Ассоциация полиморфизма гена рецептора витамина D с антропометрическими показателями в группе этнических коми

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Широко распространено мнение о том, что дефицит витамина D характерен для «жителей северных регионов» (Gordon et al., 2004; Hodkinson et al., 1973; McKenna, 1992; Preece et al., 1975). Проблема, однако, в том, что понятие «северности» уточняется редко; между тем, оно принципиально важно. Установлено, что в коже жителей регионов, лежащих севернее 35 оСШ, витамин D с ноября по март практически не синтезируется (Holick, 2004; Webb et al., 1988). Поскольку 35-я параллель — это широта Северной Африки, к «северу» в этом контексте следует отнести всю территорию Европы, и тем более России. Таким образом, исследования D-витаминного статуса населения нашей страны и механизмов регуляции минерального обмена в кости (в том числе на генетическом уровне), актуальны уже в силу географической локализации российских популяций. Важным достижением последних десятилетий стала разработка методов, позволяющих оценить концентрацию в сыворотке крови транспортной формы витамина — 25-гидроксивитамина D3 (25-OHD3). Исследования содержания 25-OHD3 у представителей различных популяций многочисленны. Это открывает возможности для мета-анализа, обобщения данных многих работ, и анализа влияния на витаминный статус группы большого количества факторов — географических, экологических, социально-экономических, медико-антропологических. К сожалению, информация относительно витаминного статуса различных групп населения России скудна. Исследования в достаточных по объёму выборках проведены только в группах населения Средней полосы РФ (Михайлов и др., 2005; Смирнова и др., 2010; Ших, Сычёв, 2007) и Карелии (Viskari et al., 2006), а также среди ненцев Ненецкого АО (Блажеевич и др., 1983), коми и русских Уральского региона (Козлов и др., 2011, 2012; Потолицына и др., 2010; Bakhtyaroa et al., 2007). Но даже эти данные в сочетании с информацией, полученной при обширных исследованиях в Европе и Северной Америке, позволяют сделать вывод о том, что D-витаминный статус популяций определяется не собственно географической локализацией (т. е. низкой или высокой широтностью), а комплексом факторов (Holvik et al., 2008; Lips et al., 2001, 2006). Следует учитывать уровень УФ-облучения в диапазоне 280–315 нм (эритемная радиация), сезонные изменения инсоляции, тип питания и вклад локальных пищевых ресурсов, определяемые климатом и традициями особенности ношения одежды, повседневный уровень физических нагрузок и т. п. Вопрос о D-витаминном статусе и потребностях в кальцифероле коренного населения высокоширотных популяций особенно сложен. С одной стороны, имеется целый ряд указаний на пониженное, по «европейским» нормативам, содержание 25OHD3 в сыворотке крови индейцев субарктических регионов Канады и инуитов (эскимосов) Канады и Гренландии (Hayek et al., 2010; Lebrun et al., 1993; Weiler et al., 2006) и жителей северных районов Республики Коми (Потолицына и др., 2010). С другой стороны, всё больше данных свидетельствует о том, что у придерживающихся традиционного образа жизни и питания северян концентрация 25OHD3 выше, чем у перешедших к жизни в посёлках и городах (Блажеевич и др., 1983; Козлов, Атеева, 2011; Rejnmark et al., 2004). Несомненно, что значительную роль в данном случае играет состав традиционной пищи с высоким содержанием витамина D в мясе и жире рыб, морских млекопитающих и северного оленя (Козлов, Атеева, 2011; Björn, Wang, 2000). Однако следует обратить внимание и на возможную роль антропологических (в том числе расово и экологически обусловленных) характеристик, которые могут включать разную чувствительность тканей к кальциферолу (Frost, 2012), и на популяционную специфику генетических детерминант D-витаминного обмена. В связывании активной формы витамина участвует внутриклеточный рецептор, кодируемый геном локуса рецептора витамина D (VDR). По соответствующим сайтам распознавания эндонуклеаз (рестриктаз) выделяют его аллели, среди которых наибольший интерес в плане влияния на усвоение кальция и метаболизм костной ткани представляют FokI (rs10735810), BsmI (rs1544410), ApaI (rs7975232) и TaqαI (rs731236) (Uitterlinden et al., 2004). Их связь с особенностями роста и развития костной ткани выявлена у представителей европеоидной, негроидной и монголоидной расовых групп (Cooper, Umbach, 1996; d’Alesio et al., 2005; Fang, 2005; Ji et al., 2010; Minamitani et al., 1998; Morrison et al., 1994; Sainz et al., 1997; Tao et al., 1998; Vupputuri et al., 2006; Zmuda et al., 1997). Обнаружение ассоциации между генотипами FokI, BsmI, ApaI и TaqαI и развитием костной ткани естественным образом вызвало поиск связей и с другими антропометрическими характеристиками. Однако свести полученные данные в единую картину не удаётся. Одно из первых исследований, выполненное на материалах выборки 7–12-летних девочек мексиканок, не выявило значимых различий между представительницами разных генотипов VDR по длине и массе тела, массо-ростовым соотношениям (индексу массы тела — ИМТ) и площади поверхности тела (Sainz et al., 1997). С другой стороны, появились сообщения о различиях в длине тела у носителей аллелей BsmI (Arabi et al., 2009; Fang et al., 2007; Viitanen et al., 1996) и TaqαI (Ozaydin et al., 2010; Remes et al., 2005) в различных европейских (в том числе финских), арабской и турецкой выборках, а также о наличии слабых связей между значениями ИМТ и аллелями FokI и TaqαI у индусов (Vupputuri et al., 2006). Ф. Суарез с соавторами (Suarez et al., 1997) привели данные об ассоциированных с генотипом BsmI различиях в темпах роста у мальчиков французов на протяжении двух первых лет жизни (в выборке девочек различия не значимы). Несовпадение результатов этих (и многих других) исследований можно объяснять по-разному. Одна из причин — влияние на экспрессию гена VDR этнорасовых и средовых факторов. Косвенным подтверждением этому служат различия в массе костной ткани между европеоидами и негроидами США с одинаковым генотипом VDR (Nelson et al., 2000). Мы решили рассматривать ассоциации между полиморфизмом гена VDR и соматологическими признаками только в европеоидных группах, чтобы нивелировать возможное влияние расовой компоненты. К сожалению, несмотря на обширную в целом библиографию, удалось обнаружить лишь несколько публикаций относительно интересующих нас корреляций у жителей Северной Европы. В этой статье мы приводим данные о частотах аллелей гена VDR в выборке этнических коми и анализируем связь генотипов FokI, BsmI, ApaI и TaqαI с биохимическими (содержание 25-OHD3 в сыворотке крови) и соматологическими характеристиками коми (зырян), как представителей одной из групп населения северных регионов Европейской части Российской Федерации. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материал — данные, собранные в ноябре 2008 года. Обследованы школьники старших классов 13–17 лет (M = 15,0, SD = 1,2 года; n = 47) и студенты 18–23 лет (M = 21, SD = 1,4 года; n = 48) населённых пунктов Республики Коми, расположенных на 61–62 °CШ. Общая выборка включила 95 этнических коми. Далее мы обозначаем школьников как подростков, а студентов — как взрослых. Программа исследования включала проведение антропометрических исследований и забор крови для анализа витаминного статуса (на основании содержания 25-гидроксивитамина D3 в сыворотке крови) и полиморфизма гена VDR. Обследования проводились по согласованию с отделами образования соответствующих регионов в рамках ежегодных медицинских осмотров учащихся. Сбор материала проводили после получения информированного согласия детей, родителей и/или администраций школ на использование полученных данных в научных целях. План и организация исследования одобрены Комитетами по этике Пермского государственного педагогического университета и Университета Манитобы. Забор крови производился утром натощак из локтевой вены в вакутайнеры «Bekton Dickinson BP» (Англия). Для получения сыворотки кровь центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 минут. Образцы сывороток крови хранили при –20 ºС до выполнения анализа. Концентрация в сыворотке крови транспортной формы витамина D (25-гидроксивитамина D3, далее 25-OHD3) определялась методом иммуноферментного анализа с применением наборов фирмы «Immunodiagnostic Systems Ltd» (США). Геномную ДНК выделяли из собранных на фильтровальную бумагу образцов цельной крови с помощью наборов QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN). ПЦР-амплификацию аллелей гена VDR BsmI (T/C), ApaI (G/T), TaqαI (C/T) и FokI (T/C) проводили согласно опубликованным протоколам (Sainz et al., 1997; Selvaraj et al., 2004). При отсутствии сайта рестрикции BsmI в обоих аллелях, генотип обозначали как BB, при наличии сайта рестрикции в обоих аллелях — bb, у гетерозигот — Bb. Для остальных сайтов приняты аналогичные обозначения: ApaI G/T далее приводятся как A/a, TaqαI C/T как T/t, FokI T/C — как F/f. Фрагменты подвергали электрофорезу в 10%-м полиакриламидном геле; визуализацию проводили при ультрафиолетовом освещении с применением систем KODAK Gel Logic 200 Imaging System и KODAK 1D Image Analysis Software. Генотипирование проводилось по 95 образцам, но не во всех из них удалось определить тип по всем рассматриваемым сайтам. Антропометрические измерения проводили в утренние часы по унифицированной методике (Бунак, 1941). Толщину кожно-жировых складок измеряли калипером с постоянным давлением 10 г/мм 2 под лопаткой, над трицепсом, бицепсом, на животе, груди (только у юношей), предплечье, бедре и голени. На основании данных антропометрии, по методике Й. Матейки определяли содержание в организме жировой, мышечной и костной тканей (Matiegka, 1921). Индекс массы тела (ИМТ) рассчитывался по формуле: ИМТ = МТ/(ДТ) 2, где МТ — масса тела в кг, ДТ — длина тела, в м. У подростков верхней границей нормальных значений принят ИМТ = 25, у взрослых — ИМТ = 30 (Frisancho, 1990). Индивиды с превышением данных показателей при исследовании ассоциаций между антропометрическими, биохимическими и генетическими признаками в выборки не включались, чтобы избежать влияния возможных гормональных отклонений, связанных с ожирением. Анализ связи между признаками проведён в группе численностью 91 человек. Показатели длины и массы тела, ИМТ, значений мышечной, жировой и костной составляющих массы тела и содержания 25-OHD3 в сыворотке крови были выражены в Z-баллах, то есть подвергнуты преобразованию вида: Z = (P – M) / SD, где Z — стандартизированное значение, P — исходное значение, M — среднее арифметическое по группе, в которой производится стандартизация, SD — стандартное отклонение по группе, в которой производится стандартизация. Такое преобразование отражает количество стандартных отклонений, на которое индивидуальное значение отстоит от среднего по группе. Это позволяет исключить влияние признака принадлежности к половой и возрастной группе и дает возможность увеличить объем анализируемой выборки. После проведения стандартизации все значения были объединены. Сравнение подгрупп с разными генотипами по перечисленным показателям проводилось с использованием непараметрического теста Краскала–Уоллиса. Статистическая обработка производилась с применением программы Statistica (StatSoft Inc., Tulsa, OK, USA). РЕЗУЛЬТАТЫ Соматологические характеристики представителей обследованных возрастно-половых групп представлены в таблице 1. Проведенный ранее анализ показал, что тотальные размеры тела и значения ИМТ современных коми близки к характеристикам русского населения региона, а показатели физического развития школьников-коми отвечают российским и международным (по критериям Всемирной организации здравоохранения) нормативам (Козлов и др., 2009; Frisancho, 1990). Предварительные исследования не выявили межполовых различий в содержании 25-OHD3 (Козлов и др., 2011, 2012), поэтому в данной публикации приводятся характеристики подвыборок, разделённых по возрастным группам, но не по полу. Средние значения концентрации 25-OHD3 у подростков (M = 37,9, SD = 12,2 нмоль/л, n = 44) достоверно ниже, чем у взрослых (M = 47,7, SD = 12,0 нмоль/л, n = 52; p < 0,001). В обеих возрастных группах среднее содержание 25-OHD3 в сыворотке крови не достигает значений 50 нмоль/л, обычно принимаемых за нижнюю границу рекомендованного уровня содержания витамина D (Frost, 2012; Holick 2007; Roth et al., 2005). Частоты аллелей FokI, BsmI, ApaI и TaqαI и генотипов VDR в обследованной выборке приведены в таблице 2. Выявлено 9 гаплотипов, различающихся аллелями сайтов BsmI, ApaI и TaqαI. С наибольшей частотой (25 % выборки) представлен вариант BAT-bat, почти так же часто встречаются гаплотипы bAT-baT и baT-baT (22,8 % в обоих случаях). Реже встречаются варианты BAt-BAt и BAT-baT (соответственно 7,6 и 6,5 %); однократно обнаружены гаплотипы BAT-BAT, bAT-bAT и bat-bat. Соматологические и биохимические показатели подгрупп, различающихся по генотипу VDR (в виде Z-баллов, полученных в результате стандартизации) приведены на рисунках 1, 2. Значимых различий в содержании 25-OHD3 в сыворотке крови представителей рассмотренных генотипов и гаплотипов не выявлено. Различия в соматологических показателях носителей различных генотипов ApaI и TaqαI также ниже принятого уровня достоверности (p > 0,05). Поэтому далее мы рассмотрим только специфику соматологических характеристик по носительству генотипов FokI и BsmI. Носители генотипа FF-FokI отличаются от Ff значительно большей массой тела (p = 0,002), так что, даже несмотря на некоторое превосходство над Ff и в росте, монозиготы FF имеют более высокий массо-ростовой показатель — ИМТ (p < 0,01). Отличия FF-FokI от носителей аллеля f в содержании жировой и мышечной тканей незначимы, тогда как вклад костной ткани в общую массу тела у гетерозигот Ff больше, чем у монозигот FF (различия достоверны на уровне p = 0,06). Индивиды с гомозиготным генотипом BB-BsmI имеют достоверно меньшую длину тела по сравнению с носителями варианта Bb (p = 0,037). Однако средние значения Z-баллов массы тела у носителей всех генотипов BsmI очень близки, и различия в росте оказываются не столь значительными, чтобы между подгруппами проявились различия в массо-ростовых индексах. По относительному (к массе тела) содержанию костной ткани носители генотипа bb-BsmI значимо отстают от гетерозигот Bb (p = 0,025). Различия в содержании жировой и мышечной тканей у носителей разных генотипов незначимы. Своеобразие соматологических характеристик представителей различных гаплотипов сайтов BsmI, ApaI, TaqαI выявлено только по длине тела. Носители варианта BAT-baT достоверно превосходят индивидов с BAT-Bat (значения Z-баллов для длины тела соответственно Z1 = –0,586 Z2 = +0,862; p < 0,01), но обе подгруппы малочисленны (n1 = 6, n2 = 9). Средняя длина тела носителей гаплотипа BAt-BAt также относительно мала (Z3 = –0,204, n3 = 7; p > 0,05 при сравнении с подгруппами BAT-baT и BAT-Bat). Длина тела носителей остальных гаплотипов практически совпадает со средней для всей выборки. ОБСУЖДЕНИЕ Содержание витамина D (25-OHD3) в сыворотке крови коми (зырян) южных районов Республики Коми следует расценить как низкое (Козлов и др., 2011, 2012). Хотя все обследованные проживают в одном географическом регионе, а забор образцов для анализов проводился в одно время года, содержание 25-OHD3 достоверно различается у представителей возрастных групп (p < 0,001). Меньшая концентрация 25-OHD3 у подростков сравнительно со взрослыми отвечает результатам других исследователей (Holick, 2007). Также соответствует материалам публикаций и отсутствие в нашей выборке ассоциаций между полиморфизмом гена VDR и содержанием 25-OHD3 в сыворотке крови (Bezerra et al., 2008; Hibler et al., 2010). По частотам аллелей FokI и BsmI обследованная выборка не отличается от русского населения Москвы (Мякоткин и др., 2011; Тагиева и др., 2005). Можно заключить, что распределение аллелей гена VDR в выборке коми (зырян) укладывается в «европеоидный» спектр изменчивости. Соответственно, далее мы сравниваем полученные результаты только с материалами европеоидных выборок, обследованных на территории Европы, чтобы исключить возможное влияние расовой специфики в монголоидных и негроидных, а также этнически и расово смешанных (метисных) группах населения США, Канады, Бразилии, Индии. Обследованные нами носители генотипа FF-FokI отличаются от индивидов с наличием аллеля f большей массой тела при меньшем содержании костной ткани и относительно большой (по отношению к массе) длине тела. Значимы отличия от гетерозигот Ff по массе тела и ИМТ (p < 0,01), по относительному содержанию костной ткани (p = 0,06). Это значит, что у FF масса тела нарастает относительно длины за счёт мышечной и жировой тканей, но не костной, тогда как у Ff вклад массы скелета по сравнению с другими компонентами состава тела значительнее. Мы не расцениваем пониженное содержание костной ткани у FF в нашей выборке как противоречие данным о повышенных темпах резорбции костной ткани у русских и французских женщин с ff-FokI по сравнению с FF (Мякоткин и др., 2011; Eccleshall et al., 1998). Указанные исследования выполнены в выборках женщин старших возрастных групп, тогда как мы обследовали молодых индивидов, находящихся в периоде ростового спурта и следующей за ним стабилизации размеров тела. Поэтому рассматривать обнаруженные различия следует в контексте возрастной и, возможно, экологической специфики влияния генотипа VDR на метаболизм костной ткани. Индивиды с генотипом Bb-BsmI в нашей выборке отличаются большей длиной тела и более высоким развитием костной ткани по сравнению с носителями вариантов BB и bb соответственно (в обоих случаях p < 0,05). Это свидетельствует о меньшем вкладе костной ткани у гомозигот в общую массу тела и согласуется с наблюдениями, согласно которым в шведской выборке суммарная масса костной и мышечной тканей (так называемая обезжиренная, или «тощая» масса тела — lean body mass) у носителей генотипа Bb проявляет тенденцию к превышению значений у гомозигот, тогда как жировой компонент у BB-BsmI выше, чем у bb (Grundberg et al., 2004). И наши данные, и материалы E. Grundberg et al. (2004) косвенно подтверждают заключение о снижении эффективности абсорбции кальция носителями генотипа BB-BsmI по сравнению bb (Dawson-Hughes et al., 1995; Ferrara et al., 2002). Выявленные нами различия в длине тела (Bb > bb > BB) отвечают результатам исследований в выборке этнических французов (Suarez et al., 1997), хотя у голландцев распределение подгрупп по длине тела иное: BB > Bb > bb (Fang et al., 2007). Упомянем в этом контексте различия в длине тела обследованных нами индивидов с разными гаплотипами (BAT-baT > BAT-Bat; p < 0,01). Как мы подчёркивали, подгруппы малочисленны, поэтому нельзя исключить, что в данном случае проявляется не специфика гаплотипов, а зиготность по BsmI. На это указывает относительная близость носителей гаплотипов BAt-BAt и BAT-Bat (и те, и другие характеризуются сравнительно малой длиной тела) в противоположность самым высоким из обследованных BAT-baT. Объединение BAt-BAt + BAT-Bat в одну подгруппу (n = 13) и сравнение ее с BAT-baT (n = 9) показало значимость различий по длине тела (p < 0,05). Таким образом, нельзя исключить ассоциацию высокого роста с генотипом Bb-BsmI, а не со спецификой гаплотипа. В выборке этнических французов масса тела и ИМТ у носителей генотипа bb-BsmI больше, чем у носителей аллеля B в гомои гетерозиготном вариантах (Ye et al., 2001). В нашем исследовании соотношение показателей такое же, хотя различия не достигают статистической достоверности. Данные относительно ассоциации размеров тела и генотипа TagαI у европеоидов противоречивы. Евроамериканские и турецкие девочки 7–15 лет с генотипом TT-TagαI отличаются от tt большими значениями длины и массы тела (Ozaydin et al., 2010; Tao et al., 1998), тогда как финские мужчины среднего возраста с генотипами Tt и tt, напротив, превосходят в длине тела носителей варианта TT (Remes et al., 2005). В нашей выборке, как и в обследованной группе англичан (Todhunter et al., 2005) значимых соматологических различий у носителей различных вариантов TagαI не выявлено. Отсутствие значимых различий соматологических характеристик у носителей различных генотипов ApaI в нашей выборке соответствует данным Тодхантера с соавторами (Todhunter et al., 2005). Итак, в обследованной нами выборке коренного населения северных регионов Европейской России ассоциация аллельных вариантов гена VDR с длиной тела (ростом) выявлена только с полиморфизмом BsmI (p = 0,037). Различия в массе и индексе массы тела (ИМТ) между подгруппами, сформированными по генотипу FokI статистически достоверны. Содержание костной ткани (в процентах от массы тела) значимо различается у носителей различных аллельных вариантов FokI и BsmI. Полученные данные соответствуют или не противоречат результатам исследований, проведённых в популяциях Северо-Западной Европы (Франция, Швеция, Голландия), тогда как специфика соматологических характеристик носителей различных вариантов генотипа VDR, описанная в выборках представителей неевропеоидных расовых групп или у европеоидов, проживающих в субтропических и тропических регионах, на нашем материале не проявляется. В частности, мы не обнаружили большей длины тела у гетерозигот Ff-FokI по сравнению с гомозиготами, описанной в выборках японских девушек-подростков и молодых женщин (Minamitani et al., 1998). В нашей выборке носители генотипа ff-FokI характеризуются средними значениями индекса массы тела (Z = –0,03), тогда как среди индусов и жителей Южной Италии они отличаются малыми значениями ИМТ (Ferrara et al., 2002; Vupputuri et al., 2006). В ходе проведённого исследования получены первые на российском материале данные об ассоциации генотипов FokI и BsmI и соматологических характеристик. Результаты подтверждают гипотезу о том, что специфика генотипа VDR может детерминировать различия в чувствительности костной ткани к средовым воздействиям даже в популяциях, относящихся к одной расовой группе, но обитающих в различных в экологическом плане регионах. Для столь северной и полиэтничной страны, как Российская Федерация, важной задачей является накопление информации об особенностях тканевого (в особенности костного) метаболизма и его генетической регуляции в группах, различающихся по происхождению, условиям проживания, питанию, специфике роста и развития.

Об авторах

Андрей Игоревич Козлов

Московский государственный университет

Email: dr.kozlov@gmail.com
д. б. н., старший научный сотрудник, лаборатория антропоэкологии

Галина Григорьевна Вершубская

Московский государственный университет

Email: galina.ver@gmail.com
д. б. н., старший научный сотрудник, лаборатория антропоэкологии

Юлия Александровна Атеева

Пермский государственный гуманитарно-педагогический университет

Email: Ateewa@yandex.ru
аспирант, кафедра анатомии, физиологии и медицины

Памела Орр

Университет Манитобы

Email: porr@hsc.mb.ca
врач, отделение внутренних болезней

Линда Лакомб

Университет Манитобы

Email: linda.larcombe@gmail.com
врач, отделение внутренних болезней

Список литературы

Дополнительные файлы