Анализ генов полиаминоксидаз у метилотрофных дрожжей Komagataella phaffii

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Полиамины присутствуют во всех живых клетках и регулируют широкий спектр биологических процессов. У дрожжей Saccharomyces cerevisiae полиаминоксидаза Fms1p превращает спермин в спермидин и 3-аминопропаналь, что необходимо для синтеза пантотеновой кислоты и гипузинирования. В данной работе показано, что ортологи гена FMS1 дрожжей S. cerevisiae присутствуют у всех основных представителей подотдела Saccharomycotina, однако их копийность различна. У дрожжей Komagataella рhaffii (Pichia pastoris) идентифицированы два гена полиаминоксидаз (KpFMS1 и KpFMS2) и изучена регуляция активности их промоторов.

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Полиамины — группа алифатических поликатионов, которая обнаружена у прокариотических и эукариотических организмов. У высших эукариот, в том числе и у грибов, наиболее часто встречаются путресцин, спермидин и спермин. Функции полиаминов определяются их химической структурой. При физиологических рН полиамины имеют положительный заряд и за счет электростатических и гидрофобных взаимодействий могут действовать как лиганды, связываясь с ДНК, РНК, белками, фосфолипидами и нуклеозидтрифосфатами [1, 2]. Предполагают, что полиамины могут участвовать в регуляции экспрессии генов как за счет изменения структуры ДНК и модуляции сигнальных путей, так и за счет связывания с транскрипционными факторами. Полиамины избыточны у всех живых организмов. Дефицит полиаминов приводит к прекращению роста клеток, однако их интенсивное накопление может быть цитотоксично, что свидетельствует о необходимости строгой регуляции внутриклеточного пула этих соединений [2, 3]. В последнее время интерес к полиаминам вызван их возможным использованием в качестве антипролиферативных соединений.

Уровень полиаминов в клетке контролируется комплексом биосинтетических (орнитиндекарбоксилаза, S-аденозилметионинкарбоксилаза, спермидинсинтаза и сперминсинтаза) и катаболических (спермидин/сперминацетилтрансфераза, флавинсодержащая полиаминоксидаза, Cu-содержащая диаминоксидаза) ферментов [2]. Полиаминоксидаза представляет особый интерес, так как она превращает спермин в спермидин и 3-аминопропаналь. Окисление 3-аминопропаналя необходимо S. cerevisiae для синтеза пантотеновой кислоты [4], в то время как спермидин участвует в реакции гипузинирования (важной модификации трансляционного фактора eIF-5A) [5].

Филогенетический анализ полиаминоксидаз был проведен у животных и растений. У животных обнаружено, что в процессе эволюции предковый ген полиаминоксидазы PAO был дуплицирован, и в результате возникли два белка паралога позвоночных, кодируемые генами SMO и APAO [6]. Геном Arabidopsis thaliana содержит минимум пять полиаминоксидаз. Анализ субстратной специфичности белка показал, что полиаминоксидаза AtPAO3 окисляет спермидин и спермин и продуцирует H2O2. Показано, что полиаминоксидазы растений A. thaliana AtPAO2, AtPAO3 и AtPAO4 локализованы в пероксисомах [7]. У животных один из белков полиаминоксидаз содержит сигнал транспорта в пероксисомы и также может быть локализован в этих органеллах.

У грибов полиамины регулируют широкий круг биологических явлений: диморфизм, формирование спор и апрессорий. В некоторых случаях они регулируют вирулентность грибов — патогенов животных и растений [8]. Лучше всего изучена ФАД-зависимая (флавинадениндинуклеотид) полиаминоксидаза Fms1р Saccharomyces cerevisiae [9], участвующая в биосинтезе β-аланина и пантотеновой кислоты. Дрожжи c делецией гена FMS1 не способны расти на среде без пантотеновой кислоты или β-аланина, а в случае сверхэкспрессии гена FMS1 под контролем ADH1 промотора, трансформанты секретируют пантотеновую кислоту в среду [4]. В то же время у других представителей подотдела Saccharomycotina количество генов полиаминоксидаз варьирует и связь копийности генов полиаминооксидаз с метаболизмом не ясна.

В данной работе проведен анализ ортологов полиаминоксидаз у представителей подотдела Saccharomycotina, идентифицированы гены полиаминоксидаз KpFMS1 и KpFMS2 метилотрофных дрожжей Komagataella рhaffii (Pichia pastoris) и изучена их регуляция.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Сравнение аминокислотных последовательностей полиаминоксидаз

Ортологи белка S. cerevisiae Fms1p у представителей группы Saccharomycotina были найдены с помощью алгоритма BLASTp со стандартными параметрами [10]. Множественное сравнение аминокислотных последовательностей полиаминоксидаз проводили в программе Mega X [11]. Найденные последовательности были выравнены с помощью программы CLUSTAL W [12]. Для построения филогенетического дерева использовали метод Maximum Likelihood (ML). Наилучшей моделью для данного метода оказалась LG+G [13]. Построение ML дерева проводилось с использованием модели LG+G и с 500 повторностями анализа bootstrap. Полученное дерево было укоренено с помощью внешней группы — грибов Neurospora crassa. Визуализировали дерево с помощью программы FigTree v1.4.3 (http://influenza.bio.ed.ac.uk/software/Figtree/).

Праймеры

Все праймеры, использованные в работе, представлены в табл. 1.

Таблица 1. Последовательности праймеров, использованных в работе

Плазмиды

В работе были использованы плазмиды pAL2-T (Евроген, Россия) и pPIC9-AOX1-PHO5 [14].

Штаммы

В работе были использованы штаммы дрожжей K. phaffii 4-GS115 (his4 phox) и tr2-4-GS115 (phox PAOX1-PHO5) [14], а также штамм бактерий E. coli DH5α, (fhuA2 Δ(argF-lacZ)U169 phoA glnV44 Φ80Δ (lacZ)M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17).

Среды и условия культивирования

Для культивирования штаммов дрожжей использовали следующие среды. YEPD: 2 % глюкоза, 2 % пептон, 1 % дрожжевой экстракт, 2.4 % агар. МФО: 0.73 М MgSO4 · 7H2O, 0.18 мМ CaCl2, 20 мМ Na-цитратный буфер (pH 4,6), витамины, микроэлементы. Источники углерода (глицерин или метанол) — 1 %, источник азота (сульфат аммония) — 0,2 %. Для культивирования бактерий использовали среду LB: 1 % триптон, 0.5 % дрожжевой экстракт, 170 мМ NaCl, бензилпенициллин — 5 · 105 е. а./л. Штаммы K. phaffii выращивали при температуре 30 °C, E. coli — при температуре 37 °C.

Конструирование плазмид pPIC9-PKpFMS1-PHO5 и pPIC9-PKpFMS2-PHO5

Для получения плазмид pPIC9-PKpFMS1-PHO5 и pPIC9-PKpFMS2-PHO5 проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с праймерами к промоторам генов KpFMS1 (KpFMS1F и KpFMS1R) и KpFMS2 (KpFMS2F и KpFMS2R) и хромосомной ДНК штамма K. phaffii 4-GS115 в качестве матрицы. Выделение хромосомной ДНК из клеток дрожжей проводили согласно [15]. Последовательности промоторов были клонированы в полученный ранее вектор pPIC9-PHO5 [14] с использованием сайтов рестрикции AatII и BamHI. При этом происходило замещение промотора гена алкогольоксидазы 1 AOX1 на промоторы генов полиаминоксидаз KpFMS1 и KpFMS2. Трансформацию бактерий проводили согласно [16]. В результате были сконструированы плазмиды, в которых под контролем промоторов генов KpFMS1 и KpFMS2 находятся последовательности репортерного гена кислой фосфатазы (КФ) PHO5 дрожжей S. cerevisiae. Также эти плазмиды содержат ген HIS4 в качестве селективного маркера.

Структуру итоговых плазмид pPIC9-PKpFMS1-PHO5 и pPIC9-PKpFMS2-PHO5 проверяли с помощью методов ПЦР и рестрикционного анализа.

Получение штаммов РFMS1-4-GS115 и РFMS2-4-GS115

Плазмидами pPIC9-PKpFMS1-PHO5 и pPIC9-PKpFMS2-PHO5 трансформировали штамм 4-GS115. Для этого плазмиды линеаризовали с помощью эндонуклеазы рестрикции StuI и трансформировали клетки дрожжей методом электропорации [17]. При этом происходила интеграция генетической конструкции в геном K. phaffii. Селекцию трансформантов проводили за счет восстановления прототрофности по гистидину. Для анализа интеграции плазмиды выделяли хромосомную ДНК из трансформантов и проводили ПЦР с праймерами к промоторам генов полиаминоксидаз и гену PHO5 (KpFMS1F и PHO5R для РFMS1-4-GS115; KpFMS2F и PHO5R для РFMS2-4-GS115).

Молекулярные методы

Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции BamHI, AatII и StuI производили при условиях, предложенных фирмой-производителем ферментов (Thermo Fisher Scientific Inc., США). Дефосфорилирование вектора производили с помощью фосфатазы FastAP (Thermo Fisher Scientific Inc., США) одновременно с гидролизом ДНК эндонуклеазами рестрикции. Очистку ДНК из агарозных гелей и реакционных смесей проводили с помощью наборов Cleanup Standard (Евроген, Россия). Лигирование фрагментов ДНК проводили с помощью T4 ДНК лигазы (Евроген, Россия). Выделение плазмидной ДНК проводили с помощью наборов Plasmid Miniprep (Евроген, Россия). Для проведения ПЦР использовали наборы реактивов Encyclo Plus PCR (Евроген, Россия). Электрофорез фрагментов ДНК проводили в 0,7 % агарозном геле в буфере TAE [18].

Качественное определение активности кислой фосфатазы

На поверхность среды с выросшими колониями дрожжей накладывали бумажные фильтры, смоченные раствором субстрата α-нафтилфосфата и красителя синего прочного Б, растворенных в 0,1 М цитратного буфера рН 4,6 до концентрации 2 мг/мл. Через 10 мин оценивали интенсивность окрашивания колоний дрожжей [19].

РЕЗУЛЬТАТЫ

  1. Биоинформатический анализ протеомов дрожжей подотдела Saccharomycotina

На первом этапе работы изучили распространенность полиаминоксидаз среди основных представителей подотдела Saccharomycotina (отдел Ascomycota). Для этого с помощью алгоритма BLAST провели поиск гомологичных белков в протеомах 22 видов дрожжей, относящихся к разным семействам данного отдела, а также в протеоме мицелиального гриба Neurospora crassa (представителя подотдела Pezizomycotina, входящего в отдел Ascomycota). В качестве образца для сравнения использовали аминокислотную последовательность полиаминоксидазы дрожжей S. cerevisiae Fms1p [9]. Подобный подход применяли ранее при поиске полиаминоксидаз среди фитопатогенных грибов [8]. Результаты представлены на рис. 1.

 

Рис. 1. Распространенность полиаминоксидаз среди основных представителей подотдела Saccharomycotina. Филогенетические отношения показаны, основываясь на результатах, полученных в работе [20]. Обозначение ПГД отделяет родственные виды, предки которых претерпели полногеномную дупликацию [28]

 

Показано, что полиаминоксидазы и соответствующие им гены присутствуют у всех исследованных видов из разных семейств подотдела Saccharomycotina. При этом в зависимости от систематического положения количество белков полиаминоксидаз и соответствующих им генов у исследованных видов разное: 1) основные представители семейств Ascoideaceae, Phaffomycetaceae, Saccharomycetaceae содержат только один ген, 2) представители семейств Debaryomycetaceae, Metschnikowiaceae и клады Yarrowia — два гена, 3) представители семейства Pichiaceae — 3 гена. Исключением для этого семейства являются дрожжи Komagataella phaffii (больше известные под своим старым названием — Pichia pastoris), у которых обнаружены два гена. Этот вид дрожжей является представителем клады Komagataella, которую в работе [20] относят к парафилетическому семейству Pichiaceae.

Проведение филогенетического анализа с использованием последовательностей генов полиаминоксидаз оказалось затруднено большими различиями между нуклеотидными последовательностями обнаруженных генов. Поэтому проводили множественное сравнение аминокислотных последовательностей всех полиаминоксидаз, обнаруженных у исследуемых видов дрожжей (рис. 2).

 

Рис. 2. Результаты множественного сравнения аминокислотных последовательностей полиаминоксидаз исследуемых видов дрожжей. Показана представленность последовательностей PTS1, обеспечивающих локализацию белка в пероксисомах, на С-конце полиаминоксидаз исследованных видов дрожжей. Подчеркиванием выделены аминокислоты, отличные от известной для S. cerevisiae консенсусной последовательности [22]

 

Полученные результаты позволяют объединить аминокислотные последовательности полиаминоксидаз в группы (ПАО) на основании их сходства. Группа ПАО1 объединяет белки, обнаруженные у представителей семейств Ascoideaceae, Phaffomycetaceae, Saccharomycetaceae, у которых был выявлен только один ген полиаминоксидаз. Группы ПАО2.1 и ПАО2.2 объединяют белки, обнаруженные у представителей семейства Metschnikowiaceae, у которых было выявлено два гена. ПАО3.1, ПАО3.2 и ПАО3.3 объединяют белки, обнаруженные у представителей семейства Pichiaceae, у большинства из которых было выявлено три гена. К этим группам (ПАО3.1 и ПАО3.2) относятся также белки дрожжей Babjeviella inositovora (Debaryomycetaceae, два гена). Внутри самих групп ПАО результаты множественного сравнения последовательностей в целом отражают филогенетические отношения в соответствующих семействах подотдела Saccharomycotina.

  1. Биоинформатический анализ внутриклеточной локализации полиаминоксидаз

Побочным продуктом реакций, осуществляемых полиаминоксидазами, является перекись водорода, которая опасна для клеток. Поэтому у растений и у животных некоторые полиаминоксидазы направляются в пероксисомы [7]. Для всех полиаминоксидаз был проведен поиск сигнальных последовательностей, обеспечивающих их транспорт в различные клеточные органеллы, в первую очередь в пероксисомы. Известны два основных типа сигналов, обеспечивающих транспорт белков в пероксисомы — PTS1 и PTS2 (Peroxisomal Targeting Signals). Наиболее распространенным является сигнал PTS1, который встречается более чем у 95 % белков матрикса пероксисом. Исходно сигнал PTS1 был определен как последовательность из трех аминокислот на С-конце белка — SKL. Однако затем было показано, что этот сигнал может варьировать и представляет из себя консенсусную последовательность [21]. Результаты анализа последовательностей полиаминоксидаз на наличие сигналов пероксисомной локализации представлены на рис. 2.

Показано, что среди исследованных полиаминоксидаз, выделяются группы ПАО2.2 и ПАО3.2, представители которой часто (в 6 случаях из 9) содержат на С-конце сигнал PTS1, соответствующий консенсусной последовательности. При этом у трех белков последовательность на С-конце не соответствует консенсусной, но очень близка к ней. Последовательности полиаминоксидаз также были проанализированы с использованием сервиса DeepLoc-1.0. Для предсказания локализации белка в клетке данная программа использует подход, основанный не на поиске известных сигнальных последовательностей, а на машинном обучении [22]. С использованием данного алгоритма в качестве наиболее вероятного варианта локализации полиаминоксидазы дрожжей K. phaffii XP_002494272.1 (ген KpFMS2) были предсказаны пероксисомы.

Дрожжи K. phaffii, исследуемые в данной работе, относятся к метилотрофам, которые способны использовать метиловый спирт в качестве единственного источника углерода и энергии. Первые реакции пути утилизации метанола происходят в пероксисомах, что также связано с образованием перекиси водорода при окислении метанола до формальдегида алкогольоксидазами [23]. Анализ генома K. phaffii показал, что у этого вида дрожжей идентифицированы два несцепленных гена полиаминоксидаз KpFMS1 и KpFMS2. При этом один из них (KpFMS2) расположен рядом с геном алкогольоксидазы 1 (AOX1). Гены KpFMS2 и AOX1 располагаются «голова к голове» (head to head), и их промоторные области могут перекрываться (рис. 3), что может влиять на регуляцию транскрипции KpFMS2.

 

Рис. 3. Взаимное расположение генов KpFMS2 и АОХ1 K. phaffii. Показаны сайты связывания транскрипционных факторов Mxr1p и Nrg1p, являющихся основными регуляторами промотора гена AOX1

 

  1. Сравнительное изучение экспрессии генов KpFMS1 и KpFMS2 у дрожжей K. phaffii

Для исследования регуляции активности промоторов генов полиаминоксидаз были получены штаммы РFMS1-4-GS115 и РFMS2-4-GS115, которые содержат в своих геномах последовательность репортерного гена кислой фосфатазы РНО5 под контролем промоторов генов полиаминоксидаз. Для сравнения активности промоторов генов KpFMS2 и AOX1 был также использован полученный ранее [14] штамм tr2-4-GS115, содержащий ген РНО5 под контролем промотора гена AOX1. Штаммы высевали в серии разведений на твердые среды с различными источниками углерода и азота. В качестве источников углерода использовали глицерин и метанол. В качестве источников азота использовали сульфат аммония. Отдельно использовали полную среду YEPD, содержащую глюкозу, дрожжевой экстракт и пептон. Результаты качественного анализа активности репортерного гена РНО5 у штаммов РFMS1-4-GS115, РFMS2-4-GS115 и tr2-4-GS115 представлены на рис. 4.

 

Рис. 4. Активность репортерной кислой фосфатазы штаммов K. phaffii PFMS1-4-GS115, PFMS2-4-GS115 и tr2-4-GS115 при росте на средах с различными источниками углерода и азота

 

На среде YEPD, где в качестве источника углерода используется глюкоза, а источником азота являются смесь аминокислот и олигопептидов, наблюдается активность промотора гена KpFMS2. В этих условиях активности промотора гена KpFMS1 не было обнаружено, а экспрессии гена АОХ1, как и следовало ожидать [24], не происходит.

На средах с глицерином в качестве источника углерода промоторы генов полиаминоксидаз неактивны. Экспрессия гена АОХ1 на таких средах была репрессирована глицерином.

На среде с метанолом в качестве источника углерода промоторы генов KpFMS2 и АОХ1 активны. Активности промотора гена KpFMS1 не было обнаружено.

ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что дупликации играют важную роль в эволюции живых организмов. Дупликации создают дополнительные копии генетического материала и вносят значительный вклад в создание разнообразия геномов. Судьба дуплицированных генов может быть различной. Мутации могут накапливаться как в структурной, так и в регуляторной частях. В результате в ходе эволюции с дуплицированными генами могут происходить следующие процессы: 1) сохранение, при котором две копии гена сохраняют функцию предкового гена, 2) неофункционализация, при которой один из генов развивает новую функцию, тогда как другой сохраняет функцию предкового гена, 3) субфункционализация, в случае которой две копии развивают различные функции и работают совместно для того, чтобы компенсировать функцию предкового гена, и 4) специализация, когда две копии развивают различные функции, и при этом их общая функция также отличается от предковой функции (то есть здесь объединяются процессы неофункционализации и субфункционализации) [25, 26]. Кроме того, за счет изменения регуляторных областей структурные гены могут становиться частью других регулонов, отвечая на новые сигналы за счет взаимодействия с новыми регуляторными факторами.

В данной работе впервые проведен биоинформатический анализ распространенности полиаминоксидаз среди основных представителей подотдела Saccharomycotina (отдел Ascomycota). Продемонстрировано, что у всех исследуемых видов присутствуют полиаминоксидазы и соответствующие гены, однако их копийность различна. Показано, что количество копий коррелирует с систематическим положением исследуемых видов. Интересно, что представители семейства Saccharomycetaceae, к которому относятся дрожжи S. cerevisiae, а также родственных семейств Ascoideaceae и Phaffomycetaceae имеют только один ген полиаминоксидазы. При этом предки S. cerevisiae в ходе эволюции претерпели полногеномную дупликацию [27]. Таким образом, один из двух генов полиаминоксидаз, образовавшихся в ходе дупликации у S. cerevisiae, в дальнейшем был утрачен, и данному виду дрожжей достаточно активности одного гена.

В то же время у представителей других семейств подотдела Saccharomycotina сохранились два или даже три гена полиаминоксидаз. Последовательности эти генов сильно дивергировали, а кодируемые ими белки предположительно характеризуются различной внутриклеточной локализацией. У большинства проанализированных видов, представителей семейств Debaryomycetaceae, Metschnikowiaceae, Pichiaceae и клады Yarrowia, одна из полиаминоксидаз (группы ПАО2.2 и ПАО3.2) содержит последовательность, направляющую ее в пероксисомы. Белки дрожжей B. inositovora, Metschnikowia sp. и Ogataea parapolymorpha, относящиеся к данным группам полиаминоксидаз, несут на С-конце последовательности, которые хотя и не соответствуют консенсусной последовательности PTS1 S. cerevisiae, но очень близки к ней. Дальнейший анализ их локализации может расширить набор известных для дрожжей сигналов PTS1, направляющих белки в пероксисомы.

Обнаруженные различия в представленности генов полиаминоксидаз могут быть связаны с особенностями метаболизма различных видов дрожжей. В этом отношении особенно интересно изучение регуляции генов полиаминоксидаз у метилотрофных дрожжей K. phaffii. Эти дрожжи способны использовать метиловый спирт в качестве единственного источника углерода и энергии. Алкогольоксидаза катализирует первую реакцию метаболизма метанола. Этот фермент работает внутри пероксисом, поскольку его активность сопряжена с образованием токсичного для клетки побочного продукта — перекиси водорода. Ген алкогольоксидазы 1 строго регулируется источником углерода в среде. На средах с глюкозой и глицерином наблюдается его репрессия, а на среде с метанолом происходит активация промотора данного гена [24]. Транскрипционный активатор Mxr1р является основным регулятором активности промотора гена АОХ1 [28].

В представленной работе показано, что один из двух генов полиаминоксидаз K. phaffii KpFMS2 расположен рядом с геном АОХ1 «голова к голове». Сайты связывания белка Mxr1 5’-CYCC-3’ [29] распределены по всей области между кодирующими последовательностями генов KpFMS2 и АОХ1 и находятся на разных цепях (см. рис. 3). Белок Nrg1p обеспечивает репрессию гена АОХ1 у K. phaffii при наличии глицерина и глюкозы в среде [30]. Одна из областей, с которой взаимодействует Nrg1p, расположена вблизи кодирующей последовательности гена KpFMS2, вторая — вблизи гена АОХ1 (см. рис. ٣). Таким образом, промоторные области данных генов могут перекрываться, а сами они иметь сходные элементы регуляции.

В данной работе было впервые показано, что промотор гена KpFMS2 (перекрывающийся с промотором гена АОХ1 и обеспечивающий транскрипцию в противоположном направлении) функционирует на средах с метанолом. Уровень его активности был заметно меньше, чем у промотора гена АОХ1. Так же, как и промотор гена АОХ1, промотор гена KpFMS2 был неактивен на средах с глицерином в качестве источника углерода. Но в то же время этот промотор был активен на среде YEPD. То есть в отличие от промотора гена АОХ1, его работа не подавляется глюкозой при росте K. phaffii на данной среде.

Таким образом, ген KpFMS2 в результате хромосомных перестроек оказался сцепленным с геном АОХ1. Данный ген сохраняет свои особенности регуляции, но на средах с глицерином и метанолом его промотор регулируется сходно с промотором гена АОХ1 и других генов метаболизма метанола, составляющих MUT-регулон. С одной стороны, это может являться побочным эффектом необычайно высокой активности промотора гена АОХ1. Известно, что эукариотические промоторы могут обеспечивать транскрипцию длинных некодирующих РНК (long noncoding RNAs) [31]. С другой стороны, вовлечение гена KpFMS2 в MUT-регулон могло быть закреплено в ходе эволюции. В пользу этого предположения свидетельствует близость группы полиаминоксидаз ПАО3.3, куда относится белок, кодируемый геном KpFMS2, группе ПАО3.2, куда входят белки, несущие сигналы PTS1. И, хотя сам белок KpFms2 K. phaffii такой последовательности не содержит, с помощью сервиса DeepLoc-1.0 для него предсказывается локализация в пероксисомах. Гены MUT-регулона активны при росте K. phaffii на средах с метанолом, когда в клетках этих дрожжей наблюдается активная сборка и работа пероксисом. Вовлечение гена KpFMS2 в MUT-регулон, вероятно, оказалось выгодно и было отобрано в ходе эволюции.

Активности промотора гена KpFMS1 в исследованных условиях не наблюдали. Это может быть следствием того, что этот промотор либо неактивен совсем, либо активируется в специфических условиях. Дальнейшее изучение функций и регуляции экспрессии генов полиаминоксидаз у K. phaffii важно как с теоретической точки зрения для понимания эволюции дуплицированных генов, так и с практической, в связи с огромной значимостью этих дрожжей и промоторов генов MUT-регулона для биотехнологии.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 18-34-00750 мол_а.

×

Об авторах

Алина Владиславовна Иванова

ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет»

Email: alinalans@gmail.com

студентка 4-го курса кафедры генетики и биотехнологии

Россия, 199034, г. Санкт-Петербург, Университетская наб., д.7/9

Антон Витальевич Сидорин

ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет»

Email: spacerocketpilot@gmail.com

бакалавр кафедры генетики и биотехнологии

Россия, 199034, г. Санкт-Петербург, Университетская наб., д.7/9

Елена Викторовна Самбук

ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет»

Email: esambuk@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0837-0498
SPIN-код: 8281-8020
Scopus Author ID: 6603061322
ResearcherId: H-6895-2013

д-р биол. наук, профессор кафедры генетики и биотехнологии

Россия, 199034, г. Санкт-Петербург, Университетская наб., д.7/9

Андрей Михайлович Румянцев

ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет»

Автор, ответственный за переписку.
Email: rumyantsev-am@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1744-3890
SPIN-код: 9335-1184
Scopus Author ID: 55370658800

канд. биол. наук, младший научный сотрудник кафедры генетики и биотехнологии

Россия, 199034, г. Санкт-Петербург, Университетская наб., д.7/9

Список литературы

  1. Wallace HM, Fraser AV, Hughes A. A perspective of polyamine metabolism. Biochem J. 2003;376(Pt 1):1-14. https://doi.org/10.1042/BJ20031327.
  2. Miller-Fleming L, Olin-Sandoval V, Campbell K, Ralser M. Remaining mysteries of molecular biology: the role of polyamines in the cell. J Mol Biol. 2015;427(21):3389-3406. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2015.06.020.
  3. Wallace HM. Polyamines: specific metabolic regulators or multifunctional polycations? Biochem Soc Trans. 1998;26(4):569-571. https://doi.org/10.1042/bst0260569.
  4. White WH, Gunyuzlu PL, Toyn JH. Saccharomyces cerevisiae is capable of de novo pantothenic acid biosynthesis involving a novel pathway of beta-alanine production from spermine. J Biol Chem. 2001;276(14):10794-10800. https://doi.org/10.1074/jbc.M009804200.
  5. Chattopadhyay MK, Tabor CW, Tabor H. Spermidine but not spermine is essential for hypusine biosynthesis and growth in Saccharomyces cerevisiae: spermine is converted to spermidine in vivo by the FMS1-amine oxidase. Proc Natl Acad Sci USA. 2003;100(24):13869-74. https://doi.org/10.1073/pnas.1835918100.
  6. Polticelli F, Salvi D, Mariottini P, et al. Molecular evolution of the polyamine oxidase gene family in Metazoa. BMC Evol Biol. 2012;12:90. https://doi.org/10.1186/1471-2148-12-90.
  7. Reumann S, Ma C, Lemke S, Babujee L. AraPerox. A database of putative Arabidopsis proteins from plant peroxisomes. Plant Physiol. 2004;136(1):2587-2608. https://doi.org/10.1104/pp.104.043695.
  8. Valdes-Santiago L, Cervantes-Chavez JA, Leon-Ramirez CG, Ruiz-Herrera J. Polyamine metabolism in fungi with emphasis on phytopathogenic species. J Amino Acids. 2012;2012:837932. https://doi.org/10.1155/2012/837932.
  9. Landry J, Sternglanz R. Yeast Fms1 is a FAD-utilizing polyamine oxidase. Biochem Biophys Res Commun. 2003;303(3):771-776. https://doi.org/10.1016/s0006-291x(03)00416-9.
  10. Altschul SF, Gish W, Miller W, et al. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1990;215(3): 403-410. https://doi.org/10.1016/S0022-2836(05) 80360-2.
  11. Kumar S, Stecher G, Li M, et al. MEGA X: Molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms. Mol Biol Evol. 2018;35(6):1547-1549. https://doi.org/10.1093/molbev/msy096.
  12. Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 1994;22(22):4673-4680. https://doi.org/10.1093/nar/22.22.4673.
  13. Le SQ, Gascuel O. An improved general amino acid replacement matrix. Mol Biol Evol. 2008;25(7):1307-20. https://doi.org/10.1093/molbev/msn067.
  14. Rumjantsev AM, Bondareva OV, Padkina MV, Sambuk EV. Effect of nitrogen source and inorganic phosphate concentration on methanol utilization and PEX genes expression in Pichia pastoris. Scientific World Journal. 2014;2014:743615. https://doi.org/10.1155/2014/743615.
  15. Guthrie C, Fink GR. Guide to yeast genetics and molecular biology. Methods Enzymol. 1991;194: 1-863. https://doi.org/10.1016/s0076-6879(00)x 0276-5.
  16. Hanahan D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J Mol Biol. 1983;166(4):557-580. https://doi.org/10.1016/s0022-2836(83)80284-8.
  17. Wu S, Letchworth GJ. High efficiency transformation by electroporation of Pichia pastoris pretreated with lithium acetate and dithiothreitol. Biotechniques. 2004;36(1):152-154. https://doi.org/10.2144/04361DD02.
  18. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). – М.: Наука, 1981. – 288 с. [Osterman LA. Metody issledovaniya belkov i nukleinovykh kislot. Elektroforez i ul’tratsentrifugirovaniye (prakticheskoye posobiye). Moscow: Nauka; 1981. 288 p. (In Russ).]
  19. Самсонова М.Г., Падкина М.В., Краснопевцева Н.Г. Генетико-биохимическое изучение кислых фосфатаз дрожжей Saccharomyces cerevisiae // Генетика. – 1975. – Т. 11. – № 9. – С. 104-115. [Samsonova MG, Padkina MV, Krasnopevtseva NG. Genetiko-biokhimicheskoye izucheniye kislykh fosfataz drozhzhey Saccharomyces cerevisiae. Genetika. 1975;11(9):104-115. (In Russ.)]
  20. Shen XX, Zhou X, Kominek J, et al. Reconstructing the backbone of the Saccharomycotina yeast phylogeny using genome-scale data. G3 (Bethesda). 2016;6(12):3927-3939. https://doi.org/10.1534/g3.116.034744.
  21. Notzel C, Lingner T, Klingenberg H, Thoms S. Identification of new fungal peroxisomal matrix proteins and revision of the PTS1 consensus. Traffic. 2016;17(10):1110-1124. https://doi.org/10.1111/tra.12426.
  22. Almagro Armenteros JJ, Sonderby CK, Sonderby SK, et al. DeepLoc: prediction of protein subcellular localization using deep learning. Bioinformatics. 2017;33(21):3387-3395. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btx431.
  23. Ellis SB, Brust PF, Koutz PJ, et al. Isolation of alcohol oxidase and two other methanol regulatable genes from the yeast Pichia pastoris. Mol Cell Biol. 1985;5(5):1111-21. https://doi.org/10.1128/mcb.5.5.1111.
  24. Tschopp JF, Brust PF, Cregg JM, et al. Expression of the lacZ gene from two methanol-regulated promoters in Pichia pastoris. Nucleic Acids Res. 1987;15(9):3859-76. https://doi.org/10.1093/nar/15.9.3859.
  25. Assis R, Bachtrog D. Neofunctionalization of young duplicate genes in Drosophila. Proc Natl Acad Sci. 2013;110(43):17409-17414. https://doi.org/10.1073/pnas.1313759110.
  26. He X, Zhang J. Rapid subfunctionalization accompanied by prolonged and substantial neofunctionalization in duplicate gene evolution. Genetics. 2005;169(2):1157-1164. https://doi.org/10.1534/genetics.104.037051.
  27. Kellis M, Birren BW, Lander ES. Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 2004;428(6983):617-624. https://doi.org/10.1038/nature02424.
  28. Lin-Cereghino GP, Godfrey L, de la Cruz BJ, et al. Mxr1p, a key regulator of the methanol utilization pathway and peroxisomal genes in Pichia pastoris. Mol Cell Biol. 2006;26(3):883-897. https://doi.org/10.1128/MCB.26.3.883-897.2006.
  29. Kranthi BV, Kumar R, Kumar NV, et al. Identification of key DNA elements involved in promoter recognition by Mxr1p, a master regulator of methanol utilization pathway in Pichia pastoris. Biochim Biophys Acta. 2009;1789(6-8):460-468. https://doi.org/10.1016/j.bbagrm.2009.05.004.
  30. Wang X, Cai M, Shi L, et al. PpNrg1 is a transcriptional repressor for glucose and glycerol repression of AOX1 promoter in methylotrophic yeast Pichia pastoris. Biotechnol Lett. 2016;38(2):291-298. https://doi.org/10.1007/s10529-015-1972-4.
  31. Wilkinson D, Váchová L, Hlaváček O, et al. Long noncoding RNAs in yeast cells and differentiated subpopulations of yeast colonies and biofilms. Oxid Med Cell Longev. 2018;2018:4950591. https://doi.org/10.1155/2018/4950591.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Распространенность полиаминоксидаз среди основных представителей подотдела Saccharomycotina. Филогенетические отношения показаны, основываясь на результатах, полученных в работе [20]. Обозначение ПГД отделяет родственные виды, предки которых претерпели полногеномную дупликацию [28]

Скачать (233KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Результаты множественного сравнения аминокислотных последовательностей полиаминоксидаз исследуемых видов дрожжей. Показана представленность последовательностей PTS1, обеспечивающих локализацию белка в пероксисомах, на С-конце полиаминоксидаз исследованных видов дрожжей. Подчеркиванием выделены аминокислоты, отличные от известной для S. cerevisiae консенсусной последовательности [22]

Скачать (274KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Взаимное расположение генов KpFMS2 и АОХ1 K. phaffii. Показаны сайты связывания транскрипционных факторов Mxr1p и Nrg1p, являющихся основными регуляторами промотора гена AOX1

Скачать (39KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Активность репортерной кислой фосфатазы штаммов K. phaffii PFMS1-4-GS115, PFMS2-4-GS115 и tr2-4-GS115 при росте на средах с различными источниками углерода и азота

Скачать (83KB)
Метаданные
6. Таблица 1. Последовательности праймеров, использованных в работе

Скачать (63KB)
Метаданные

© Иванова А.В., Сидорин А.В., Самбук Е.В., Румянцев А.М., 2019

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 65617 от 04.05.2016.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах