БЕЛОК PRP И ПЕПТИД АМИЛОИД БЕТА ВЗАИМОДЕЙСТВУЮТ В ДРОЖЖАХ SACCHAROMYCES CEREVISIAE



Цитировать

Полный текст

Аннотация

Исследована возможность взаимодействия белка prp с пептидом амилоид бета в живых клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae методами флуоресцентной микроскопии. используя метод FRET, было показано, что пептид амилоид бета и белок prp взаимодействуют в дрожжевых клетках. Б дальнейшем, дрожжевая модель может быть использована для изучения тонких механизмов этого взаимодействия с использованием методов флуоресцентной микроскопии.

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Амилоидозы — группа заболеваний, связанных с аномальной пространственной укладкой и агрегацией белков, в норме являющихся растворимыми. Наиболее известными амилоидозами человека являются — болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, хорея Хантингтона и прионные заболевания. Болезнь Альцгеймера — самый распространённый из амилоидозов, а также самая частая причина развития старческого слабоумия. Этой болезни больше всего подвержены люди старшего возраста (старше 60 лет), в возрасте старше 80 лет от неё страдает каждый третий, а у 90-летних заболеваемость достигает 50% (по: prusiner, 2001). Болезнь Альцгеймера связана с накоплением в тканях головного мозга нейротоксичных агрегатов пептида амилоид-бета (Ар) (Morishima- Kawashima et al., 2002; Bayer and Wirths, 2010).

Инфекционным агентом в случае прионных болезней является олигомерная изоформа в норме растворимого белка prp (от prion protein), устойчивая к воздействию температуры, химических агентов и протеолитических ферментов. Такая аномальная конформация белка обеспечивает передачу заболевания за счет автокаталитической трансформации вновь синтезируемых молекул с использованием олигомерной формы prp как матрицы (prusiner, 1998).

Интересной особенностью белка prp и пептида Ар является их способность к взаимодействию: белок prp в мономерной изоформе специфично связывает олигомеры пептида амилоид-бета, то есть является его рецептором, и, таким образом, способен влиять на проявление болезни (Gunther and Strittmatter, 2009). Недавние исследования также показали, что процессы, связанные с неправильной укладкой одного из этих белков, являются серьезным фактором риска для индукции агрегации другого (Morales et al., 2010). На основании этих данных представляется перспективным изучение возможности взаимодействия и взаимного влияния агрегатов prp и Ар. В этой работе была исследована возможность взаимодействия пептида Ар человека и белка prp мыши в дрожжах Saccharomyces cerevisiae методами флуоресцентной микроскопии.

Несмотря на то, что связывание белком prp олигомеров пептида Ар, уже описано, остаётся целый ряд вопросов, на которые пока нет ответов:

  • Какие именно участки белка prp и пептида Ар ответственны за их взаимодействие?
  • Способны ли взаимодействовать между собой агрегированные формы белков?
  • Специфично ли взаимодействие prp с олигомерами пептида Ар, может ли данный белок связывать in vivo и другие амилоидные белки?

Получить ответы на эти вопросы, используя трансгенных животных крайне сложно, поскольку эксперименты на модельных животных требуют больших материальных затрат и, как минимум, двух-трёх лет рабо ты. Использование культур нервных клеток в данном случае невозможно, так как олигимеры prp и Ар нейротоксичны. Исходя из этого, дрожжи являются уникальным объектом для исследования взаимодействий амилоидных белков млекопитающих.

Дрожжевая модель предоставляет следующие преимущества: prp и Ар формируют в цитоплазме дрожжей амилоидные агрегаты практически сразу после начала экспрессии соответствующих конструкций. В экспериментах с трансгенными млекопитающими образование амилоидных агрегатов происходит как минимум через полгода. Агрегаты prp и Ар не токсичны для дрожжей, что позволяет исследовать их свойства и взаимодействие. Эксперименты на дрожжах намного дешевле, чем эксперименты, проводимые на модельных животных. Дрожжи, как наиболее простой и изученный объект генетических исследований, позволяют легко и быстро проводить эксперименты, связанные с исследованием эффектов экспрессии чужеродных последовательностей. Целью данной работы являлась проверка адекватности дрожжевой модели для исследования взаимодействия prp и Ар.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Штаммы, среды и условия культивирования. В работе использовали штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae BY4742 (MATa hisSAl leu2A lys2A ura3) («Invitrogen», США). Для амплификации плазмидной ДНК использовали штамм бактерии Escherichia coli DH5a (supE44; AlacU169; (q>80lacZAM15) hsdR17; recAl; endAl; gyrA96; thi-1; elAl) (Hanahan, 1985). Бактерии культивировали при температуре 37°С на жидкой и твердой средах Luria-Bertani (LB) с добавлением ампициллина (50 мкг/мл) (Sambrook et al., 1989). Дрожжи культивировали при 30 °С на твердой и жидкой среде YApD, а также на синтетических средах, содержащих необходимые витамины, микроэлементы, аминокислоты и азотистые основания (Захаров и др., 1984; Kaiser et al., 1994).

Микробиологические и молекулярно-генетические методы. В работе применяли стандартные методы, используемые при работе с дрожжами S. cerevisiae (Инге-Вечтомов, 1971, Захаров и др., 1984) и бактериями E. coli (Sambrook et al., 1989).

Трансформацию дрожжей проводили по методике с использованием ацетата лития (Rose et al., 1990). Получение компетентных клеток E. coli и трансформацию бактерий осуществляли по методике (Inoue et al., 1990). Выделение плазмидной ДНК из E. coli в препаративных количествах проводили методом щелочного лизиса (Sambrook et al., 1989). В работе использовали стандартные методы генной инженерии (Маниатис и др., 1984).

Плазмиды. Плазмиды, использованные в ходе работы, описаны в таблице 1. Все плазмиды, за исключением pcDNA3-1-3F4, являются челночными векторами способными к поддержанию в клетках S. cerevisiae и E. coli. Вектор pRS425 (Sikorski and Hieter, 1989). Плазмиды pSP-YFP и pSP-CFP (неопубликованы), любезно предоставлены С. П. Задорским (Санкт-Петербургский государственный университет). Плазмида pcDNA3-1-3F4 (Narwa and Harris, 1999) содержит мышиный ген Prnp, модифицированный для распознавания моноклональными антителами 3F4. Плазмида pGPD-YFP(URA3) получена на базе плазмиды pGPD- PrP-GFP(URA3) (Рубель и др., 2008) путем замещения фрагмента SacII-SacI, содержащего гибридный ген PrP—GFP (1,2 т.п.н.), на фрагмент SacII-SacI, содержащий ген YFP (0,7 т.п.н.), из плазмиды pSP-YFP Плазмида PGPD-PrP-YFP(URA3) получена в два этапа. На первом этапе полноразмерный ген Prnp был ам- плифицирован c плазмиды pcDNA3-1-3F4, используя праймеры FPrP23 и RPrP231, описанные в таблице 2.

 

Таблица 1. Плазмиды, использованные в работе

Название плазмиды

Тип плазмиды/дрожжевой маркер

Промотор/экспрессионная кассета

pRS425

2^/LEU2

 

pSp-CFp

CEN/URAS

pcup1-sup35nsc-sup35mcpm-cfp

pSp-YFp

CEN/URAS

pcup1-sup35nsc-sup35mcpm-yfp

pcDNA3-1-3F4

CEN/None

prnp

pGpD- prp-GFp(URA3)

2^/URAS

pGpD-prp-GFp

pGpD-Ab-YFp(URA3)

2y/LEU2

pgpd-akyfp

pGpD-Ab-CFp(LEU2)

2^/URAS

pgpd-akcfp

pGpD-prp-YFp(URA3)

2y/LEU2

pGpD-prp-YFp

pGpD-prp-CFp(LEU2)

2y/LEU2

pGpD-prp-CFp

pGpD-YFp(URA3)

2y/LEU2

pgpd-yfp

pgpd-akyfp(leu2)

2y/LEU2

pgpd-akyfp

pGpD-prp-YFp(LEU2)

2y/LEU2

pGpD-prp-YFp

 

Таблица 2. Праймеры, использованные в работе

Название праймера

Последовательность 5'-3'

Fprp23

cccggatcctatatgtctaaaaagcggccaaagcctggagggt

Rprp231

catccgcgggctggatcttctcccgtcgtaataggcct

fa p

gggtccacggatcctatatgtctgatgcagaattccgacat

rap

gttataaaggatccgacaacaccgcccaccat

 

Праймеры для амплификации Prnp содержали сайты для эндонуклеаз рестрикции BamHI и SacII. Для того чтобы уменьшить деградацию белка PrP-GFP дрожжевыми протеазами, в праймер FPrP23, после ATG была добавлена последовательность, кодирующая серин (см. Ma and Lindquist, 1999). На втором этапе амплифицированную последовательность Prnp гидролизовали с помощью эндонуклеаз рестрикции BamHI- SacII и встроили в плазмиду pGPD YFP (URA3), гидролизованную по тем же сайтам. Плазмида pGPD Ab YFP(URA3) получена путем инсерции последовательности, кодирующей пептид амилоид бета с 1 по 40 аминокислоту в плазмиду PGPD YFP(URA3), гидролизованную с помощью эндонуклеаз рестрикции BamHI- SacII. Последовательность, кодирующая человеческий пептид амилоид бета была амплифицирована с помощью реакции обратной транскрипции из мРНК выделенной из мозга. Праймеры для амплификации пептида Ap (FAр и RAP) содержали сайты для эндонуклеаз рестрикции BamHI или SacII. Для получения плазмид pGPD Ab YFP(LEU2) и PGPD-PrP-YFP(LEU2) последовательности, содержащие PGPD—Ab-YFP и PGPD—PrP-YFP, были гидролизованы эндонуклеазами рестрикции HindIII-SacI из плазмид pGPD-Ab- YFP(URA3), pGPD-PrP-YFP(URA3) и встроены в полилинкер вектора pRS425. Плазмиды pGPD PrP CFP(LEU2) и pGPD Ab CFP(LEU2) сконструированы путем замещения фрагмента SacII-SacI, содержащего последовательность YFP (0,7 т.п.н.) из плазмид pGPD- Ab-YFP(LEU2) и pGPD PrP YFP(LEU2) на фрагмент SacII-SacI, содержащий ген CFP (0,7 т.п.н.) из плазмиды pSP CFP.

Флуоресцентная микроскопия. Колокализацию флуоресцентных белков, а также эксперименты по измерению эффективности FRET, проводили при помощи лазерного сканирующего конфокального микроскопа Leica TCS SP5 «Leica Microsystems GmBH» (Германия) и программного обеспечения «LAS AF Application Wizard Version 1.7.0» «Leica Microsystems GmBH» (Германия), на базе центра коллективного пользования «Хромас» (СПбГУ). Для детекции CFP или CFP содержащих белков, использовали аргоновый лазер с длиной волны 458 нм, сигнал детектировали в пределах 461—510 нм, для детекции YFP или YFP содержащих белков, использовали аргоновый лазер с длиной волны 514 нм, сигнал детектировали в пределах 518—580 нм.

Для проведения экспериментов по измерению эффективности FRET использовали предметные стекла «Polysine slides» фирмы «Gerhard Menzel Gmbh» (Германия). Для приготовления препаратов дрожжевые клетки растворяли в капле стерильной воды и равномерно распределяли по поверхности стекла. После высыхания препарат заключали в среду «VECTASHIELD Mounting Media» фирмы «Vector Laboratories Inc.» (США) и накрывали покровным стеклом. Излишки среды удаляли с помощью фильтровальной бумаги, после чего края покровного стекла заклеивали лаком для ногтей.

Измерение эффективности FRET проводили, используя метод фотовыжигания акцептора (Acceptor photobleaching). Эффективность передачи и, соответственно, степень взаимодействия белков, оценивали при сравнении интенсивности флуоресценции донора в присутствии и в отсутствии акцептора.

На первом этапе анализа препаратов, находили клетки, в которых наблюдалась колокализация белков, содержащих CFp и YFR На изображении, полученном с помощью конфокального микроскопа, выделяли интересующую область. В этой области замеряли флуоресценцию донора (CFp) до и после фотовыжигания акцептора. Для фотовыжигания акцептора использовали аргоновый лазер с длиной волны 514 нм при максимальной интенсивности светового потока. Время выжигания составляло 10 сек. Эффективность FRET (FRETeff) рассчитывали по формуле: FRETeff=[D -D ]/Dpost pre post

Dpost — это флуоресценция донора после фотовыжигания акцептора,

Dpre — флуоресценция донора до фотовыжигания акцептора.

Статистическая обработка. Стандартную ошибку среднего рассчитывали по стандартной формуле (Гланц, 1999, С. 41.).

РЕЗУЛЬТАТЫ

PrP и Ар слитые с флуоресцентными белками формируют агрегаты в дрожжах. Белок prp и пептид амилоид бета (Ар) формируют амилоидные агрегаты в дрожжевой клетке, однако видимого фенотипического проявления такая агрегация не имеет (Ma and Lindquist, 1999; Рубель, 2008; Коржова и др., 2010; Bharadwaj et al., 2010). Для визуализации агрегации prp и Ар мы получили химерные конструкции, в которых prp и Ар слиты с репортерными последовательностями. В качестве репортерных последовательностей мы использовали YFp (желтый флуоресцирующий белок) и CFp (синий флуоресцирующий белок), позволяющие визуализировать агрегацию белков методами флуоресцентной микроскопии. Мы получили дрожжи S. cerevisiae, продуцирующие пептид амилоид бета и/ или белок prp слитый с одним из флуоресцирующих белков CFp или YFp (рис. 1).

 

Рис. 1. Флуоресцентный анализ белков: PrP-YFP и Ap-CFP в дрожжах Saccharomyces cerevisiae. Стрелками обозначены наиболее крупные агрегаты.

 

Как было показано ранее (Caine et al., 2007; Рубель и др., 2008; Mallik et al., 2010), а также в ходе данной работы, продукция в дрожжах Ар- и prp-содержащих флуоресцентных белков, приводит к формированию в цитоплазме флуоресцирующих агрегатов. Выявляемые в клетках агрегаты prp можно разделить по размеру и форме на несколько типов: небольшие агрегаты — «точки», крупные глобулярные структуры, агрегаты в виде колец или лентовидных структур. При культивировании дрожжей в жидкой селективной среде количество клеток с агрегатами и тип агрегатов сильно варьировали в зависимости от стадии роста клеточной культуры. Наибольшее количество клеток с агрегатами, было выявлено в логарифмической фазе роста культуры (0,5—1 OD595), при этом встречались преимущественно «точки» и комбинации «точек» и глобулярных структур, тогда как в стационарной фазе роста культуры доля клеток с агрегатами была заметно снижена, и в основном выявлялись клетки, содержащие крупные глобулярные структуры. В нескольких клетках вне зависимости от фазы роста культуры были обнаружены кольцевые или лентовидные структуры. В дрожжах, продуцирующих Ap-содержащие флуоресцентные белки, количество клеток, содержащих флуоресцентные агрегаты, было сравнительно небольшим (6—10%), в большинстве клеток, на фоне диффузного распределения белка в цитоплазме, выявлялся один или несколько небольших агрегатов глобулярной формы.

Агрегаты Ар и prp колокализуются в клетках дрожжей-сахаромицетов. Для исследования возможности взаимодействия белков Ар и prp, были получены дрожжи, продуцирующие пару химерных белков: Ap-YFp/prp-CFp, а также для контроля пары: Ap-YFp/Ap-CFp, prp-YFp/prp-CFp. Из дрожжевых клеток были сделаны микропрепараты и проанализированы методами флуоресцентной микроскопии (рис. 2). Как и следовало ожидать, при продукции пар белков Ap-YFp/Ap-CFp и prp YFp/prp CFp в дрож жевых клетках, выявлялись флуоресцентные гранулы, в подавляющем большинстве которых (80 — 90%) наблюдалась колокализация сигналов YFP и CFP (рис 2). При продукции гибридных белков Ap-YFP/ PrP-CFP, также в более чем 80% наблюдалась колокализация флуоресцентных агрегатов. В тоже время, встречались клетки, в которых агрегаты флуоресцентных белков не колокализовались. Полученные данные являются свидетельством в пользу возможности взаимодействия белков Ар и PrP в дрожжевых клетках. Однако, наблюдение колокализации агрегатов само по себе не является доказательством их физического взаимодействия, так как совпадение сигналов флуоресцентных агрегатов может быть следствием их близкого расположения.

 

Рис. 2. Флуоресцентный анализ пар белков в дрожжах S. cerevisiae. Верхний ряд — PrP-YFP + PrP-CFP; средний ряд — PrP-CFP + Ap-YFP; нижний ряд — Ap- CFP + Ap-YFP

 

Анализ взаимодействия между PrP и Ар в живых клетках дрожжей S. cerevisiae. Для исследования физического взаимодействия между белком PrP и пептидом Ар был использован метод FRET, широко применяемый для исследования взаимодействия белков in vivo (Karpova et al., 2003; Cui et al., 2009). FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) — это физическое явление, обусловленное передачей энергии между двумя хромофорами, находящимися на расстоянии не больше 10 нм с помощью безызлучательного диполь-дипольного спаривания. Для FRET используют конструкции, в которых изучаемые молекулы слиты: одна — с донором, а другая — с акцептором, в качестве которых выступают флуоресцирующие белки. При использовании белков CFP и YFP, CFP является донором, а YFP — акцептором, так как пик эмиссии CFP совпадает с пиком поглощения YFP Если исследуемые белки тесно взаимодействуют, происходит эффективная передача энергии (Swift et al., 2004).

В данной работе мы использовали метод выжигания акцептора (Acceptor Photobleaching). Эффективность передачи и, соответственно, степень взаимодействия белков в этом методе оценивали при сравнении интенсивности флуоресценции донора в присутствии и в отсутствии акцептора (при фотовыжигании акцептора при условии явления FRET донор флуоресцирует сильнее).

Для исследования физического взаимодействия между PrP и пептидом Ар мы использовали дрожжи, продуцирующие пару флуоресцентных белков PrP- CFP и Ap-YFP.

В качестве отрицательного контроля оценивали эффективность FRET между агрегатами PrP-CFP и растворимым белком YFP Было сделано 15 измерений и произведен расчет эффективности FRET. В 14 из сделанных измерений данный показатель равнялся 0, в одном из измерений эффективность FRET составила 3,49%. С учётом стандартной ошибки среднего эффективность FRET в негативном контроле не отличается от нуля. Полученные данные подтверждают отсутствие явления FRET в случае, когда флуоресцентные белки слиты с невзаимодействующими белками, и отсутствие какого-либо фона флуоресценции, который мог бы вносить ошибку в измерения.

В качестве положительного контроля рассчитывали эффективность FRET между парами белков PrP- CFP/ PrP-YFP и Ар-CFP/ Ap-YFP. Эффективность FRET между белками PrP-CFP и PrP-YFP составила 17,9±0,97% (n=111), а между белками Ар-CFP/ Ap- YFP 11,8±1,03% (n=30).

В опыте, эффективность FRET между белками PrP-CFP и Ap-YFP составила 14,7±1,73% (n=80) (см. рис. 3).

 

Рис. 3. Гистограмма средних значений эффективности FRET для разных пар белков

 

Стоит отметить, что в некоторых случаях (примерно 20%) колокализация агрегатов не сопровождалась физическим взаимодействием белков, как в опыте, так и в положительных контролях.

Таким образом, полученные данные говорят о том, что между белками PrP-CFP и Ap-YFP происходит передача энергии флуоресценции за счет резонанса, что свидетельствует о физическом взаимодействии этих белков в дрожжевых клетках.

ОБСУЖДЕНИЕ

Большое количество работ убедительно доказывает, что дрожжи Saccharomyces cerevisiae представляют собой адекватную модель для исследования амилоидных белков млекопитающих (Outeiro and Muchowski, 2004; Галкин и др., 2006). Важной особенностью использования дрожжевых моделей является возможность визуализировать агрегацию белков с помощью создания химерных конструкций, в которых изучаемый белок слит с репортерной последовательностью, например, с флуоресцирующими белками, широко используемыми сейчас в молекулярно-биологических исследованиях.

В ряде работ показано, что продукция в дрожжах S. cerevisiae белков, Ap-GFP и PrP-GFP, приводит к формированию в клетках высокомолекулярных агрегатов. Эти агрегаты обладают свойствами, характерными для агрегатов белков Ар и PrP, выявляемых в мозге больных млекопитающих (Caine et al., 2007; Рубель, 2008; Mallik et al., 2010; Коржова и др., 2010). Агрегаты как PrP, так и пептида Ар, не токсичны для дрожжей (Рубель, 2008; Коржова и др., 2010). В данной работе, с помощью методов флуоресцентной микроскопии (исследование колокализации и измерения эффективности FRET), мы показали, что белки PrP и Ар физически взаимодействуют в дрожжевых клетках.

В дальнейшем, предложенная нами модель позволит более подробно изучать механизмы этого взаимодействия, искать домены белков, важные для взаимодействия, и факторы, которые могут на него влиять. Отметим, что метод FRET не позволяет разделить взаимодействие агрегатов и мономеров белков, поэтому необходимо привлечение дополнительных методов для определения взаимодействующих внутри агрегатов единиц. Важным вопросом остается исследование специфичности взаимодействия амилоидных полимеров, особенно в свете появившихся недавно данных о возможности взаимодействия мономеров prp с различными бета-складчатыми белками (Resenberger et al., 2011). Одним из вариантов изучения этого вопроса является исследование возможности колокали- зации и измерение эффективности FRET при совместной продукции в дрожжевых клетках пептида Ар или prp и дрожжевых прионов, например, [ pSI+] — агрегированной формы белка Sup35.

Таким образом, в работе было показано взаимодействие пептида Ар и белка prp в гетерологичной дрожжевой модели. В дальнейшем дрожжи сахаромицеты могут быть использованы как модель для изучения тонких механизмов взаимодействия prp и Ар: выявления участков белка prp и пептида Ар, ответственных за взаимодействие, выявления аминокислот критичных для взаимодействия, выяснения специфичности взаимодействие белков prp и Ар.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы выражают благодарность Сергею Павловичу Задорскому за предоставленные плазмиды pSp-YFp и pSp-CFp и Дэвиду Харрису за плазмиду pcDNA3-1-3F4. Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы, программы президиума РАН, ФНМ «Поиск белков, контролирующих амилоидогенез при болезни Альцгеймера», а также за счет средств тематического плана НИР СПбГУ.

×

Об авторах

Александр Анатольевич Рубель

Санкт-Петербургский государственный университет; Санкт-Петербургский филиал института общей генетики им. Вавилова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: arubel@mail.ru

к.б.н., н.с. СПбФ ИОГен РАН, в.н.с. СПбГУ

Россия, 199034, г.Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9;  г. Санкт-Петербург

Виктория Валерьевна Коржова

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: arubel@mail.ru

студент

Россия, 199034, г.Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9

Алсу Фаритовна Сайфитдинова

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: saifitdinova@mail.ru

к.б н., с.н.с.

Россия, 199034, г.Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9

Кирилл Сергеевич Антонец

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: saifitdinova@mail.ru

студент

Россия, 199034, г.Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9

Сергей Георгиевич Инге-Вечтомов

Санкт-Петербургский государственный университет; Санкт-Петербургский филиал института общей генетики им. Вавилова РАН

Email: ingevechtomov@gmail.com

акад. РАН, проф., д. б. н., зав. кафедрой генетики и селекции СПбГУ, директор СПбФ ИОГен РАН.

Россия, 199034, г.Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9;  г. Санкт-Петербург

Алексей Петрович Галкин

Санкт-Петербургский государственный университет; Санкт-Петербургский филиал института общей генетики им. Вавилова РАН

Email: apgalkin@mail.ru

к. б. н., зам. директора СПбФ ИОГен РАН, старший преподаватель СПбГУ

Россия, 199034, г.Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9;  г. Санкт-Петербург

Список литературы

  1. Галкин А. П., Миронова Л. Н., Журавлева Г. А., 2006. Прионы дрожжей, амилоидозы млекопитающих и проблема протеомных сетей. Генетика. Т. 42. №11. С. 1-13.
  2. Гланц С., 1999. Медико-биологическая статистика. Пер. с англ. М., Практика, 459 с.
  3. Эахаров И. А., Кожин С. А., Кожина Т. Н, и др., 1984. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов. Л.: Наука. 143 с.
  4. Инге-Вечтомов С. Г., 1971. Идентификация некоторых групп сцепления у Петергофских генетических линий дрожжей // Генетика. Т. 7. C. 113-124.
  5. Коржова В. В., Антонец К. С., Галкин А. П. и др., 2010. Использование методов флуоресцентной микроскопии для анализа взаимодействия пептида АЬ и prion protein в дрожжах Saccharomyces cerevisiae // Труды Томского государственного университета. Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии. Изд-во Томского ун-та. 2010. Сер. Биологическая. Т. 275. С. 360-362.
  6. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д., 1984. Молекулярное клонирование: Перевод с англ. М: Мир. 479 с.
  7. Рубель А. А., 2008. Исследование прионных свойств белка prp в дрожжах Saccharomyces cerevisiae.: Ав- тореф. дис. ... канд. биол. наук. СПб, 19 с.
  8. Рубель А. А., Сайфитдинова А. Ф., Лада А. Г. и др., 2008. Дрожжевой шаперон Hsp104 регулирует экспрессию генов на посттранскрипционном уровне // Мол. биол. Т. 42. №1. С. 123-130.
  9. Bayer T. A., Wirths O. Intracellular accumulation of amyloid-Beta - a predictor for synaptic dysfunction and neuron loss in Alzheimer's disease // Front Aging Neurosci. 2010 Vol. 2: 8.
  10. BharadwajP., MartinsR., Macreadie I., 2010. Yeast as a model for studying Alzheimer's disease. MS Yeast Res. Vol. 10. N8. p. 961-969.
  11. Caine J., Sankovich S., Antony H, et al., 2007. Alzheimer's Abeta fused to green fluorescent protein induces growth stress and a heat shock response // FEMS Yeast Res. Vol. 7. N8. p. 1230-1236.
  12. Cui Z., Ke Zhang K, Zhang Z., et al., 2009. Visualization of the dynamic multimerization of human Cytomegalovirus pp65 in punctuate nuclear foci // Virology. 2009 Vol. 392. N2. p. 169-177.
  13. Gunther E. C., Strittmatter S. M., 2009. Beta-amyloid oligomers and cellular prion protein in Alzheimer's disease // J Mol Med (Berl). Vol. 88. N4. p. 331-338.
  14. Hanahan D., 1985. Techniques for Transformation of E. coli, DNA cloning: a practical approach. Glover, D. M., ed., IRL press Limited, Oxford, England. R 109-135.
  15. InoueH., NojimaH., OkayamaH, 1990. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids // Gene. Vol. 96. p. 23-28.
  16. Kaiser C., Michaelis S., Mitchell A. Methods in yeast genetics. N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. press. 1994. 234 p.
  17. Karpova T. S., Baumann C. T, He L., et al., 2003. Fluorescence resonance energy transfer from cyan to yellow fluorescent protein detected by acceptor photobleaching using confocal microscopy and a single laser. J. Microsc.-Oxf. Vol. 209. p. 56-70.
  18. Ma J., Lindquist S., 1999. De novo generation of a prpSc-like conformation in living cells // Nat Cell Biol. Vol. 1. p. 358-361.
  19. Mallik S., Yang W., Norstrom E. M. et al., 2010. Live cell fluorescence resonance energy transfer predicts an altered molecular association of heterologous prpSc with prpC // J Biol Chem. Vol. 285. N12. p. 8967-8975.
  20. Morales R., L. D. Estrada R. Diaz-Espinoza D. et al., 2010. Molecular cross talk between misfolded proteins in animal models of Alzheimer's and prion diseases // J. of Neuroscience Research. Vol. 30. p. 4528-4535.
  21. Morishima-Kawashima M., Ihara Y., 2002. Alzheimer's disease: beta-Amyloid protein and tau // J Neurosci Res.Vol. 70. N3. R 392-401.
  22. Narwa R, Harris D. A., 1999. Prion proteins carrying pathogenic mutations are resistant to phospholipase cleavage of their glycolipid anchors // Biochemistry. Vol. 38. R 8770-8777.
  23. Outeiro T. F, Muchowski P. J., 2004. Molecular genetics approaches in yeast to study amyloid diseases // J Mol Neurosci. Vol. 23. N1-2. R 49-60.
  24. Prusiner S. B. Shattuck lecture-neurodegenerative diseases and prions // N Engl J Med. 2001. Vol. 344. N20. R 1516-1526.
  25. Prusiner S. B., 1998. Rrions // Rroc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 95. N23. R 13363-13383.
  26. Resenberger U. K, Harmeier A., Woerner A. C., et al., 2011. The cellular prion protein mediates neurotoxic signalling of p-sheet-rich conformers independent of prion replication // EMBO J. Vol. 30. N10. R 20572070.
  27. Rose M. D, Winstone F, Hieter P., 1990. Methods in yeast genetics. CSHL Rress. 198 p.
  28. .Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T, 1989. Molecular cloning. A laboratory manual New York: Cold Spring Harbor Lab. Rress. 1626 p.
  29. Sikorski R. S, Hieter P., 1989. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae // Genetics. Vol. 122. R 19-27.
  30. Swift E. J. Jr, Miguez P. A., Barker M. L. et al., 2004. Three-week clinical trial of a 14% hydrogen-peroxide, strip-based bleaching system // Compend Contin Educ Dent. (8 Suppl 2) R 27-32.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Рубель А.А., Коржова В.В., Сайфитдинова А.Ф., Антонец К.С., Инге-Вечтомов С.Г., Галкин А.П., 2012

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 65617 от 04.05.2016.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах