Маркеры индивидуальной радиочувствительности экстраэмбриональных клеток зародышей человека в условиях in vitro

Полный текст

Введение Способность к репарации повреждений ДНК является специфичной для каждого типа клеток и определяет их индивидуальную чувствительность к действию различных мутагенов, в том числе ионизирующему излучению. Процесс репарации ДНК во время внутриутробного развития остается мало изученным вопросом (Pachkowski et al., 2011). В связи с этим целью настоящего исследования явилась оценка эффективности репарации двунитевых разрывов ДНК и анализ особенностей чувствительности первичных экстраэмбриональных фибробластов человека к действию ионизирующего излучения. Материалы и методы Материалом для исследования послужили 18 первичных линий экстраэмбриональных фибробластов человека, выделенных из плодного мешка медицинских абортусов. Забор материала осуществляли на основе информированного согласия женщин. Культивирование клеток проводили по стандартной методике (Rooney, Czepulkowski, 1992) с небольшими изменениями. Облучение материала в дозе 1 Гр проводили с использованием гамма-терапевтического аппарата Theratron Equinox на базе клиники НИИ онкологии (г. Томск). Оценку уровня двунитевых разрывов ДНК проводили путем анализа числа фокусов гистона γH2AX. Для иммуноокрашивания были использованы первичные моноклональные мышиные антитела к белку γH2AX и вторичные кроличьи антитела с родамином (Novus, США), разведенные в 3 % FBS в концентрации 1 : 500. Окрашивание ядер проводили DAPI (0,3 мкМ) (Sigma, США), для защиты от выцветания на окрашенный препарат наносили среду Vectashield (Vector Labs, США). Частоту образования центромеронегативных микроядер, возникающих из хромосомного материала с нерепарированными двунитевыми разрывами ДНК, оценивали с помощью микроядерного теста в комбинации с флуоресцентной гибридизацией in situ (FISH) с панцентромерными ДНК-зондами по стандартной методике (Fenech, 2007). Анализ всех препаратов осуществляли на микроскопе Axio Imager Z2 (Zeiss, Германия) с применением системы Metafer (Metasystems, Германия). Статистическую обработку данных проводили с использованием критерия Манна-Уитни в программном пакете Statistica 6.0 (Statsoft). Результаты Частота фокусов γH2AX в контроле варьировала от 0,56 до 1,93 фокуса на клетку и в среднем составляла 1,01 ± 1,42 фокус/клетку. Через 30 минут после облучения частота фокусов γH2AX значимо возрастала до 10,21 ± 5,17 фокуса/клетку (p = 0,0006) с последующим снижением через 24 часа после облучения до уровня, не отличающегося значимо от контрольного (0,77 ± 0,36 фокуса/клетку). Эффективность репарации радиационно-индуцированных двунитевых разрывов ДНК в среднем составляла 97 %. Эффективность репарации была оценена в части линий (n = 9) как доля радиационно-индуцированных фокусов γH2AX, исчезнувших с 30 мин до 24 часов после облучения. Частота центромеронегативных микроядер значимо повышалась с 3,86 ± 2,12 % в контроле до 45,33 ± 19,23 % после облучения (p = 0,000 002). Важным вопросом является поиск маркеров индивидуальной радиочувствительности клеток человека, в качестве одного из которых рассматривается эффективность репарации двунитевых разрывов ДНК. Однако в настоящей работе не было выявлено значимой корреляции между уровнем фокусов γH2AX через 24 часа после облучения, являющихся маркером нерепарированных двунитевых разрывов ДНК, и частотой радиационно-индуцированных микроядер. Ранее мы обнаружили, что в лимфоцитах периферической крови взрослых индивидов маркером индивидуальной радиочувствительности может являться спонтанный уровень фокусов γH2AX (Melnikov et al., 2013). Однако в настоящей работе не было выявлено значимой корреляции между фоновым и радиационно-индуцированным уровнем фокусов γH2AX и радиационно-индуцированной частотой центромеронегативных микроядер. Возможно, это свидетельствует о специфичности клеточного ответа лимфоцитов и экстраэмбриональных фибробластов на действие радиации. С другой стороны, частота центромеронегативных микроядер, индуцированных радиацией, зависит от спонтанной частоты центромеронегативных микроядер до облучения (R = 0,52, p = 0,038). Вероятно, в экстраэмбриональных фибробластах человека способность к репарации радиационно-индуцированных повреждений ДНК отражает также потенциал репарации двунитевых разрывов ДНК, вызванных действием фоновых факторов. В соматических клетках взрослого организма эффективность репарации ДНК и радиочувствительность зависят от различных параметров, включая возраст индивида. Однако в экстраэмбриональных фибробластах человека не было обнаружено влияния срока беременности женщин, на котором было проведено прерывание беременности, на уровень фокусов γH2AX и микроядер, что указывает на отсутствие вклада данного фактора в изучаемый феномен. Заключение В работе впервые исследована связь между спонтанным уровнем фокусов γH2AX и частотой радиационно-индуцированных цитогенетических повреждений в экстраэмбриональных фибробластах человека. Сравнительный анализ зависимости реализации негативных эффектов излучения от активности системы репарации ДНК показал, что способность к репарации спонтанных двунитевых разрывов ДНК в фибробластах отражает также потенциал репарации радиационно-индуцированных повреждений.

Об авторах

Андрей Александрович Беленко

ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Томский государственный университет»

Email: greyden@sibmail.com
аспирант, кафедра физиологии человека и животных

Станислав Анатольевич Васильев

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт медицинской генетики» РАН

Email: stanislav.vasilyev@medgenetics.ru
научный сотрудник, лаборатория цитогенетики

Игорь Николаевич Лебедев

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт медицинской генетики» РАН

Email: igor.lebedev@medgenetics.ru
руководитель лаборатории цитогенетики

Список литературы

Дополнительные файлы