Гистологическая и ультраструктурная организация клубеньков мутанта гороха (Pisum sativum) sgefix–-5 ПО ГЕНУ Sym33, кодирующему транскрипционный фактор PsCYCLOPS/PsIPD3

Полный текст

Введение

Реализация генетической программы развития симбиотического клубенька включает в себя подпрограммы инфекции корня ризобиями и органогенеза клубенька [1]. В последние годы обнаружены многие компоненты как подпрограммы инфекции [2], так и органогенеза клубенька [3]. Среди выявленных компонентов важную роль играют транскрипционные факторы, в частности CYCLOPS/IPD3 [4–7].

У Lotus japonicus ген CYCLOPS кодирует белок с коротким C-концевым сoiled-coil доменом и функциональным сигналом ядерной локализации [5]. CYCLOPS представляет собой субстрат, который фосфорилируется кальций- и кальмодулинзависимой протеинкиназой CCaMK. В результате изучения серии аллельных мутантов cyclops было установлено, что у мутантов формируются клубеньковые примордии, но дальнейшего развития клубеньков не происходит. У мутанта cyclops-3 наблюдалась колонизация скрученных корневых волосков, однако инфекционные нити не развивались. Детальный анализ позволил выявить пять сайтов фосфорилирования серина, два из которых — S50 и S154 — важны для симбиоза [7]. Замена серина в этих положениях на фосфомиметическую аспарагиновую кислоту при трансформации корней конструкцией с измененной версией CYCLOPS приводила к формированию спонтанных клубеньков не только у растений дикого типа, но и у мутанта cyclops-3 и у мутантов symrk-3 и symrk-13 по гену, кодирующему LRR-содержащую рецепторную киназу SYMRK. Таким образом, фосфорилирования CYCLOPS оказывается достаточным для инициации органогенеза клубенька, что указывает на то, что ген CYCLOPS является мастером-регулятором, а белок CYCLOPS — CCaMK-регулируемым ДНК-связывающим транскрипционным активатором. Фосфорилирование CYCLOPS в положениях S50 и S154 ведет к конформационным изменениям, высвобождающим ДНК-связывающий домен от автоингибирования, осуществляемого N-концевым регуляторным доменом. После этого CYCLOPS связывается с CYC-боксом промотора гена NIN, индуцируя его экспрессию, что, в свою очередь, ведет к органогенезу клубенька [7].

Изучение мутантов по ортологичным генам Medicago truncatula IPD3 и гороха Sym33 показало, что эти гены вовлечены в контроль развития инфекционных нитей и симбиосом [6], что указывает на важнейшую роль транскрипционного фактора CYCLOPS/IPD3 в развитии клубенька.

У гороха с использованием лабораторной линии SGE и сорта Finale были получены три мутанта по гену Sym33 [8–10]. Тем не менее детальная фенотипическая характеристика была выполнена лишь для мутанта SGEFix^–-2 (sym33^–3) [9].

Цель данной работы заключалась в изучении гистологической и ультраструктурной организации клубеньков мутанта SGEFix^–-5 (sym33^–2) и выявлении особенностей фенотипического проявления мутации.

Материал и методы исследований

Растительный материал

В исследовании был использован мутант SGEFix^–-5 (sym33^–2), формирующий белые неэффективные клубеньки [6, 11], из коллекции ФГБНУ ВНИИСХМ.

Штаммы бактерий

Растения были инокулированы коммерческим штаммом Rhizobium leguminosarum bv. viciae RCAM 1026 (=CIAM 1026) [12] из коллекции ФГБНУ ВНИИСХМ для исследований ультраструктурной организации клубеньков и штаммом 3841 [13] с целью изучения гистологической организации клубеньков.

Условия выращивания и сбор материала для анализа

Семена стерилизовали концентрированной серной кислотой в течение 15 мин и промывали стерильной водой 10 раз. Растения были выращены в пластиковых сосудах, содержащих 100 г стерильного вермикулита. Для полива растений применяли безазотный питательный раствор [14]. Растения были выращены в климатической камере MLR-352H (Sanyo Electric Co., Ltd., Моригучи, Япония) в режиме день/ночь 16/8 ч при 21 °C, относительной влажности 75 %, освещенности 280 мкМ фотонов м^–2 с^–1. Для анализа клубеньки (с 10 растений) были собраны через две недели после инокуляции.

Фиксация материала и методы конфокальной микроскопии

Фиксацию клубеньков, а также получение серийных срезов (40–50 мкм) с использованием микротома с вибрирующим лезвием HM650V (Microm, Вальдорф, Германия) проводили по методике, описанной ранее [15]. Срезы промывали три раза по 10 мин буфером TBS (50 мM TrisHCl, 150 мM NaCl, pH 7,5) и окрашивали йодидом пропидия (0,5 мкг/мл) в течение 7 мин для визуализации клеточных ядер и бактерий. Затем срезы дважды промывали буфером TBS по 10 мин и заключали под покровные стекла в заливочную среду ProLong Gold antifade reagent (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США).

Изображения были получены с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа LSM780 (Carl Zeiss, Оберкохен, Германия).

Электронно-микроскопический анализ

Для электронно-микроскопического анализа клубеньки подвергали вакуумированию (–0,9 бар) и фиксировали в 2,5 % растворе глутаральдегида на 0,3 М фосфатном буфере Миллонига (рН 7,4) при 4 °C в течение ночи. После фиксации образцы промывали в четырех сменах буферного раствора Миллонига и дополнительно фиксировали в 1 % растворе четырехокиси осмия на 0,3 М фосфатном буфере Миллонига в течение 2 ч. После промывания в трех сменах по 15 мин в дистиллированной воде образцы обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации — 50 %, 70 % (оставляли на ночь при температуре 4 °C), 96 % по 15 мин в каж дом, в двух сменах абсолютного этанола по 10 мин, в смеси абсолютного этанола и ацетона в соотношении 1 : 1 в течение 10 мин, в двух сменах ацетона по 10 мин.

В качестве заливочной среды применяли смолу Epon 812 с катализатором DMP-30 (Honeywell Fluka^TM, Fisher Scientific, Лонгборроу, Великобритания). Ткани пропитывали в смеси абсолютного ацетона и заливочной среды в соотношении 1 : 1 и 1 : 3 в течение 1 ч и далее продолжали в чистой смоле в течение ночи при комнатной температуре. Заливку клубеньков осуществляли путем переноса образцов в предварительно просушенные полиэтиленовые капсулы, заполненные свежей заливочной средой. Полимеризацию проводили при температуре 37 °C в течение 24 ч, при температуре 45 °C в течение 6 ч и при температуре 60 °C в течение 2,5 сут в термостате Memmert IN55 (Memmert GmbH, Швабах, Германия).

Ультратонкие срезы толщиной 90–100 нм готовили на ультратоме Leica EM UC7 (Leica Microsystems, Вена, Австрия) с помощью алмазного ножа (Diatome, Биль, Швейцария) и собирали на никелевые сеточки, покрытые пироксилином и углеродом. Ультратонкие срезы контрастировали 2 % водным раствором уранилацетата в течение 20 мин и цитратом свинца по Рейнольдсу в течение 1 мин. Наблюдение и съемку ультратонких срезов выполняли на трансмиссионном электронном микроскопе JEM-1400 (JEOL Corporation, Токио, Япония) с помощью цифровой камеры Olympus-SIS Veleta (Olympus Corporation, Токио, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ.

Результаты

Гистологическая организация клубеньков

Большинство клубеньков мутантной линии SGEFix^–-5 (sym33^–2) характеризовалось остановкой развития на ранних стадиях. Разветвленная инфекционная нить, которая блокировалась в клетках наружной коры корня, не проникая вглубь формирующегося клубенька (рис. 1, а). Сильное ветвление инфекционной нити отмечено в пределах одной колонизированной клетки клубенька (рис. 1, б).

 

Рис. 1. Гистологическая организация клубеньков мутантного генотипа SGEFix–-5 (sym33-2): а — сагиттальный срез клубенька; б — колонизированные клетки с инфекционными нитями. Наложение единичных оптических срезов дифференциально-интерференционного контраста и красного каналов (ядра и бактерии), представленных в градациях серого. КК — колонизированная клетка, Я — ядро, ИН — инфекционная нить, стрелки указывают на инфекционные нити. Масштабная линейка: а — 50 мкм, б — 10 мкм

 

Ультраструктурная организация клубеньков

В клубеньках мутанта SGEFix^–-5 (sym33^–2) колонизированные клетки были заполнены разветвленной сетью инфекционных нитей, из которых не происходил выход бактерий в цитоплазму растительной клетки (рис. 2, а). Детальный анализ показал, что инфекционные нити можно подразделить на два типа. Первый тип был представлен нитями, окруженными утолщенной стенкой, в которых интактные бактерии были погружены в однородный матрикс (см. рис. 2, б). При этом можно было наблюдать везикулы, ассоциированные с утолщенной клеточной стенкой (рис. 2, б). Второй тип включал в себя инфекционные нити, в которых формировались кластеры, состоящие из 2–6 бактерий и светлого матрикса, заключенные в типичный темный матрикс (рис. 2, в). При этом у бактерий, формирующих кластеры, наблюдались признаки де градации (см. рис. 2, в). В результате бактерии внутри инфекционных нитей оказывались полностью разрушенными (рис. 2, г).

 

Рис. 2. Ультраструктурная организация клубеньков мутантного генотипа SGEFix–-5 (sym33-2): а — колонизированные клетки; б — инфекционные нити с утолщенными стенками и интактными бактериями в матриксе; в — инфекционная нить с утолщенными стенками и деградирующими бактериями, собранными в кластеры, г — инфекционная нить с полностью деградировавшими бактериями в просвете. КК — колонизированная клетка, ИН — инфекционная нить, СИН — стенка инфекционной нити, КС — клеточная стенка, Б — бактерия, ДБ — деградирующая бактерия, стрелки указывают на везикулы, звездочки — на кластеры бактерий внутри инфекционной нити. Масштабная линейка: а — 10 мкм, б–г — 1 мкм

 

Обсуждение

Для гена гороха Sym33 было описано три независимо полученных мутанта: SGEFix^–-2 [9], SGEFix^–-5 [11] с использованием лабораторной линии SGE и RisFixU, индуцированный на сорте Finale [10]. Все мутанты по гену Sym33 формируют неэффективные клубеньки, причем для мутантов SGEFix^–-5 и RisFixU характерны белые клубеньки, а у мутанта SGEFix^–-2 наряду с белыми клубеньками формируются розоватые клубеньки. Наиболее детальная фенотипическая характеристика была проведена для мутанта SGEFix^–-2. Было показано, что в белых клубеньках формируются «запертые» инфекционные нити, из которых не происходит выхода бактерий в цитоплазму растительной клетки [9]. Позднее было обнаружено, что в таких клубеньках в отдельных клетках наблюдается выход бактерий [16], при этом формируются инфекционные капли [17]. В розоватых клубеньках происходит выход бактерий, которые остаются недифференцированными [9]. Мутанты RisFixU и SGEFix^–-5 были исследованы в меньшей степени, ультраструктурная организация их клубеньков не изучалась, но было показано, что они формируют «запертые» инфекционные нити [6, 16].

Идентификация гена гороха Sym33 показала, что он кодирует транскрипционный фактор CYCLOPS/IPD3 [6], который является ключевым для развития симбиоза [6, 7]. Очевидно, что детальная характеристика мутантов по гену Sym33 представляет большой интерес, поскольку позволяет выявить новые аспекты функционирования данного гена.

Ранее было установлено, что у мутанта SGEFix^–-5 формируются преимущественно крупные белые клубеньки с развитой сетью «запертых» инфекционных нитей [6]. В данном исследовании растения мутанта SGEFix^–-5 формировали в основном мелкие белые клубеньки, развитие которых было заблокировано на стадии, предшествующей проникновению инфекционной нити вглубь клубенька. Можно предположить, что эти различия связаны с используемым штаммом. Благодаря изучению ультраструктурной организации клубеньков было обнаружено, что вокруг инфекционных нитей формируются утолщенные стенки, причем было установлено наличие везикул, поставляющих к ним материал. Выход бактерий в цитоплазму растительной клетки из инфекционных нитей не происходит. Сходные «запертые» инфекционные нити были описаны для мутанта SGEFix^–-2 [9]. Однако, в то время как у мутанта SGEFix^–-2 наблюдалось формирование на некоторых инфекционных нитях инфекционных капель и выход бактерий [16, 17], для мутанта SGEFix^–-5 таких фенотипических проявлений описано не было. Это указывает на то, что sym33^–2, в отличие от sym33^–3, является строгой аллелью. В то же время для мутанта SGEFix^–-5 было характерно наличие некоторых инфекционных нитей, в которых бактерии не расходятся после деления, формируя кластеры и подвергаясь в дальнейшем полной деградации. Данный фенотип можно объяснить активацией сильных защитных реакций со стороны растения. Действительно, в клубеньках мутанта SGEFix^–-2 отмечается суберинизация стенок инфекционных нитей и клеточных стенок, а также активация ряда генов защитных реакций [18]. Кроме того, происходит отложение пектинов, в частности рамногалактуронана I, как в клеточной стенке инфекционных нитей, так и в матриксе вокруг бактерий [19]. По всей видимости, у мутанта SGEFix^–-5 проявление защитных реакций выражено еще сильнее, и оно затрагивает бактерии внутри инфекционных нитей.

Работа поддержана грантом Российского научного фонда (16-16-10035).

Работа выполнена с использованием оборудования ЦКП «Геномные технологии, протеомика и клеточная биология» ФГБНУ ВНИИСХМ, ЦКП «Клеточные и молекулярные технологии изучения растений и грибов» ФГБУН БИН РАН и Ресурсного центра «Развитие молекулярных и клеточных технологий» ФГБОУ ВО СПбГУ.

Об авторах

Анна Викторовна Цыганова

ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии»

Email: isaakij@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3505-4298

канд. биол. наук, ведущий научный сотрудник, лаборатория молекулярной и клеточной биологии

Россия, 196608, г. Санкт-Петербург, Пушкин 8, ш. Подбельского, д.3

Кира Андреевна Иванова

ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии»

Email: kivanova@arriam.ru
ORCID iD: 0000-0002-9119-065X

младший научный сотрудник, лаборатория молекулярной и клеточной биологии

Россия, 196608, г. Санкт-Петербург, Пушкин 8, ш. Подбельского, д.3

Виктор Евгеньевич Цыганов

ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии»

Автор, ответственный за переписку.
Email: tsyganov@arriam.spb.ru
ORCID iD: 0000-0003-3105-8689
SPIN-код: 6532-1332
Scopus Author ID: 7006136325
ResearcherId: Q-5634-2016
http://arriam.ru/departments/laboratoriya-molekulyarnoj-i-kletochnoj-biologii/

д-р биол. наук, заведующий лабораторией молекулярной и клеточной биологии

Россия, 196608, г. Санкт-Петербург, Пушкин 8, ш. Подбельского, д.3

Список литературы

Дополнительные файлы