениями в развитии АМ, полученных в результате ЭМС-мутагенеза сильно микотрофной линии Medicago lupulina. Рд — показатель уровня доступного для питания фосфора в субстрате, Э — эффективность АМ, рассчитанная по сырому весу надземных частей, F — встречаемость АМ, ↑ и ↓ — высокое/низкое значение показателей «Рд», Э и F соответственно

Fig. 1. Scheme for selection of lines with defects in AM development obtained by EMS11 mutagenesis in strongly mycotrophic line Medicago lupulina. Pi – low level of available phosphorus in the substrate, E – AM efficiency, calculated in terms of wet weight of aboveground plant parts (shoots and leaves), F – AM frequency, ↑ and ↓ – high or low values of Pi, E and F, respectively

 

На следующих этапах работы проведена проверка стабильности наследования признаков в ряду поколений до М9 для предполагаемых мутантов (биологическая повторность >15) и до 12 поколения для исходной линии wt в условиях низкого Рд в субстрате (аналогично этапу 3; см. рис. 1), определена встречаемость АМ и эффективность АМ, рассчитанная по сырому весу надземных частей по формуле:

Э = ([+АМ] – [–АМ]) / [–АМ],

где +АМ и –АМ — значения продуктивности (сырого веса надземных частей растений) в вариантах с АМ и без АМ, соответственно. Пробоподготовка корней для оценки параметров микоризации выполнена по методу мацерации и окрашивания, разработанному Дж.М. Филипс и Д.С. Хейман с применением трипанового синего [27]. Ранее было показано, что иные методы окрашивания структур R. irregularis являются менее контрастными и избирательными на корнях M. lupulina [20]. Параметры микоризации определены методом световой микроскопии [28] и с применением разработанной А.П. Юрковым и др. компьютерной программы [29].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Проведен ЭМС-мутагенез сухих, набухших семян и надземных частей растущих растений люцерны хмелевидной. Применены 14 режимов обработки ЭМС (табл. 1), из которых установлены 7 режимов, обеспечивающих получение жизнеспособных проростков М1 (режимы I–V, X и XII), из них 4 режима позволили получить продуктивное потомство у растений М1 (II, III, IV, XII).

 

Таблица 1. Режимы обработки при проведении мутагенеза Medicago lupulina с применением этилметансульфоната

Table 1. Processing modes for Medicago lupulina mutagenesis by ethylmethanesulfonate

Вариант мутагенеза	Режим обработки растений мутагеном			Доля жизнеспособных проростков М1, %	Наличие продуктивного потомства у М1	Число про анализиро ванных растений М2	Доля линий с желтыми листьями, %	Доля растений, не образующих АМ, %
	обрабатываемый биоматериал	ЭМС, %	время обработки, мин
I	сухие семена	0,25	1200	63,3*	нет	0	0	0
II	набухшие семена	0,25	165	63,3*	есть	43	2,33	0
III	сухие семена	0,25	345	76,7*	есть	607	1,15	0,16
IV	сухие семена	0,50	360	73,3*	есть	72	2,78	1,39
V	сухие семена	1,00	360	70,0*	нет	0	0	0
VI	набухшие семена	0,50	165	32,0	нет	0	0	0
VII	сухие семена	0,50	1200	10,0	нет	0	0	0
VIII	набухшие семена	1,00	165	32,0	нет	0	0	0
IX	сухие семена	0,20	1820	40,0	нет	0	0	0
X	сухие семена	0,20	1200	76,0*	нет	0	0	0
XI	сухие семена	0,20	3210	21,0	нет	0	0	0
XII	сухие семена	0,20	600	86,0*	есть	581	0,52	0,69
XIII	НЧ растений	0,20	420	целое растение	есть	40	0	0
XIV	НЧ растений	0,20	540	целое растение	есть	62	0	0
Общее число полученных растений М2: 1405
Примечание. Серым выделены режимы, включенные в анализ наследования в М2–М9; растения поколения М2, полученные в трех вариантах обработки – III, IV и XII, являются наиболее продуктивными для дальнейшего выделения мутантов с отклонениями в развитии АМ; звездочкой отмечены варианты с высоким выходом жизнеспособных проростков и без отклонений в росте растений М1; НЧ — надземные части.

 

С одной стороны, в условиях низкого уровня Рд в субстрате АМ является жизненно необходима для развития растений сильно микотрофной линии MlS-1. С другой стороны, получение углеводов — продуктов фотосинтеза растения-хозяина жизненно необходимо для развития АМ-гриба R. irregularis. В связи с этим в анализе потомства М2 было важно выявить:

1) растения с отклонениями в образовании АМ (в частности наличие для заданного режима мутагенеза растений неспособных к образованию АМ);

2) растения с отклонениями в работе фотосинтетического аппарата (в частности наличие для заданного режима мутагенеза растений, обладающих желтым цветом листовой пластинки либо вообще неспособных к фотосинтезу — формирование белых семядолей с остановкой роста на данной фазе развития).

Растения М2, полученные при II, III, IV, XII режимах ЭМС-мутагенеза, были изучены по данным признакам при выращивании на субстрате с низким Рд. В результате исследования:

1) при режимах III, IV и XII выявлены предполагаемые мутанты, не образующие АМ;

2) II, III, IV, XII режимы обработки приводили к появлению предполагаемых хлорофилльных мутантов с желтым или белым цветом листовых пластинок (табл. 1).

По результатам фенотипического анализа 20 растений семьи II-4, в котором морфологические мутанты по отклонениям в развитии АМ не выделялись, было сделано заключение о неэффективности II режима обработки. На основании вышесказанного следует полагать, что оптимальными режимами ЭМС-мутагенеза, обеспечивающими семенную продуктивность растений, являются: режим III — сухие семена замачивали в 0,25 % растворе ЭМС в течение 5 ч 45 мин, режим IV — сухие семена замачивали в 0,5 % растворе ЭМС в течение 6 ч и режим XII — сухие семена замачивали в 0,2 % ЭМС в течение 10 ч. Для выделения симбиотических мутантов на селекционную среду было высажено 665 растений М2 из 8 семей, в том числе: 1) III-1 — 82 шт.; 2) III-8 — 265 шт.; 3) IV-5 — 74 шт.; 4) XII-2 — 23 шт.; 5) XII-5 — 107 шт.; 6) XII-6 — 37 шт.; 7) XII-17 — 42 шт.; 8) XII-32 — 35 шт. Фенотипический анализ надземных частей растений М2 показал наличие различных морфологических предполагаемых мутантов: с признаками карликовости, измененным цветом листовых пластин и стеблей, длиной междоузлий, формой листовой пластины и стебля. Анализ корней на встречаемость АМ позволил установить, что часть отобранных морфологических мутантов, имеющих признаки карликовости, можно отнести к симбиотическим мутантам. Предполагаемые мутанты с исключительными фенотипическими признаками (табл. 2) были пересажены на хорошо окультуренную почву для получения урожая семян (см. этап 3 на рис. 1). В дальнейшем была проведена проверка наследуемости приобретенных признаков у отобранных линий в ряду поколений (до 9-го включительно). Среди мутагенизированных растений поколения М2 была показана достоверная стабильность наследования дефектных признаков в ряду поколений до М9 у 2,3 % растительных линий. Растения имеют следующие фенотипические признаки.

1. Получено одно Myc–-растение, не образующее АМ. XII-6-5-34 — гиперкарлик с очень мелкой темно-зеленой листовой пластинкой, практически нежизнеспособный.
2. Получены четыре Pen–-растения, не образующих АМ, но образующих апрессории. III-8-20-23 — карлик с мелкой зеленой листовой пластинкой, не образует симбиоза с клубеньковыми бактериями Sinorhizobium meliloti. XII-32-3-10 — карлик с средне-мелкой зеленой листовой пластинкой, не образует симбиоза с клубеньковыми бактериями. XII-32-5-50 — карлик с мелкой темно-зеленой листовой пластинкой, не образует симбиоза с клубеньковыми бактериями. XII-32-6-45 — карлик с очень мелкой темно-зеленой листовой пластинкой, не образует симбиоза с клубеньковыми бактериями.
3. Получены три Rmd–-растения, образующих низкоактивную неэффективную АМ. III-1-19-7 — гиперкарлик с мелкой темно-зеленой листовой пластинкой. XII-5-66-8 — листовые пластинки средние желтозеленые, стебель желто-зеленый. III-1-18-27 — карлик с очень мелкой темно-зеленой пластинкой, харатеризуется Arb+/–-фенотипом со сниженным обилием арбускул (от reduced abundance of arbuscules, фенотип цит. по [30]).
4. Получены три Rmd–-растения, образующих низкоактивную, но эффективную АМ. XII-6-5-11-1-7-5 — удлиненные междоузлия, стебель тонкий. XII-2-18-4-5-1 — листовые пластинки мелкие и средние скрученные, стебель извилистый, при инокуляции клубеньковыми бактериями образует розовые азотфиксирующие клубеньки. XII-17-12-14 — укороченные междоузлия, листья крупные зеленые.
5. Получены четыре Rmd++-растения, образующих эффективную АМ с высокими показателями обилия симбиотических структур (мицелия/арбускул/везикул) в корне. III-8-22-13 — листовая пластинка средняя у молодых листьев желто-зеленая, стебли высокие. III-8-33-9 — высокая кустистость, листовая пластинка мелкая зеленая, укороченные междоузлия. IV-5-6-25 — часть зрелых листьев с антациановой окраской. IV-5-6-15 — листовая пластинка крупная зеленая, слабо укороченные междоузлия. Линии III-8-22-13 и III-8-33-9 имеют повышенное обилие арбускул — Arb++-фенотип от increased abundance of arbuscules, наследуемость Arb++-фенотипа оценивается. Линии IV-5-6-15 и IV-5-6-25 имеют повышенное обилие везикул — Ves++-фенотип от increased abundance of vesicules, наследуемость Ves++-фенотипа оценивается. Представленные фенотипы надземных частей характерны для растений, выращенных в условиях низкого Рд в субстрате.

 

Таблица 2. Морфология растений и фенотип АМ у дикого типа Medicago lupulina и линий с отклонениями в развитии АМ-симбиоза

Table 2. Morphology of plants and AM phenotype in Medicago lupulina wild type lines and lines with defects in development of AM symbiosis

Индекс линии	Уровень фосфора в поч ве	Морфологическая характеристика растительных линий	Встре чаемость АМ (F), %	Эффективность, рассчитанная по свежему весу НЧ, %	Фенотип арбускулярной микоризы	Индекс фенотипа
Исходная линия (wt)	Низкий	Стебель длинный зеленый, листовые пластинки крупные и средние зеленые, боковое ветвление развито, вторичное кущение – 2 стеб ля, у стареющих листьев прожилки, черешки и нижняя поверхность имеют антоциановую окраску (wt-контроль). В условиях без АМ: карликовость, листовая пластинка мелкая темно-зеленая, черешок листа укороченный бурый, стебель тонкий сухой буро-зеленый без бокового ветвления (wt-контроль). Стабильность наследования в ряду 1–12 поколений	65,7 ± 3,6	251,5 ± 27,3	Межклеточный мицелий, арбускулы и везикулы; микориза Arum-типа	Myc+
	Высокий	Куст высокий, листовые пластинки крупные и средние зеленые, стебли зеленые, боковое ветвление развито, облиственность средняя, вторичное кущение развито, у стареющих листьев прожилки, черешки и нижняя поверхность имеют антоциановую окраску. В условиях без АМ развитие аналогично варианту с АМ. При инокуляции клубеньковыми бактериями образует как белые, так и розовые азотфиксирующие клубеньки	н. о.	н. о.
III-1-18-27	Низкий	Карликовость, листовая пластинка очень мелкая темно-зеленая, стебель тонкий буро-зеленый, боковое ветвление не развито; cтабильность наследования в ряду 2–9 поколений	37,5 ± 3,8	Менее 20 % (не достоверная)	Неактивная АМ с аморф ными и дистрофными арбускулами, внутрикорневой мицелий часто без везикул	Rmd–
	Высокий	Высота куста на уровне wt контро ля, листовая пластинка средняя темно-зеленая, стебель буро-зеленый, ветвление единичное, облиственность слабая. При инокуляции клубеньковыми бактериями образует как белые, так и розовые азотфиксирующие клубеньки	н. о.	н. о.
III-1-19-7	Низкий	Гиперкарликовость, округлый лист — желтый, листовая пластинка мелкая темно-зеленая, у молодых листьев — желтая, черешок и прожилки листа желтые, стебель белый, бокое ветвление отсутствует; стабильность наследования в ряду 2–9 поколений	8,0 ± 1,2	Эффективность АМ отсутствует	Внутрикорневой мицелий и арбускулы аморфные, везикулы редкие, интенсивность микоризации низкая	Rmd–
	Высокий	Куст (10 стеблей), высота куста ниже wt-контроля, листовая пластинка мелкая зеленая, у молодых листьев — желтая, прожилки и стебли белые, черешки листьев на боковых ветвях укорочены	н. о.	н. о.
III-8-20-23	Низкий	Карликовость, листовая пластинка зеленая, мелкая, стебель тонкий светло-зеленый в верхней части и бурый внизу, боковое ветвление — единичное; cтабильность наследования в ряду 2–9 поколений	0	Эффективность АМ отсутствует	Структуры АМ не обнаружены, аппрессории имеются	Pen–
	Высокий	Высота куста на уровне wt-контро ля, листовая пластинка желтовато-зеленая. При инокуляции клубеньковыми бактериями не формирует клубеньки, формируются утолщения на корнях — возможно, примордии	н. о.	н. о.
III-8-22-13	Низкий	Листовая пластинка у молодых листьев желто-зеленая, стебли высокие, вторичное кущение — 2 стебля; стабильность наследования в ряду 2–9 поколений	68,3 ± 3,4	Менее 100 % (достоверная)	Встречаемость микоризы высокая, арбускулы крупные, везикулы средние	Rmd++
	Высокий	Куст на уровне wt-контроля, листовая пластинка средняя желто-зеленая, у молодых листьев — светло-желтая, редко старые листья имеют антоциановый окрас, боковое ветвление частое	н. о.	н. о.
III-8-33-9	Низкий	Куст (5–8 стеблей), листовая пластинка мелкая зеленая, высокая облиственность, черешок длинный, укороченные междоузлия, позднеспелый, сильно развитая корневая система; стабильность наследования в ряду 2–9 поколений	55,8 ± 5,2	Менее 200 % (достоверная)	Арбускулы плотные, везикул много	Rmd++
	Высокий	Куст (18–20 стеблей), ниже wt-контроля, стелющиеся стебли, листовая пластинка средняя зеленая, высокая облиственность, позднеспелый, укореняющиеся отводки, сильно развитая корневая система	н.о.	н.о.
IV-5-6-25	Низкий	Отдельные зрелые листья с антациановой окраской; стабильность наследования в ряду 3–9 поколений	53,0 ± 3,9	Менее 100 % (достоверная)	Встречаемость микоризы высокая, арбускулы крупные, везикул больше, чем у wt	Rmd++
	Высокий	Куст выше wt-контроля, отдельные зрелые листья с антациановой окраской, сильно развито боковое ветвление, обильное плодоношение	н. о.	н. о.
IV-5-6-15	Низкий	Крупные зеленые листья, слабо укороченные междоузлия; стабильность наследования в ряду 3–9 поколений	40,1 ± 4,3	Менее 100 % (достоверная)	Интенсивность микоризации высокая, арбускулы крупные, везикул больше, чем у wt	Rmd++
	Высокий	Куст (5 стеблей) выше wt-контро ля, у зрелых и засыхающих листьев нет антоциановой окраски, сильно развито боковое ветвление, обильное плодоношение	н. о.	н. о.
XII-2-18-4-5-1	Низкий	Листовые пластинки средние и мелкие зеленые скрученные, стебель тонкий зеленый извилистый, боковое ветвление слабо выражено, среднеспелое; стабильность наследования в ряду 6–9 поколений	32,8 ± 3,3	Менее 100 % (достоверная)	Медленное развитие эффективной АМ, редуцированные аморфные арбускулы и мицелий, везикул нет	Rmd–
	Высокий	Куст ниже wt-контроля, листовые пластинки средние и мелкие зеленые скрученные, стебли зеленые извилистые. При инокуляции клубеньковыми бактериями образует розовые азотфиксирующие клубеньки	н. о.	н. о.
XII-5-66-8	Низкий	Листовые пластинки средние желто-зеленые, стебель желто-зеленый, боковое ветвление слабо выражено, среднеспелое; стабильность наследования в ряду 3–9 поколений	21,0 ± 4,7	Менее 20 % (не достоверная)	Низкая встречаемость АМ, арбускулы плотные, развитие везикул нормальное	Rmd–
	Высокий	Куст (10 стеблей) на уровне wt-контроля, стебли и листья желто-зеленые, боковое ветвление развито, плодоношение на уровне wt-контроля	н. о.	н. о.
XII-6-5-11-1-7-5	Низкий	Удлиненные междоузлия, стебель тонкий, удлиненный, слабооблиственный, боковое ветвление не развито; стабильность наследования в ряду 7–9 поколений	10,1 ± 2,3	Менее 200 % (достоверная)	Интенсивность микоризации низкая, мицелий и арбускулы аморфные, везикулы тонкостенные, редкие	Rmd–
	Высокий	Высота куста ниже wt-контроля, листовые пластинки средние и мелкие, стебли тонкие с удлиненными междоузлиями, боковые ветви простые и с множественным вторичным ветвлением	н. о.	н. о.
XII-6-5-34	Низкий	Гиперкарликовость, листовая пластинка очень мелкая темно-зеленая, стебель тонкий, боковое ветвление не развито; стабильность наследования в ряду 3–9 поколений	0	Эффективность АМ отсутствует	Структуры АМ не обнаружены, аппрессориев нет	Myc–
	Высокий	Куст низкорослый, компактный, листовая пластинка средняя, зеленая, стебель буро-зеленый, боковое ветвление развито слабо	н. о.	н. о.
XII-17-12-14	Низкий	Низкорослое, междоузлия укорочены, вторичное кущение развито, стебель толстый, лист крупный зеленый; стабильность наследования в ряду 2–9 поколений	46,9 ± 3,6	Менее 100 % (достоверная)	Встречаемость АМ сниженная, АМ зрелая, везикул и арбускул много	Rmd–
	Высокий	Куст низкорослый, компактный, хорошо облиственен, междоузлия укороченные; позднеспелое	н. о.	н. о.
XII-32-3-10	Низкий	Карликовость, листовая пластинка средняя и мелкая зеленая, низкорослое (ниже исходной линии при выращивании без АМ), боковое ветвление — среднее; стабильность наследования в ряду 2–9 поколений	0	Эффективность АМ отсутствует	Структуры АМ не обнаружены, аппрессории имеются	Pen–
	Высокий	Куст ниже wt-контроля, листовая пластинка средняя, зеленая, стебель сочный, боковое ветвление развито слабо. При инокуляции клубеньковыми бактериями не формирует клубеньки, редко формируются утолщения на корнях – возможно, примордии	н. о.	н. о.
XII-32-5-50	Низкий	Карликовость, листовая пластинка мелкая темно-зеленая, высота на уровне исходной линии без АМ, бокового ветвления нет или слабое; стабильность наследования в ряду 2–9 поколений	0	Эффективность АМ отсутствует	Структуры АМ не обнаружены, аппрессории имеются	Pen–
	Высокий	Куст ниже wt-контроля, листовые пластинки средние и мелкие темно-зеленые, боковое ветвление не развито или слабое. При инокуляции клубеньковыми бактериями не формирует клубеньки	н. о.	н. о.
XII-32-6-45	Низкий	Карликовость, листовая пластинка очень мелкая темно-зеленая, стебель тонкий буро-зеленый по высоте на уровне исходной линии без АМ, боковое ветвление слабое, вторичное кущение — 3 стебля; стабильность наследования в ряду 2–9 поколений	0	Эффективность АМ отсутствует	Структуры АМ не обнаружены, аппрессории имеются	Pen–
	Высокий	Высота куста ниже wt-контроля без АМ, листовая пластинка мелкая зеленая, стебель тонкий зеленый, боковое ветвление очень частое. При инокуляции клубеньковыми бактериями не формирует клубеньки	н. о.	н. о.
Примечание. Представлены данные по активности и эффективности АМ для линий M. lupulina с грибом R. irregularis на 50 сутки от посадки; н. о. — значение не определено; значения низкий и средний уровень Рд представлены в разделе «Материалы и методы». Фенотипы АМ: 1) Myc+ (mycorrhiza development) — развитие АМ у wt; 2) Myc– — структур АМ не обраружено; 3) Pen– ( penetration in root cortex ) — аппрессории не формируют инфицирующих гиф; 4) Rmd– ( rate of mycorrhiza development, или Myc+/–-фенотип) — сниженная скорость развития АМ и низкая/отсутствие АМ-эффективности; 5) Rmd++ — повышенная скорость развития АМ и достоверная АМ-эффективность.

 

Результаты показали, что у всех линий с отклонениями в развитии АМ, пересаженных на хорошо окультуренную почву со средним уровнем Рд, признаков карликовости не наблюдалось. Очевидно, в этих условиях у них преобладал автотрофный способ фосфорного питания. У линий с удлиненными или укороченными междоузлиями, с извилистыми листовыми пластинами, сильно развитой кустистостью, с желто-зеленой окрас кой листовых пластин, с пятнами антоциана или отсутствием видимых признаков антоциана, с белым стеблем развивается типичная АМ, но с замедлением (Rmd–-фенотип) или ускорением (Rmd++-фенотип), по сравнению с wt-контролем. Вероятно, у этих линий имеет место изменение гормонального статуса, влияющее на интенсивность образования АМ. Так, например, об изменении уровня ряда гормонов у морфологических мутантов гороха сообщается в работе К.К. Сидоровой [31]. В свою очередь, гормональный статус растения существенно влияет на развитие АМ, что было показано в исследованиях, проведенных на горохе [32] и томатах [33].

Отметим, что селектированная нами линия III-1-18-27 при инокуляции клубеньковыми бактериями S. meliloti образует как белые, так и розовые азотфиксирующие клубеньки, то есть имеет специфические отклонения в развитии эффективной АМ, но не имеет отклонений в развитии эффективного бобоворизобиального симбиоза. Специфические мутации по АМ-симбиозу с R. irregularis без отклонений в развитии бобоворизобиального симбиоза (с Mesorhizobium loti) впервые были получены на трех ЭМС-мутантах Lotus japonicus [34], однако проверка стабильности наследования признаков в работе [34] была проведена только до поколения M3–M4.

При проведении настоящего исследования получены данные, свидетельствующие о значительной мутабельности исследуемой линии M. lupulina при использовании ЭМС-мутагенеза. Выход линий М2 с отклонениями в развитии АМ в зависимости от режима обработки мутагеном (III, IV и XII) составил 1,4, 2,7 и 3,3 % соответственно; наиболее эффективным был режим XII (табл. 1, 2). Для сравнения, например, выход индуцированных симбиотических мутантов P. sativum по ризо биальному симбиозу при ЭМС-мутагенезе был значительно ниже и составил от 0,02 до 1,1 % в зависимости от сорта и режима обработки мутагеном [6, 10, 30, 35–42]. Из их числа менее половины мутантов имели отклонения по микоризному симбиозу. Таким образом, можно констатировать, что методика по получению мутантов с отклонениями в развитии и симбиотической эффективности АМ, разработанная авторами, является весьма результативной и может найти применение и на других растениях, обладающих высоким откликом на инокуляцию АМ-грибом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В качестве модельного объекта для получения мутантов, индуцированных с помощью ЭМС-мутагенеза, предложена новая высокомикотрофная линия MLS-1 Medicago lupulina, имеющая признаки карликовости в отсутствии АМ в условиях низкого уровня Рд в субстрате. Разработана эффективная система отбора мутантов из популяции мутагенизированных растений. Получены 15 растительных линий, из которых четыре являются предполагаемыми симбиотическими мутантами — имеют нарушения в развитии АМ, остальные 11 линий имеют отклонения в сторону ускорения или замедления развития АМ, наследуемые до поколения М9. Отметим, что получение симбиотических мутантов с отклонениями в развитии эффективной АМ у облигатно микотрофного растения осуществляется впервые. Исходная линия, а также полученные на ней линии с отклонениями в развитии АМ послужат решению фундаментальных проблем биологии, связанных с изучением механизмов функционирования эффективного АМ-симбиоза с применением как молекулярно-генетических, так и физиолого-биохимических и микробиологических методов. Полученные результаты также будут способствовать продвижению оценке метаболома и транскриптома M. lupulina, которые начаты авторами работы в рамках объединенных исследований с лабораториями и кафедрами ФГБНУ ВНИИСХМ, СПбГУ и БИН РАН. Результаты исследования могут найти применение в селекции люцерны на повышение симбиотического потенциала и повышение продуктивности растений в условиях дефицита доступного для питания растений фосфора в почве.

БЛАГОДАРНОСТИ

Работа А.П. Юркова поддержана грантом РФФИ-а № 18-016-00220, работа Л.М. Якоби поддержана грантом СПбГУ № 1.37.534.2016. Часть работы выполнена в рамках государственного задания 0664-2018-0022 на оборудовании ЦКП «Геномные технологии, протеомика и клеточная биология» ФГБНУ ВНИИСХМ. Авторы благодарят д-ра биол. наук Н.А. Проворова, д-ра биол. наук М.Ф. Шишову и канд. биол. наук В.А. Жукова за плодотворное обсуждение полученных результатов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

Andrey P. Yurkov

All-Russian Research Institute for Agricultural Microbiology; Saint Petersburg State University

Author for correspondence.
Email: yurkovandrey@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2231-6466
SPIN-code: 9909-4280
Scopus Author ID: 56835374200
ResearcherId: A-8513-2014
https://vk.com/andreyyurkov

Candidate of Biology, Assistant Professor, Senior Researcher, Laboratory No 4

Russian Federation, 3, Podbelsky highway, Pushkin, Saint-Petersburg, 196608; 7/9, Universitetskaya embankment, Saint-Petersburg, 199034

Lidija M. Jacobi

All-Russian Research Institute for Agricultural Microbiology; Saint Petersburg State University

Email: Iidija-jacobi@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-0387-5024
SPIN-code: 3384-4130

Research Scientist, Laboratory No 4

Russian Federation, sh. Podbel’skogo 3, St. Petersburg, 196608 Russia; Universitetskaya nab. 7/9, Saint-Petersburg, 199034 Russia

References

Supplementary files