Фармакологическая коррекция гено- и миелотоксичности паклитаксела экстрактом из культуры hairy root шлемника байкальского
- Авторы: Неупокоева О.В.1, Федорова Е.П.1, Ермолаева Л.А.1, Филонова М.В.1, Чурин А.А.1, Воронова О.Л.1, Фомина Т.И.1
-
Учреждения:
- ФГБНУ «НИИФиРМ им. Е. Д. Гольдберга»
- Выпуск: Том 13, № 4 (2015)
- Страницы: 16-21
- Раздел: Статьи
- Статья получена: 30.03.2016
- Статья опубликована: 15.12.2015
- URL: https://journals.eco-vector.com/ecolgenet/article/view/2432
- DOI: https://doi.org/10.17816/ecogen13416-21
- ID: 2432
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Ключевые слова
Полный текст
Введение Одним из важнейших направлений решения проблемы фармакологического лечения онкологических больных является поиск препаратов - корректоров нежелательных последствий противоопухолевой химиотерапии (таких как развитие миелосупрессии или генетические нарушения, способствующие возникновению вторичных опухолей у пролеченных пациентов (Резцова, 2007; Boivin, 1990). Фармакологические корректоры позволят снизить токсические эффекты цитостатиков и защитить генетические структуры. Важным представляется и то, чтобы корректоры не уменьшали терапевтическую активность используемых препаратов в клинике. Сравнительно недавно в клинической практике появился противоопухолевый препарат паклитаксел, который используется при раке яичников, раке молочной железы, немелкоклеточном раке легких, плоскоклеточном раке головы и шеи, переходноклеточном раке мочевого пузыря, раке пищевода, лейкозе, саркоме Капоши у больных СПИДом (Корман, 2006). На сегодняшний день паклитаксел является одним из наиболее активных препаратов 2-й линии химиотерапии у больных с прогрессированием после ранее проведенного лечения с включением производных платины (Ганьшина, Сельчук, 2004; Adamoa et al., 2004). Механизм цитотоксического антимитотического действия паклитаксела обусловлен его способностью связываться с β-тубулином, что активирует сборку микротрубочек и стабилизирует их (Rowinsky, 1995). В механизме действия препарата также показано его апоптозиндуцирующее действие (Blagosklonny et al., 1996). Препараты, полученные биотехнологическим путем, не уступают по качеству своим аналогам природного происхождения, поэтому их использование в медицине перспективно. Промышленный способ выращивания изолированных культур, таких как Scutellaria baicalensis Georgi, за счет контролируемых условий дает возможность за короткий срок 30-45 суток получать значительный объем ценного лекарственного сырья (Tiwari et al., 2008). Цель: провести моделирование гено- и гематотоксичности противоопухолевым препаратом паклитакселом и изучить возможность коррекции, выявленных эффектов экстрактом трансформированных корней шлемника байкальского. Материалы и методы Эксперименты были проведены на самцах и самках мышей линии СВА/CaLac и аутбредных крысах-самках. Паклитаксел (Митотакс®, Dr. Reddy's, Индия) вводили мышам однократно внутрибрюшинно в максимально переносимой дозе (МПД) 40 мг/кг, крысам однократно внутривенно в МПД - 5 мг/кг. Для снижения токсичности животным внутрижелудочно вводили экстракт корней шлемника байкальского (ЭШБ) однократно в дозе 200 мг/кг и 5-дневным курсом в дозе 40 мг/кг. Экстракт высушенных корней шлемника байкальского, выращенных in vitro, получали обработкой измельченного растительного сырья 70 % этанолом на водяной бане с обратным холодильником при соотношении 1 : 20, температуре 80-85 °С в течение 1,5 ч. Выход экстракта от растительного сырья составляет 20 % (Неупокоева и др., 2013). Материал для получения экстракта (высушенная культура hairy root) был любезно предоставлен к. б. н. И. Н. Кузовкиной, Институт физиологии растений РАН, г. Москва (Kузовкина и др., 2014). Для оценки цитогенетических нарушений исследовали состояние хромосом метафазных пластинок костного мозга (содержание поврежденных метафаз, число аберрантных хромосом, полиплоидных клеток - учитывают по 100 метафаз от 1 животного, в экспериментальных группах и контроле по 5 животных, поэтому по 500 клеток на каждую точку) по модифицированному методу Форда (Москва, 2012). В тест-системе соматического мозаицизма (SMART-тест) (Москва, 2012) использовали селектированную мутантную линию самцов Dr. melanogaster генотипа wsn3/Y (w - white - белая окраска глаз, sn3 - singed - извитая, скрученная форма щетинок; оба гена рецессивные) и мутантную линию самок генотипа yellow (y/y, у-рецессивный ген, обусловливающий развитие желтой окраски тела и щетинок), полученные с кафедры цитологии и генетики Биологического института НИ ТГУ, г. Томск. Спонтанный уровень мутаций и рекомбинаций в данном тесте для данных линий Dr. melanogaster колеблется от 0,2 до 1,1 % (Москва, 2012). Девственных самок линии yellow в количестве 2 особей помещали вместе с 2 самцами линии wsn3 во флаконы, содержащие 5 мл стандартной питательной среды (Медведев Н. Н., 1968). Через 48 ч родителей пересаживали в пробирки со свежей питательной средой, а в прежние пробирки добавляли индуктор мутагенеза паклитаксел в концентрации 0,005 %. Для защиты структур наследственности через 2 ч после паклитаксела в питательную среду вводился ЭШБ в концентрации 0,08 %. В случае возникновения генных или хромосомных нарушений на голове, тораксе и скутеллюме самок дрозофил регистрировали мутантные пятна и щетинки (макрохеты) фенотипа yellow или singed. Отмечали общее количество просмотренных самок (1000), число самок с одиночными (у, sn3) и двойными пятнами (уsn3). Значимость различий для показателя частоты появления самок с мутациями при статистической обработке данных оценивали по критерию χ2 с поправкой Йеитса (Трухачева, 2012). Изучение показателей костного мозга у крыс проводили стандартными гематологическими методами (Гольдберг, 1992). Цитологические препараты костного мозга окрашивали комбинированно фиксатором-красителем Май-Грюнвальда и азур-II-эозином по Нохту (Гольдберг, 1992). Статистический анализ проводился программой StatPlus 2009. Для каждой выборки вычисляли среднее арифметическое (Х), ошибку среднего арифметического (m). Проверку на нормальность распределения проводили с помощью стандартизированных коэффициентов асимметрии и эксцесса. При несоответствии распределения нормальному закону использовали непараметрический критерий Манна-Уитни. Уровень значимости критериев задавали равным 1 и 5 %. Для 5%-го уровня значимости критическое значение χ2 составляет 3,84 (Трухачева, 2012). Результаты и обсуждение Однократное введение паклитаксела в дозе 40 мг/кг приводило к образованию геномных и структурных нарушений в клетках костного мозга (ККМ) мышей. Максимальное количество аберрантных хромосом было выявлено через 24 ч (у самцов этот показатель составил 7,5 ± 0,7 %, а у самок 13,2 ± 1,5 %, это достоверно выше, чем в контроле у самцов: 0,7 ± 0,3 % и самок - 1,0 ± 0,1 %, при p < 0,01). Это, вероятно, связано с повышением интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) и является следствием неспецифического токсического действия цитостатиков, в данном случае паклитаксела, и накоплением токсических продуктов его метаболизма (Ветошкина и др., 1998; Ермолаева, 2008). Через 48 ч после введения цитостатика в нашем исследовании выявлено максимальное количество клеток с геномной патологией - полиплоиды (19,9 ± 2,5 %), в контроле такой патологии не выявлено (0 %). Учет аберраций в метафазных пластинках костного мозга позволяет регистрировать клетки с кратно увеличенным набором хромосом. Через 3 месяца после применения паклитаксела на препаратах костного мозга мышей-самцов выявлены полиплоидные метафазы (1,2 ± 0,2 %) и структурные повреждения генетического материала (3,9 ± 0,4 %), представленные в основном одиночными делециями (рис. 1 А, В). У самок Dr. melanogaster первого поколения, развивавшихся в питательной среде с добавлением паклитаксела в концентрации 0,005 %, было отмечено появление одиночных пятен фенотипа y и sn, количество которых в 12 раз превышало число таковых у самок в контроле (0,5 ± 0,03 % в контроле и 4,7 ± 0,03 % в опыте, значение χ2 по сравнению с контролем составило 34,5, что больше критического табличного значения 3,84). Однократное и курсовое использование ЭШБ приводило к снижению повышенного при введении паклитаксела количества аберрантных клеток. Курсовое применение ЭШБ на паклитаксел-индуцированной модели оказывало более выраженное генопротекторное действие. Так, доля метафаз со структурными нарушениями после однократного применения ЭШБ и паклитаксела составила - 3,26 ± 0,24 % (по сравнению с группой паклитаксела - 6,3 ± 0,9 %), а после курсового - 1,8 ± 0,5 %, что соответствовало контрольному значению. У самок после курсового применения ЭШБ выявлено 3,9 ± 0,5 % аберрантных метафаз по сравнению с 11,97 ± 1,66 % при использовании паклитаксела без корректора. Предварительное применение экстракта не вызывало снижения количества полиплоидных клеток в ККМ мышей-самцов и самок, что косвенно указывает на то, что ЭШБ не изменяет механизм действия паклитаксела. Спустя 3 месяца после применения экстракта и инъекции цитостатика число аберрантных метафаз и полиплоидных клеток нормализовалось (1,5 ± 0,5 % и 0,5 ± 0,1 % соответственно при p < 0,05). У Dr. melanogaster в SMART-тесте применение ЭШБ способствовало тому, что мозаичных самок было зафиксировано в 1,7 раза меньше, чем в группе паклитаксела (2,6 ± 0,04 %, χ2 по сравнению с цитостатиком составил 4,98). Исследование влияния паклитаксела на генетические структуры ККМ соответствовало полученным данным по миелотоксичности препарата (Чурин и др., 2008; Федорова, 2011). Так, введение паклитаксела в МПД в ранние сроки у крыс вызывало развитие гипоплазии костного мозга: снижение содержания незрелых (5,3 ± 0,7 контроль и 2,2 ± 0,2 опыт показатели 106/бедро крыс через 24 ч после введения) и зрелых гранулоцитов, эритронормобластов (29,2 ± 4,7 контроль и 8,3 ± 0,9 опыт) и лимфоцитов. Курсовое 5-дневное введение ЭШБ способствовало увеличению общего количества миелокариоцитов (до 143,4 ± 7,6 106/бедро крыс, по сравнению с 110,6 ± 12 в группе паклитаксела) за счет повышения зрелых и незрелых нейтрофилов (3,7 ± 1,0) и эритроидных клеток костного мозга (53,0 ± 9,6) на протяжении всего периода исследования. Таким образом, в основе мутагенеза, индуцированного паклитакселом, лежат как общие механизмы (вызванные свободнорадикальными процессами), так и специфические, обусловленные «микротрубочковым» механизмом действия препарата. Соответственно, наблюдаемые мутагенные эффекты были представлены «специфической» геномной аномалией - полиплоидией в ККМ мышей самцов и самок - и одиночными разрывами хроматид (результат окислительного повреждения) как неспецифического последствия действия цитостатика (Карпова и др., 2007). Кроме того, активация процессов ПОЛ приводит к повреждению клеточных мембран, снижению антиоксидантной защиты и повышению активности лизосомальных ферментов (Семенов и др., 1994). Это приводит к нарушению структуры и функций, а в конечном счете, к гибели клетки. При этом наблюдалось угнетение всех ростков кроветворения, сопровождающееся развитием гипоплазии костного мозга (Чурин и др., 2008; Федорова, 2011). Применение ЭШБ не оказывало влияния на количество полиплоидных клеток, это косвенно указывает на то, что ЭШБ не влияет на механизм действия паклитаксела, а снижает его побочное кластогенное действие на структуру хромосом. Основной механизм действия паклитаксела заключается в сборке аномальных микротрубочек, что препятствует прохождению митоза, а так как в нашем исследовании выявлено, что введение ЭШБ не увеличивало и не уменьшало количества полиплоидов, было сделано предположение, что сборка аномальных микротрубочек не зависит от присутствия флавоноидов ЭШБ. Эти результаты могут оказаться существенным фактором для клинической практики. ЭШБ, содержащий флавоноиды вагонин и байкалин, проявляет антиоксидантные свойства и нейтрализует свободные радикалы и активные формы кислорода, образующиеся в результате ПОЛ, которые повреждают клетки и запускают механизм программированной гибели клетки (Chan et al., 2000; Gao et al., 2001). Антиоксидантные свойства ЭШБ способствовали снижению токсического влияния паклитаксела на генетический аппарат клетки и систему костного мозга в целом. Кроме того, известны иммуностимулирующие свойства ЭШБ, что, вероятно, способствовало нормализации цитогенетических показателей на отдаленных сроках исследования (Дыгай и др., 2008; Ильинских и др., 1992). После введения ЭШБ из костного мозга мышей исчезали мультиаберрантные клетки, вероятно, за счет активации системы репарации ДНК. Воздействие на эту мишень препятствовало переходу первичных повреждений ДНК в видимые аберрации, что также способствовало нормализации цитогенетических показателей на отдаленных сроках исследования. Соответствующая картина наблюдалась в костном мозге крыс. Таким образом, экстракт трансформированных корней шлемника байкальского при внутрижелудочном введении значительно снижает паклитаксел-индуцированные нарушения в костном мозге мышей и крыс, а также в соматических клетках Drosophila melanogaster.Об авторах
Оксана Владимировна Неупокоева
ФГБНУ «НИИФиРМ им. Е. Д. Гольдберга»
Email: repaov@mail.ru
м. н. с., отдел лекарственной токсикологии
Елена Павловна Федорова
ФГБНУ «НИИФиРМ им. Е. Д. Гольдберга»
Email: fedorova-elen@mail.ru
к. м. н., отдел лекарственной токсикологии
Любовь Александровна Ермолаева
ФГБНУ «НИИФиРМ им. Е. Д. Гольдберга»
Email: ermolaeva_la@mail.ru
к. м. н., отдел лекарственной токсикологии
Мария Васильевна Филонова
ФГБНУ «НИИФиРМ им. Е. Д. Гольдберга»
Email: caurus7@yandex.ru
аспирант, кафедра физиологии растений и биотехнологии
Алексей Александрович Чурин
ФГБНУ «НИИФиРМ им. Е. Д. Гольдберга»
Email: toxicology_lab@mail.ru
в. н. с., д. м. н., отдел лекарственной токсикологии
Ольга Леонидовна Воронова
ФГБНУ «НИИФиРМ им. Е. Д. Гольдберга»
Email: toxicology_lab@mail.ru
с. н. с., к. б. н., отдел лекарственной токсикологии
Татьяна Ивановна Фомина
ФГБНУ «НИИФиРМ им. Е. Д. Гольдберга»
Email: toxicology_lab@mail.ru
с. н. с., к. б. н., отдел лекарственной токсикологии
Список литературы
- Ветошкина Т. В., Дубская Т. Ю., Тимина Е. А. и др. (1998). Механизм гепатотоксического действия противоопухолевого препарата вепезида. Экспериментальная и клиническая фармакология. № 1: 54-56.
- Ганьшина И. П., Сельчук В. Ю. (2004). Использование таксола в клинической практике. Русский медицинский журнал. № 12 (19): С. 1108-1112.
- Гольдберг Е. Д., Дыгай А. М., Шахов В. П. (1992). Методы культуры ткани в гематологии. Томск.
- Дыгай А. М., ЖдановВ. В., Удут Е. В. (2009). Фармакологическая регуляция эритропоэза. М.: Издательство РАМН.
- Ермолаева Л. А. (2008). Гепатотоксичность противоопухолевых препаратов растительного происхождения паклитаксела и этопозида и ее фармакологическая коррекция: автореф. дис. … канд. мед. наук: 14.03.03, 14.03.06 / Ермолаева Любовь Александровна. Томск: ГУ НИИ Фармакологии СО РАМН - 21 с.
- Ильинских Н. Н., Ильинских И. Н., Бочаров Е. Ф. (1986). Цитогенетический гомеостаз и иммунитет. Новосибирск: изд-во «Наука».
- Карпова Г. В., Фомина Т. И., Воронова О. Л. и др. (2007). Миелотоксичность паклитаксела (митотакс). Экспериментальная и клиническая фармакология. Т. 70 (4): С. 39-43.
- Корман Д. Б. (2006). Основы противоопухолевой химиотерапии. М.: Практическая медицина.
- Кузовкина И. Н., Прокофьева М. Ю. (2014). Использование объектов коллекции генетически трансформированных корней в фундаментальных и прикладных исследованиях. Информационный бюллетень «Клеточные культуры», Т. 30: С. 33-41.
- Медведев Н. Н. (1968). Практическая генетика: учебно-методтческое пособие. М.: Наука.
- Неупокоева О. В., Воронова О. Л., Чурин А. А. и др. (2013). Коррекция цитогенетических эффектов паклитаксела и цисплатина экстрактом корней шлемника байкальского. Экспериментальная и клиническая фармакология. Т. 76 (12): С. 24-27.
- Резцова, В. В. (2007). Роль повреждений ДНК в регрессии опухолей после химиотерапии. Вопросы онкологии. Т. 53 (3): С. 262-268.
- Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая/Под общей редакцией А. Н. Миронова. М.: Гриф и К, 2012.
- Семенов В. В., Студенцова И. А., Дурнев А. Д. (1994). Антимутагены как модификаторы циклазной системы клетки. Вопросы медицинской химии. № 3: С. 48-51.
- Трухачева Н. В. (2012). Математическая статистика в медико-биологических исследованиях с применением пакета Statistica: книга для студентов, аспирантов и преподавателей медицинских колледжей и вузов. М.: ГЭОТАР-Медиа.
- Федорова Е. П. (2011). Миелотоксичность противоопухолевого препарата паклитаксела и ее фармакологическая коррекция: автореф. дис. … канд. мед. наук: 14.03.03, 14.03.06/Федорова Елена Павловна. Томск: НИИ Фармакологии СО РАМН, 25 с.
- Чурин А. А., Гольдберг В. Е., Карпова Г. В. и др. (2008). Реакции костномозгового кроветворения на токсическое воздействие паклитаксела. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. Т. 145 (2): С. 173-177.
- Adamoa V., Ferraroa G., Pergolizzi S. et al. (2004). Paclitaxel and cisplatin in patients with recurrent and metastatic head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. V. 40: P. 525-531.
- Blagosklonny M. V., Schulte T., Nguyen P. et al. (1996). Taxol-induced apoptosis and phosphorylation of Bcl-2 protein involves c-Raf-1 and represents a novel c-Raf-1 signal transduction pathway. Cancer Res. N 56: Р. 1851-1854.
- Boivin I.-F. (1990). Second cancers and other late side effects of cancer treatment. Cancer (Philad.). V. 65: P. 770-775.
- Chan F. L., Choi H. L., Chen Z. Y. et al. (2000). Induction of apoptosis in prostate cancer cell lines by a flavonoid, baicalin. Cancer Lett. V. 160 (2): P. 219-228.
- Gao Z., Huang K., Xu H. (2001). Protective effects of flavonoids in the roots of Scutellaria Baicalensis Georgi against hydrogen peroxide induced oxidative stress in HS-SY5Y cells. Pharmacological Research. V. 43 (2): P. 173-178.
- Rowinsky E. K., Donehower R. C. (1995). Paclitaxel (Taxol). New England Journal of Medicine. V. 332: Р. 1004-1014.
- Tiwari R. K., Trivedi Z.-C., Guang G.-Q. et al. (2008). Agrobacterium rhizogenes mediated transformation of Scutellaria baicalensis and production of flavonoids in hairy roots. Biologia Plantarum. V. 52 (1): Р. 26-35.