Клонирование промоторов генов PpKAR2 и PpPDI1 дрожжей Pichia pastoris, оценка их активности и эффективности использования для экспрессии гетерологичных генов

Полный текст

Введение

Дрожжи Pichia pastoris успешно используют для экс­прессии гетерологичных генов, с их помощью синтезированы различные гетерологичные белки, уровень продукции которых выше, чем во многих других микробных системах [1]. Список белков, успешно синтезированных в P. pastoris, постоянно расширяется, несколько биофармацевтических продуктов были одобрены Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США для использования в медицине, и более 70 продуктов находятся на поздней стадии разработки [2]. В процессе создания системы экспрессии гетерологичного гена всегда встает вопрос о выборе промотора. Промоторы — ключевой фактор продуктивности системы экспрессии, так как он определяет уровень экспрессии гетерологичного гена [3]. Одними из наиболее часто применяемых промоторов P. pastoris являются индуцибельный промотор гена алкогольоксидазы-1 — PAOX1 и конститутивный промотор гена глицероальдегид-3-фосфатдегидрогеназы (PGAP) [4]. Достоинства промотора PAOX1 заключаются в его высокой активности и возможности регулировать экспрессию гетерологичного гена. В связи с опасностью использования на производстве такого ядовитого и опасного индуктора, как метанол, проводится работа по получению вариантов промотора, которые можно индуцировать без применения метанола при сохранении высокой активности [5]. Так, был получен штамм с делециями структурных генов Δmig1Δmig2Δnrg1, отвечающих за катаболитную репрессию PAOX1, и сверхпродукцией активатора транскрипции Mit1p, у которого активность PAOX1 на среде с глицерином составляла 77 % его активности на среде с метанолом [6]. Аналогичный подход показал эффективность и при работе с конститутивным промотором PGAP [7]. Одновременно с модификацией известных промоторов идет поиск новых промоторов, которые можно использовать для экспрессии гетерологичных генов [8–11]. На сегодняшний день увеличение ассортимента промоторов, пригодных для биотехнологии, а также изучение их регуляции является актуальной задачей. Примерами промоторов, которые могут быть применены в биотехнологии, служат промоторы генов PpKAR2 и PpPDI1.

PpKAR2 — ген, который кодирует шаперон Kar2p/BiP эндоплазматического ретикулума (ЭР). Основная функ­ция Kar2p — стабилизация несвернутых белков и поддержание их в растворимом состоянии, а также направление неправильно собранных полипептидных цепей в цитоплазму для мечения убиквитином с последующей деградацией в протеасоме [12]. Кроме того, Kar2p участвует в ответе клетки на несвернутый белок (UPR — unfolded protein response). В дрожжах S. cerevisiae, как и в клетках млекопитающих, синтез этого шаперона при тепловом шоке кратковременно повышается, хотя и при нормальных условиях он синтезируется на высоком базальном уровне [13]. В нормальных условиях белок Kar2p/BiP ассоциирован с N-концевым доменом трансмембранного белка Ire1p, C-концевой домен которого локализован в цитоплазме и обладает киназной и нуклеазной активностью [14]. При накоплении несвернутых белков в ЭР комплекс Kar2p – Ire1p диссоциирует, это вызывает полимеризацию Ire1p в мембране ЭР, трансфосфорилирование цитоплазматического C-концевого домена Ire1p, что приводит к появлению эндорибонуклеазной активности Ire1p. Активированный Ire1p катализирует удаление интрона мРНК HAC1 и инициирует синтез активатора транскрипции генов, промоторы которых содержат UPRE-последовательность, в первую очередь генов шаперонов и фолдаз (рис. 1). Стоит отметить, что в дрожжах P. pastoris несплайсированный вариант мРНК HAC1 не был обнаружен [14].

 

Рис. 1. Схема ответа клетки дрожжей S. cerevisiae на накопление несвернутого белка в эндоплазматическом ретикулуме [14, с изм.]

Fig. 1. Scheme of response of S. cerevisiae yeast cell to accumulation of non-folded protein in ER [14, with changes]

 

PpPDI1 — структурный ген протеиндисульфидизомеразы (Pdi1p). Этот белок есть у микроорганизмов, растений и животных. Ген конститутивно экспрессируется в большинстве тканей и органов, Pdi1p является одним из основных белков в ЭР [15]. В его функции входит формирование, восстановление и изомеризация дисульфидных связей в синтезируемых белках. Кроме того, он выполняет функции шаперона [16].

При синтезе гетерологичных белков повышается уровень экспрессии как гена PpKAR2, так и гена PpPDI1 [12]. С другой стороны, известно, что сверхэкспрессия этих генов может повышать продукцию гетерологичных белков [17, 18], в частности интерферонов [19].

Целью нашей работы было изучение промоторных областей генов PpKAR2 и PpPDI1 и оценка возможности их использования для эффективной экспрессии гетерологичных генов. Активность промоторов мы оценивали при помощи репортерной системы на основе структурного гена кислой фосфатазы (КФ) дрожжей Saccharomyces cerevisiae — PHO5 [20]. Чтобы выяс­нить влияние сверхпродукции собственного и гетерологичного белка на активность изучаемых промоторов, мы применяли штаммы-продуценты белков PpPdi1p и дельтазеина кукурузы. Для оценки эффективности изучаемых промоторов для экспрессии гетерологичных генов мы проэкспрессировали под их контролем ген, кодирующий интерферон-альфа16 человека.

Материалы и методы

Плазмиды

Генетические конструкций создавали при помощи плазмид pPIC9, pPICZαA (Invitrogen) и плазмид, полученных ранее, — pPIC9-PHO5 [20] и pPIC9-IFNα16 [21], в которых структурные гены кислой фосфатазы PHO5 и интерферона-альфа16 человека HuIFNα16 находятся под контролем промотора PAOX1.

Штаммы

На этапе конструирования плазмид и их амплификации использовали штамм DH5a Escherichia coli (F’/endA1 hsdR17 (rk– mk+) supE44 thi-1 recA1 gyrA (Nalr) relA1 D(lacZYA-argF) U169 deoR [ f80dlacD(lacZ)M15]). Для получения дрожжевых штаммов нужного генотипа применяли штамм P. pastoris GS115 (his4) (Invitrogen) (his4 — мутация, приводящая к потребности в гистидине). Также использовали ранее полученные штаммы P. pastoris — GS-AOX1PHO5 [20], GS-AOX1PDI1 [19], в которых гены PHO5 и PpPDI1 находятся под конт­ролем промотора PAOX1.

Полимеразная цепная реакция

Для амплификации промоторов генов PpPDI1 и PpKAR2 использовали следующие праймеры:

• • прямой AatII-PpPDI1 —

5`-TCAATAGACGTCAACACGAACACTGTAAATAG-3`,

• • обратный PpPDI1-BamHI —

5`-AGTAGTGGATCCTCTTATAGATAGGAAGAAG-3`,

• • прямой AatII-PpKAR2 —

5`-TTTAGAGACGTCAAGACTTGAGATGGACATG-3`,

• • обратный PpKAR2-BamHI —

5`-CTATGTGGATCCTCTTGAGTGTTGGAATTG-3`.

В обоих случаях прямой праймер содержал сайт узнавания для рестриктазы AatII, а обратный праймер — для рестриктазы BamHI. Подчеркнуты сайты узнавания рест­риктаз. В качестве матрицы применяли хромосомную ДНК штамма GS115. Для амплификации гена дельтазеина кукурузы использовали прямой праймер F-BstI-dZein —

5`-CGGGATTCGAAACGATGGCAGCCAAGATG-3`,

обратный праймер R-dZein-NotI —

5`-ATAATAGCGGCCGCGAATGCAGCACCAAC-3`.

Прямой праймер содержал сайт узнавания для рестриктазы BstBI, а обратный праймер — для рестриктазы NotI. В качестве матрицы была выбрана кДНК, полученная из суммарной РНК кукурузы при помощи набора MMLV RT kit (Евроген). Суммарную РНК выделяли из листьев кукурузы сорта «Лакомка сахарная» реагентом для выделения суммарной РНК — ExtractRNA (Евроген). Применяли методики, рекомендованные производителем.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в приборе T100 ThermalCycler (BIO-RAD) по следующей программе: плавление цепей ДНК при 95 °C в течение 45 с, отжиг праймеров в течение 90 с при температуре 55 °C (для амплификации промотора PKAR2), 45 °C (для амплификации промотора PPDI1 и гена дельтазеина), полимеразная реакция при 72 °C в течение 120 с. После окончания ПЦР пробу инкубировали при 72 °C в течение 5 мин. Всего 35 циклов.

Выделение ДНК

Плазмидную ДНК выделяли с помощью набора реактивов PlasmidMiniprep (Евроген) по методике, рекомендованной производителем. Выделение хромосомной ДНК из клеток дрожжей проводили по методике Smash & Grab [22].

Трансформация

Трансформацию дрожжей плазмидными векторами выполняли методом электропорации по описанной ранее методике [23]. Трансформацию бактерий проводили по стандартной методике [24].

Бактериальные штаммы культивировали в среде Луриа-Бертани [24]. Для отбора трансформантов, устойчивых к ампициллину, в среду добавляли антибиотик в концентрации 50 мг/л, для отбора трансформантов, устойчивых к зеоцину, в среду добавляли антибиотик в концентрации 25 мг/л. Штаммы E. coli выращивали при 37 °C.

Для отбора дрожжевых трансформантов, устойчивых к антибиотику зеоцину, использовали среду, содержащую на 1 литр: дрожжевой экстракт — 10 г, пептон — 20 г, глюкозу — 10 г (среда YPD) и антибиотик 150 мг/л. Для отбора дрожжевых трансформантов, прототрофных по гистидину, использовали минимальную среду и 6,8 г/л смеси витаминов, микроэлементов и источника азота (Sigma). При работе на чашках Петри во все среды добавляли 20 г агара на 1 л среды.

Культивирование дрожжевых штаммов

При экспрессии гена HuIFNα16 под контролем изу­чаемых промоторов применяли жидкую среду YPD. Культивировали в течение 48 часов при 20 °C.

Для определения активности КФ клетки дрожжей с твердой среды ресуспендировали в стерильной воде и засевали в 50 мл среды, содержащей дрожжевой экстракт — 10 г, пептон — 20 г, метанол — 20 мл и 0,1 М калий-фосфатный буфер (pH 6,0) на литр. Культивирование продолжалось 96 часов при 20 °C, измерения выполняли каждые 24 часа. Эксперимент для определения активности КФ проводили в трех повторностях. Культивировали во всех случаях при 150 об/мин.

Определение активности кислой фосфатазы

Активность КФ определяли по ранее разработанной методике [25]. В качестве контрольной пробы использовали суспензию культуральной жидкости штамма GS115, выращенного в тех же условиях. Удельную активность определяли как отношение оптической плотности при 410 нм к плотности клеточной суспензии при 600 нм.

Идентификация гетерологичного белка

Анализ гетерологичных белков электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ) и гибридизацию с антителами осуществляли по методике, примененной нами ранее [26].

Пробы готовили концентрированием культуральной жидкости в 10 раз при помощи центрифужных ультрафильтров Amicon Ultra 0,5 mL (MerckMillipore). В качестве контроля на гель наносили культуральную жидкость штамма GS115, выращенного в тех же условиях.

Для идентификации белка интерферона-альфа16 человека использовали первичные кроличьи IgG поликлональные антитела PA5-54146 (Thermoscientific), в качестве вторичных антител — конъюгат видоспецифических антител к иммуноглобулинам кролика и пероксидазы хрена (Sigma, A-0545). Все антитела разводили в 1000 раз.

Биоинформатические методы

Открытые рамки считывания 5` области гена PpKAR2 для выбора промоторного участка определяли с помощью интернет-сервиса ExPASy Шведского института биоинформатики [27]. Поиск сайтов связывания транс­крипционных факторов производили с помощью базы данных транскрипционных факторов S. cerevisiae — Yeastract [28] и программного обеспечения Genomatix Software Suite [29]. Статистическую обработку данных выполняли с использованием программ Excel и GraphPadPrizm 6 [30]. Межгрупповые различия оценивали с помощью U-критерия Манна – Уитни.

Результаты

Анализ 5` регуляторных областей генов PpPDI1 и PpKAR2

Для клонирования промоторной области гена PpPDI1 был взят участок в 254 нуклеотида между стартовым кодоном структурного гена и терминирующим кодоном гена, лежащего в 5` области [16]. После анализа нуклеотидной последовательности 5` области гена PpKAR2 был выбран участок, состоящий из 311 нуклеотидов, между стартовым кодоном структурного гена PpKAR2 и последним триплетом ближайшей открытой рамки считывания. Последовательность промотора PPDI1: 5`-aacacgaacactgtaaatagaataaaagaaaacttggatagtagaacttcaatgtagtgtttctattgtcttacgcggctctttagattgcaatccccagaatggaatcgtccatctttctcaacccactcaaagataatctaccagacatacctacgccctccatcCCAGCaccacgtcgcgatcaCCCCTaaaacttcaataattgaacacgtactgatttccaaaccttcttcttcttcctatctataaga-3`. Последовательность промотора PKAR2: 5`-aagacttgagatggacatgataaacaattatagtgaaaatagaaaccataatacaatattctaatagaggaaccgtttacctgtggttcctattgtggcctactgttactagctagtgtaatacacccttgcctcagctttgcaagtTGACAActcagccaaatgatctttgaatgcgcgaaacctcaaggtccatcGAAttTTCtcGAAttTTCagtgttttcataCAGCGTgtcatcttctttcgcgtacttatttaaatcgtacccagatcccttcttcttccttaatttcaattccaacactcaaga-3`. Подчеркнуты последовательности сайтов связывания факторов транскрипции, отдельно выделен перекрывающийся сайт Xbp1p.

Выбранные нуклеотидные последовательности были проанализированы на присутствие сайтов связывания факторов транскрипции. В промоторе гена PpPDI1 было выявлено 24, а в промоторе гена PpKAR2 — 43 потенциальных сайта связывания факторов транскрипции. Нас интересовали белки-регуляторы, которые участвуют в ответе клетки на несвернутые белки в ЭР и такие стрессорные факторы, как повышение температуры и концентрации активных форм кислорода, дефицит питательных веществ. Выбор этих белков-регуляторов был обусловлен тем, что изменения, происходящие в клетке при сверхпродукции гетерологичных белков и воздействии многих стрессорных факторов, похожи [31]. Как следует из табл. 1, промотор PKAR2 содержит больше потенциальных сайтов связывания белков, участвующих в ответе клетки на стрессорные факторы, по сравнению с промотором PPDI1.

 

Таблица 1. Потенциальные сайты связывания транскрипционных факторов в промоторах PPDI1 и PKAR2

Table 1. Potential binding sites for transcription factors in PPDI1 and PKAR2 promoters

	Транскрипционный фактор / Transcription factors
Промотор / Promoter	Название / Name	Нуклеотидная последовательность / Nucleotide sequence
PPDI1, PKAR2	Hac1p	CCAGC
PKAR2	Xbp1p	CTCGA
	Yap1p	TGACAA
	Hot1p	CATTTGGC
	Hsf1p	GAA/TTC повторы / repeats
PPDI1	Msn2p/Msn4p	AGGGG

 

В обоих промоторах присутствуют сайты связывания транскрипционного фактора Hac1p. Hac1p регулирует ответ клетки на накопление несвернутого белка в ЭР и контролирует биогенез мембран (см. рис. 1) [14]. С промотором гена PKAR2 могут взаимодействовать также белки Hsf1p, Xbp1p, Yap1p и Hot1p. Hsf1p — фактор транскрипции, который в виде тримера активирует в ответ на повышение температуры и другие стрессорные факторы экспрессию генов, промоторы которых содержат инвертированные повторы NGAAN, где N — любой нуклеотид. Активность Hsf1p регулируется на посттрансляционном уровне за счет фосфорилирования [32]. В промоторе PKAR2 найдено несколько сайтов связывания белка Hsf1p. Xbp1p — транскрипционный репрессор, который активируется при повышении температуры, окислительном стрессе, дефиците глюкозы и взаимодействует с промоторами структурных генов G1/S циклинов. Он является потенциальным субстратом протеинкиназы Cdc28p [33]. Yap1p необходим для обеспечения устойчивости к окислительному стрессу, также опосредует устойчивость к кадмию. Он активирует транскрипцию генов, продукты которых влияют на окислительно-восстановительный гомеостаз клетки [34]. Hot1p — фактор транскрипции, обеспечивающий адаптацию клетки к высокому осмотическому давлению, необходим для индукции генов биосинтеза глицерина GPD1 и GPP2 [35].

В промоторе гена PPDI1 есть сайт связывания белков Msn2p/Msn4p. Msn2p/Msn4p при воздействии различных стрессорных факторов — температуры, активных форм кислорода и др. — экспортируются в ядро и активируют транскрипцию генов, промоторы которых содержат STRE (stress response element — элемент стрессового ответа) [36].

Клонирование промоторов генов PpPDI1 и PpKAR2, получение плазмид, содержащих гены PHO5 и HuIFNα16 под контролем данных промоторов

В качестве матрицы для амплификации выбранных промоторных областей генов PpPDI1 и PpKAR2 была использована хромосомная ДНК штамма GS115. Для создания плазмид, несущих ген PHO5 под контролем промоторов PPDI1 и PKAR2, использовали плазмиду pPIC9-PHO5 (рис. 2, а). Вектор обрабатывали рестриктазами AatII и BamHI, чтобы удалить промотор гена AOX1, а затем лигировали с последовательностями промоторов генов PpPDI1 и PpKAR2, которые были обработаны этими же рестриктазами. Подтверждение структуры полученных плазмид проводили при помощи ПЦР, рестрикционного анализа и секвенирования. Схема получения плазмид p9PKAR2-PHO5 и p9PPDI-PHO5 представлена на рис. 2 (1, 2).

 

Рис. 2. Схема получения плазмид

Fig. 2. Plasmid construction

 

Для получения конструкций, в которых под контро­лем промоторов PPDI1 и PKAR2 находится структурный ген интерферона-альфа16 человека (HuIFNα16), плазмиды p9PKAR2-PHO5 и p9PPDI-PHO5 обрабатывали рестриктазами BamHI и EcoRI и лигировали с фрагментом ДНК, содержащим сигнальную последовательность α-фактора дрожжей S. cerevisiae и ген HuIFNα16, который был получен при обработке плазмиды pPIC9-IFNα16 теми же рестриктазами. Схема конструирования плазмид представлена на рис. 2 (4, 5).

Получение дрожжевых штаммов с репортерной системой на основе КФ S. cerevisiae и штаммов-продуцентов дельтазеина кукурузы

Штаммы GS-PPDI1-PHO5 и GS-PKAR2-PHO5, в которых репортерный ген PHO5 находится под конт­ролем изучаемых промоторов, были получены транс­формацией штамма GS115 соответственно плазмидами p9PKAR2-PHO5 и p9PPDI1-PHO5. Плазмиды обрабатывали рестриктазой StuI, таким образом, вставка в геном происходила в локус HIS4, что обеспечивало появление функциональной копии гена HIS4 и прототрофность штамма по гистидину.

Для оценки влияния сверхпродукции гетерологичного белка на активность промоторов PPDI1 и PKAR2 использовали дельтазеин кукурузы. Для получения плазмиды, в которой под контролем промотора PAOX1 находится ген дельтазеина кукурузы, плазмиду pPICZαAобрабатывали рестриктазами BstBI и NotI и лигировали с фрагментом дельтазеина кукурузы, обработанным теми же рестриктазами. Схема получения плазмиды представлена на рис. 2 (5, 6). Штаммы GS-PPDI1-PHO5 и GS-PKAR2-PHO5 транс­формировали плазмидой pPICZαADZein. Плазмиду предварительно обрабатывали рестриктазой SacI, сайт расщепления которой находится в 5` области промотора PAOX1. Интеграция в геном происходила в промоторную область гена AOX1 без нарушения его функции. Таким образом получили штаммы GS-PPDI1-PHO5/PAOX1-Dzein и GS- PKAR2-PHO5/PAOX1-Dzein, в которых репортерный ген PHO5 находится под контролем соответственно промоторов PKAR2 и PPDI1, а структурный ген гетерологичного белка — под контролем промотора PAOX1.

Для оценки влияния сверхпродукции собственного белка на активность промотора PKAR2 штамм GS-PAOX1-PDI1 [19], в котором под контролем промотора PAOX1 находится ген PpPDI1, был трансформирован плазмидой p9PKAR2-PHO5. Плазмида была обработана рестриктазой StuI, таким образом, встраивание происходило в локус HIS4. В результате был получен штамм GS-PKAR2-PHO5/PAOX1-PDI1, в котором ген PHO5 находится под контролем промотора PKAR2, а структурный ген белка Pdi1p — под контролем промотора PAOX1.

Оценка активности промоторов PPDI1 и PKAR2

Активность изучаемых промоторов оценивали по активности КФ, которую измеряли в суспензии клеток. При выращивании дрожжей в качестве единственного источника углерода мы использовали метанол, чтобы обеспечить сверхэкспрессию генов, находящихся под контролем промотора PAOX1. Полученные значения активности КФ представлены на рис. 3.

 

Рис. 3. Активность промоторов PKAR2 и PPDI1 в сравнении с активностью промотора PAOX1 в исходном штамме и в штаммах со сверхпродукцией собственного и гетерологичного белков. Данные представлены со стандартной ошибкой среднего

Fig. 3. The activity of promoters PKAR2 and PPDI1 in comparison with the activity of the PAOX1 promoter in the original strain and in strains with overproduction of native and heterologous proteins. The data are presented with a standard error of the mean

 

Из графиков видно, что активность изучаемых промоторов заметно ниже, чем у PAOX1, особенно со вторых суток культивирования. В то же время при сверхэкс­прессии гетерологичного гена активность промоторов PKAR2 и PPDI1 увеличивается.

Использование промоторов PPDI1 и PKAR2 для экспрессии гетерологичного гена HuIFNα16

Для проверки эффективности экспрессии гетерологичного гена под контролем изучаемых промоторов исходный штамм GS115 был трансформирован плазмидами p9PKAR2-IFNα16 и p9PPDI1-IFNα16 соответственно, в которых под контролем изучаемых промоторов находится структурный ген интерферона-альфа16 человека. Обозначения полученных штаммов — GS-PKAR2-IFNα16 и GS-PPDI1-IFNα16. Ранее ген HuIFNα16 человека был клонирован под контролем промотора гена AOX1 [21].

Наличие в штаммах-трансформантах нужных генетических конструкций и ориентацию встройки определяли при помощи ПЦР. Наличие гетерологичного белка в культуральной жидкости оценивали при помощи ИФА с антителами к интерферону-альфа16. В качестве контроля использовали культуральную жидкость исходного штамма GS115, выращенного в тех же условиях.

Как следует из результатов (рис. 4), в культуральной жидкости штаммов-продуцентов присутствует интерферон-альфа16 человека.

 

Рис. 4. Иммуноблотинг белков культуральных сред штаммов дрожжей, содержащих ген HuIFNα16 человека под контролем изучаемых промоторов. Культуральные жидкости штаммов: [O1] — GS-PPDI1-IFNα16 и [O2] — GS-PKAR2-IFNα16. М — маркер, [K-1], [K-2] — культуральная жидкость штамма GS115

Fig. 4. Western-blot analysis of proteins from culture fluids of yeast strains containing human HuIFNα16 gene under the control of promoters under study. Description: Culture fluids of strains: [O1] – GS-PPDI1-IFNα16 and [O2] – GS-PKAR2-IFNα16. M – protein marker, [K-1], [K-2] – a culture fluid of the strain GS115

 

Обсуждение

Анализ промоторов PKAR2 и PPDI1

В промоторах PKAR2 и PPDI1, как мы и предполагали, представлены потенциальные сайты связывания факторов транскрипции, которые регулируют ответ клетки дрожжей на различные стрессорные факторы, в том числе тепловой и окислительный шок и накопление несвернутого белка в ЭР. Исходя из анализа последовательностей изучаемых промоторов, можно заключить, что у дрожжей P. pastoris, как и у дрожжей S. cerevisiae, белок Hac1p — центральный участник UPR — взаимодействует с промоторами PPDI1 и PKAR2 (см. рис. 1). Но, как было уже отмечено ранее, у дрожжей P. pastoris в нормальных условиях не был найден несплайсированный вариант мРНК HAC1, что позволяет говорить об отличии механизмов UPR у разных видов дрожжей и, возможно, постоянной активности всех белков — участников UPR у P. pastoris [14]. Более детальное исследование состояния клетки дрожжей P. pastoris в условиях сверхпродукции гетерологичного белка, в том числе проверка наличия или отсутствия несплайсированного варианта мРНК HAC1, позволит дать ответ на этот вопрос. Существуют данные, подтверждающие тесную связь изменений, которые происходят в клетке при окислительном стрессе и нарушениях процесса секреции белка [37]. Дрожжи P. pastoris являются облигатными аэробами, в течение всего периода культивирования у них активно функционируют митохондрии, вырабатываются активные формы кислорода и увеличивается количество шаперонов и других белков, обеспечивающих защиту клеток от окислительного стресса. В связи с этим можно предположить большую готовность клетки метилотрофных дрожжей к воздействию различных стрессорных факторов, в том числе синтезу гетерологичных белков. Широкий спектр гетерологичных генов, успешно экспрессированных в P. pastoris, и высокая продуктивность штаммов-продуцентов это косвенно подтверждают.

Сравнение активности промоторов PKAR2, PPDI1 и PAOX1 в исходных штаммах

Как следует из результатов (см. рис. 3), максимальную активность промоторы PPDI1 и PKAR2 исходных штаммов демонстрировали на первые сутки культивирования. Активность промотора PPDI1 составляла 64 % от PKAR2, а активность промотора PKAR2 значимо не отличалась от активности промотора PAOX1 (p = 0,667) и составила 1,51 у. е.

Активность промоторов PPDI1 и PKAR2 в течение культивирования снижалась и на третьи сутки составляла 5 % (PPDI1) и 9 % (PKAR2) активности промотора PAOX1 с сохранением значимой разницы между собой (p = 0,026), в то время как активность PAOX1 повышалась. Увеличение активности PAOX1 можно объяснить тем, что клетке нужно время для адаптации к катаболизму метанола. Одной из причин снижения активности PPDI1 и PKAR2 могут быть изменения метаболизма штаммов-продуцентов, ранее обнаруженные у дрожжей S. cerevisiae в стационарной фазе роста и сопровождающиеся замедлением скорости процессов транскрипции и трансляции [38].

Учитывая функции белков Pdip1, Kar2p, Аох1р в клетке и роль последнего в метаболизме метанола, промоторы PPDI1 и PKAR2 не могут конкурировать с таким сильным промотором, как PAOX1. Известно, что при росте на средах, содержащих метанол в качестве единственного источника углерода, в клетке P. pastoris количество Аох1р может достигать 30 % от суммарного клеточного белка, а количество полиА-мРНК PpAOX1 может составлять до 5 % пула мРНК [39].

Сравнение активности промоторов PKAR2, PPDI1 и PAOX1 в условиях сверхэкспрессии гетерологичного и собственного генов

Данные (см. рис. 3) говорят о том, что при сверх­синтезе гетерологичного белка дельтазеина кукурузы, структурный ген которого клонирован под контролем РАОХ1, оба промотора демонстрируют рост активности. Максимальный прирост активности по сравнению с исходным штаммом (без сверхэкспрессии генов) составил 436 % (PPDI1) и 331 % (PKAR2) на третьи сутки культивирования. Активность промотора PPDI1 повышалась в большей степени относительно исходного штамма, на вторые сутки культивирования она составляла 28 % активности промотора PAOX1 и сохранялась на одном уровне на протяжении всего времени культивирования. Максимальная активность у промотора PKAR2 была зарегистрирована также на вторые сутки и составляла 51 % от активности PAOX1.

Повышение активности обоих исследуемых промоторов в условиях синтеза гетерологичного белка может свидетельствовать, что экспрессия генов PpPDI1 и PpKAR2 увеличивается в ответ на воздействие этого стрессорного фактора. Промотор PKAR2 в абсолютных величинах реагирует сильнее, вероятно, потому, что Kar2p является шапероном и играет основную роль в поддержании нормальной конформации как собственных, так и гетерологичных белков в ЭР. А белок Pdi1p участвует в формировании третичной структуры только белков, содержащих дисульфидные связи. Очевидно, различные стрессорные факторы могут затруднять нормальное сворачивание белков, что будет увеличивать время существования комплексов белок — шаперон и уменьшать пул свободных молекул шаперона. Это потребует увеличения количества Kar2p и, соответственно, усиления экспрессии гена PpKAR2. Не случайно промотор гена PpKAR2 имеет большее количество сайтов связывания транскрипционных факторов, контролирующих ответ клетки на различные стрессорные воздействия, по сравнению с промотором гена PPDI1.

При сверхпродукции собственного белка P. pas­toris — Pdi1p — активность промотора PKAR2 также увеличивалась, но в меньшей степени. Максимальный прирост активности (80 %) был зафиксирован на вторые сутки культивирования. Это может свидетельствовать в пользу нашего предположения о том, что для сворачивания собственных белков требуется меньше времени, быстрее происходит освобождение Kar2p из комплекса шаперон — белок, поэтому не требуется значительного увеличения количества шаперона.

Экспрессия гена модельного гетерологичного белка

В предварительных экспериментах мы показали возможность использования промоторов PPDI1 и PKAR2 для экспрессии гена HuIFNα16. Продемонстрированное нами повышение активности промоторов генов PpPDI1 и PpKAR2 у штаммов-продуцентов гетерологичного белка дает основание предполагать, что эти промоторы могут быть востребованы в биотехнологии.

Использование для экспрессии гетерологичных генов промоторов, которые повышают свою активность в ответ на синтез гетерологичного белка, может повысить продуктивность всего процесса за счет положительной обратной связи между накоплением гетерологичного белка в ЭР и активностью примененного промотора (рис. 5).

 

Рис. 5. Схема возможного эффекта от применения промоторов шаперонов для продукции гетерологичных белков

Fig. 5. Scheme of possible effect from the use of chaperone promoters for the production of heterologous proteins

Об авторах

Михаил Александрович Цыганков

ФГБУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет»

Автор, ответственный за переписку.
Email: mial.tsygankov@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2513-6655
SPIN-код: 1098-0995

инженер-исследователь, биологический факультет, кафедра генетики и биотехнологии, лаборатория биохимической генетики

Россия, 199034, г. Санкт-Петербург, Университетская наб., д.7/9

Марина Владимировна Падкина

ФГБУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет»

Email: mpadkina@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4051-4837
SPIN-код: 7709-0449

профессор, биологический факультет, кафедра генетики и биотехнологии, лаборатория биохимической генетики

Россия, 199034, г. Санкт-Петербург, Университетская наб., д.7/9

Список литературы

Дополнительные файлы