Molecular genetic basis of biofilm formation as a component of Vibrio Cholerae persistence in water reservoirs of Russian Federation

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Микроорганизмы вида Vibrio cholerae (Pacini 1854) — возбудители холеры, особо опасной кишечной инфекции, передающейся от человека к человеку водным либо пищевым путем. Проблема холеры остается достаточно острой для мирового здравоохранения, в особенности в связи с формированием и стремительным распространением новых генетически измененных штаммов, сочетающих в себе признаки двух различающихся по структуре геномов биоваров — Эль Тор и классического — и обладающих повышенным эпидемическим потенциалом [1, 2]. В первую очередь это касается эндемичных территорий с жарким климатом и слабым санитарно-гигиеническим обеспечением. Однако в связи с интенсивной миграцией населения (туризм, паломничество, бизнес, культурные связи и т. п.) и в таких странах, как Россия, имеющих умеренный климат и развитую систему здравоохранения, существуют риски заноса возбудителя и возникновения эпид осложнений. В комплексе факторов патогенности холерных вибрионов центральное место принадлежит холерному токсину, кодируемому генами ctxAB в составе профага CTX [2, 3]. С этим фактором связана эпидемическая опасность возбудителя. Штаммы, не содержащие ctxAB, считаются эпидемически безопасными. Вместе с тем многие нетоксигенные (ctxAB-) штаммы способны вызывать спорадические случаи и локальные вспышки заболеваний различной степени тяжести — от слабой и умеренной диареи до тяжелых форм, клинически неотличимых от типичной холеры, за счет экспрессии генетических детерминант целого ряда дополнительных факторов патогенности [3, 4]. Холерные вибрионы, периодически выделяемые от больных и из объектов окружающей среды (ООС) на территориях РФ [1, 2, 5], являются, как правило, заносными из эндемичных по холере стран. Несмотря на то что климатические условия большинства регионов нашей страны неблагоприятны для длительной персистенции V. cholerae, они могут сохраняться в ООС в течение некоторого времени [5, 6]. Поэтому актуальной представляется оценка не только их эпидемического и патогенетического, но и персистентного потенциала, обеспечивающего им сохранение в ООС РФ и пограничных стран. Одну из ключевых ролей в персистенции играет способность к формированию биопленок. Этот сложный многоступенчатый процесс зависит от экспрессии множества генов, среди которых наибольшее значение придают кластерам msh, vps и rbm [7, 8]. Кластер msh включает 17 генов, организованных в два оперона — mshHIJKLMNIJ, кодирующий секреторные белки, и mshBACDOPQ, ответственный за синтез структурных компонентов (субъединиц) пилей MSHA [9], которым принадлежит ведущая роль в адгезии на первом этапе биопленкообразования. Формирование матрикса зависит от продуктов обеспечивающих синтез полисахаридов (VPS) и белков генов, организованных в три сцепленных кластера: vps-I(vpsUABCDEFGYIJK), vps-II (vpsLMNOPQ) и находящийся между ними rbm (rbmABCDEF). Кроме того, в процесс вовлечены продукты ряда структурных и регуляторных генов, расположенных за пределами указанных кластеров [10, 11]. Изучение их структуры и биоинформатический анализ продуктов трансляции в сочетании с фенотипическим определением способности к формированию биопленок позволяют судить о функциональном состоянии данных факторов и о потенциальной возможности более или менее длительного сохранения возбудителя в ООС, что и стало предметом настоящего исследования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследования служили 15 штаммов V. cholerae (10 токсигенных и 5 нетоксигенных), выделенных от людей и из ООС на территориях РФ и некоторых бывших республик СССР (табл. 1). Для сравнения в анализ был включен штамм 569B — типичный представитель классического биовара. Штаммы были получены из коллекции Музея живых культур с Цент ром патогенных для человека вибрионов ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотреб надзора.

Способность к образованию биопленок на абиотических объектах (покровных стеклах) изучали в микрокосмах [12]. В 100 мл флаконы устанавливали спиралевидное устройство с покровными стеклами и вносили в них взвеси суточных агаровых культур холерных вибрионов в стерильной водопроводной воде в конечной концентрации 102 микробных клеток в 1 мл (рис. 1).

 

Таблица 1. Характеристика исследуемых штаммов V. cholerae

Table 1. Characteristics of V. cholerae strains under investigation

Штамм / Strain	Место выделения / Isolation territory	Источник / Source	Год / Year	ctxAB	Биовар / Biotype
569B	Индия / India	Неизвестен / Unknown	1948	+	class.
Р-17917	Ростов-на-Дону / Rostov-on-Don	Речная вода / River water	1999	+	class.
Р-5879	Таганрог / Taganrog	Труп больного / Defunct patient	1972	+	ET
Р-18252	Ростов-на-Дону / Rostov-on-Don	Сточные воды / Sewage	2000	+	ET
Р-18367	Ростов-на-Дону / Rostov-on-Don	Сточные воды / Sewage	2001	+	ET-alt
Р-18368	Ростов-на-Дону / Rostov-on-Don	Речная вода / River water	2001	+	ET-alt
18329	Казань / Kazan	Больной / Patient	2001	+	ET-alt
18336	Казань / Kazan	Больной / Patient	2001	+	ET-alt
Р-18588	Ростов-на-Дону / Rostov-on-Don	Речная вода / River water	2003	+	ET-alt
Р-١٩٢٤١/301	Ростовская область / Rostov region	Морская вода / Sea water	2011	+	ET-alt
Р-١٩٦١٣/81	Ростов-на-Дону / Rostov-on-Don	Речная вода / River water	2014	+	ET-alt
14156	Азербайджан / Azerbaijan	Больной / Patient	1989	–	ET
14863	Одесская область / Odessa region	Больной / Patient	1991	–	ET
5392	Донецкая область / Donetsk region	Речная вода / River water	1972	–	ET
19308	Астраханская область / Astrakhan region	Речная вода / River water	2012	–	ET
Р-19787/434	Сочи / Sochi	Речная вода / River water	2015	–	ET
Примечание: сlass. — классический биовар, ET — Эль Тор, alt — генетически измененный штамм. Note: сlass. – classical biotype, ET – El Tor, alt – genetically altered strain.

 

Рис. 1. Схема микрокосма для изучения образования биопленок V. cholerae

Fig. 1. Scheme of a microcosm for studies of biofilm formation by V. cholera

 

Флаконы инкубировали при 25 °С, что соответствовало температуре в водоемах средних широт в летнее время. Через определенные промежутки времени стекла извлекали стерильным пинцетом, трижды промывали их в физиологическом растворе, фиксировали в течение 30 мин в 96 % этаноле, затем окрашивали 1 % водным раствором Конго красного (ООО «ЭКОХИМ», Россия) в течение 15 мин для выявления VPS матрикса [13]. Для визуализации вибрионов мазки докрашивали карболовым фуксином (10 мл насыщенного спиртового раствора фуксина, 90 мл 5 % карболовой кислоты) в течение 5–6 мин, промывали водопроводной водой, высушивали, помещали на предметное стекло и просматривали в световом микроскопе в диапазоне увеличения 7 × 90, 9 × 90. Стадии образования биопленки определяли по наличию адгезии вибрионов к стеклам (I стадия), скоплений микробных клеток (II), монослоя и VPS матрикса (III), конгломератов клеток, погруженных в интенсивно окрашенный матрикс (IV). Все опыты выполнены в трехкратной повторности.

Полногеномное секвенирование ДНК проводили на платформе MiSeq (Illumina) согласно прилагаемому протоколу. Библиотеки готовили с использованием набора Nextera DNA Library Prep Kit (Illumina), первичные данные секвенирования (парные риды размером 250 п. н., среднее покрытие N48), полученные с помощью набора MiSeq Reagent Kit v2 (Illumina), оценивали при помощи программы FastQC (www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc). Для трим минга использовали алгоритм Trimmomatic (http://www.usa dellab. org/cms/index.php?page=trimmomatic) [14]. После проведения тримминга объем первичных данных был сокращен на 20 %. Средний размер контигов после сборки с применением программы ABySS (http://www.bcgsc.ca/platform/bioinfo/software/abyss) [15] составил 120 т. п. н.

Отдельные гены и их кластеры идентифицировали в полных геномах с помощью программ BLASTN2.2.29 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) и BioEdit 7.2.5 (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit). Трансляцию генов, сравнительный анализ их нуклеотидных последовательностей и аминокислотных последовательностей их продуктов осуществляли с использованием пакета программ Vector NTI Advance 11 (Invitrogen). Прототипами служили соответствующие последовательности референс-штамма V. cholerae N16061 (AE003852, AE003853). Для определения наличия и локализации активных доменов в белках, а также выявления их гомологов у штаммов из других регионов мира выполняли Blastp-анализ (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov).

Собранные сиквенсы генных кластеров, подверг нутых анализу, депонированы в базе данных NCBI GenBank под номерами: MG551931–MG551946 (msh clusters), MF498890, MF498891, MG521386–MG521402 (vps-rbm-clusters).

РЕЗУЛЬТАТЫ

В приведенных выше условиях эксперимента испытуемые штаммы V. cholerae различались по скорости образования биопленки. У большинства первая стадия адгезии к стеклам происходила в течение суток, у одного — на третьи и у трех — на пятые сутки, тогда как сроки созревания биопленки отличались гораздо большим разнообразием (табл. 2). У одного штамма процесс останавливался на III стадии.

 

Таблица 2. Сроки прохождения стадий образования биопленки штаммами V. cholerae (сут) и наличие у них отклонений в структуре ответственных за этот процесс генов

Table 2. Periods of stages of biofilm formation by V. cholerae strains (days) and presence of deviations in the structure of responsible genes

Штамм / Strain	Стадии биопленкообразования / Stages of biofilm formation				Гены, существенно отличные от прототипов / Genes significantly different form prototypes
	I	II	III	IV	Измененные / Altered	Усеченные / Truncated
569B	5	5	11	12	vpsP	vpsE, vpsQ
Р-17917	1	2	2	2	vpsP	mshO, vpsE, vpsQ, hapR, cdgA
Р-5879	1	3	7	12	–	rbmC
Р-18252	1	2	5	5	–	cdgA
Р-18367	1	2	5	7	–	–
Р-18368	1	2	5	5	–	–
18329	1	2	3	7	–	–
18336	3	3	7	–	–	vpsR
Р-18588	1	2	5	5	cdgL	–
Р-19241/301, Р-19613/81	1	2	5	5	–	–
14156	5	5	12	13	–	mshQ, rbmB, rbmC, cdgA
14863	5	5	12	13	vpsU, vpsD	mshL, mshN, vpsH, vpsI, vpsJ, rbmB
19308, Р-19787/434	1	2	3	3	mshA, mshC, mshD, mshQ, vpsF, vpsU, vpsD	vpsH, vpsI, vpsJ, rbmB
5392	1	2	4	5	mshH	–

 

Таким образом, все штаммы были способны к адгезии на абиотических поверхностях и почти все — к формированию зрелой биопленки; межштаммовые различия касались сроков, от которых может зависеть конкурентоспособность микроорганизмов в ООС. Поэтому мы предприняли попытку найти коррелятивные связи между этими сроками и структурой соответствующих генетических детерминант (см. табл. 2).

У токсигенных штаммов кластеры msh существенно не отличались от прототипа, и адгезия большинства к стеклам происходила в течение суток. Однако обращает на себя внимание неожиданно быстрая адгезия классического штамма Р-17917 (1 сут), в отличие от использованного для сравнения 569B (5 сут). Считается, что классические штаммы, хотя и синтезируют субъединицы MSHA, не собирают из них пили на поверхности клеток, однако из этого правила встречаются исключения [16–18], и, возможно, этот штамм является одним из таких исключений. Поэтому мы дополнительно проверили промоторную область обоих msh-оперонов, использовав в качестве эталонных таковые референс-штамма [9]. У штамма Р-17917 промоторы обоих msh-оперонов имели 100 % гомологии с прототипом, тогда как у штамма 569В в промоторе оперона, ответственного за секрецию субъединиц и сборку пилей, выявлена однонуклеотидная замена (SNP) C/T в позиции –3 относительно последовательности –10. Учитывая, что аналогичная SNP в промоторной области гена tdh V. parahaemolyticus приводит к резкому снижению экспрессии гена [19], можно предположить, что у V. cholerae она способна вызвать такой же эффект. Не исключено, что описанный в [17] спонтанный мутант классического штамма, образующий MSHA, как раз и является мутантом именно по этой SNP, как и штамм Р-17917. У последнего с 771 до 579 п. н. был укорочен ген mshO как следствие делеции G-465, приведшей к сдвигу рамки считывания (FS — frame shift) и образованию преждевременного стоп-кодона (PSC — premature stop codon), но его продукт сохранил домен пилина. Белок MshO представляет собой минорную субъединицу пилей. Тем не менее его укороченный и отличный по аминокислотному составу С-конец мог повлиять на конфигурацию белка, повысив адгезивную активность пилей. Такая же большая разница между этими двумя классическими штаммами наблюдалась и в сроках формирования зрелой биопленки (2 и 12 сут), хотя оба характеризовались одинаковыми изменениями в кластерах vps и rbm, скорее всего, не слишком существенными для образования матрикса. Однако у штамма Р-17917 имелось одно значительное отличие, состоящее в повреждении гена отрицательного регулятора HapR, в отсутствие которого биопленка образуется значительно лучше [20]. Мы полагаем, что это и послужило основной причиной ускоренного формирования биопленки этим штаммом, даже несмотря на присутствие интактных генов двух других отрицательных регуляторов (cytR, hns) и инактивацию гена одной из шести дигуанилатциклаз (cdgA), продукты которых обеспечивают необходимый уровень циклического дигуанидина — мессенджера, контролирующего переход свободноживущих бактерий в биопленочное состояние за счет стимуляции белка VpsT — активатора транскрипции оперона vps-II [21].

Из токсигенных штаммов биовара Эль Тор два (Р-5879 и 18336) характеризовались нарушениями в формировании биопленки: у первого процесс завершался через 12 сут, у второго зрелая биопленка не образовалась даже на 21-й день. Наиболее вероятные причины заключались в следующем. Штамм 18336, образовавший «недозрелую» биопленку, при отсутствии каких-либо отклонений в структуре vps-rbm-кластеров и большинства регуляторных генов содержал резко усеченный, до 72 п. н. ген положительного регулятора vpsR (SNP G/A-72, PSC). Из литературных данных известно, что выключение этого гена влияет именно на конечные стадии формирования трехмерной структуры биопленки [22]. Замедленное образование биопленки штаммом Р-5879 (с интактными регуляторными генами) могло быть связано с повреждением гена rbmC (вставка С-336, FS, PSC) и неспособностью к продукции полноценного белка, хотя он вполне заменим функциональным двойником Bap1, ген которого у данного штамма остался неповрежденным. Вместе с тем описавшие это явление авторы [23] определяли наличие самой биопленки, а не сроки ее созревания. Поэтому мы полагаем, что выключение одного из двух необходимых генов привело к замедлению процесса. У остальных токсигенных штаммов, не имеющих существенных отклонений в структуре всех генов (кроме Р-18588 с усеченным cdgL), процесс укладывался в «обычные» сроки (5–7 дней), в том числе у штамма Р-18252 c усеченным cdgL и необратимо поврежденным cdgA. Это согласуется с данными литературы о том, что биопленка не образуется только при условии выключения сразу всех генов cdg [21].

Что касается нетоксигенных штаммов, то среди них также отмечена значительная разница в сроках адгезии и созревания биопленки. Только у одного из них (5392), образовавшего биопленку за 5 сут, не выявлено существенных отличий от прототипа в структуре генов биопленкообразования, кроме усеченного mshH (c 2022 до 1734 п. н. за счет вставки G-1653, FS и PSC), продукт которого сохранил консервативные домены, а сам ген — промотор msh-оперона.

У двух быстро образующих биопленку и практически идентичных штаммов (Р-19787/434, 19308) выявлены существенные отклонения в структуре кластера msh (рис. 2). Прежде всего это касалось измененных генов mshА и mshC. Так, вместо канонического mshA (537 п. н.) у них присутствовал ген, обозначенный нами как mshA-like (486 п. н.). Гомологичные ему гены были найдены в базах NCBI, и их продукты зачастую были обзначены как MshA (WP_000828591, BAB58970, BAD06382 и др.). Значительным изменениям подверглись и mshC, которые мы также обзначили как mshC-like. Их длина составляла 513 п. н. (у прототипа — 489 п. н.). В NCBI также найдены гомологичные им гены, продукты которых обозначены как MshC (KQA28936, CSE26627, OLZ28182 и др.). Кроме того, эти штаммы имели измененные mshD (делеция 3 п. н. без FS) и mshQ (ряд делеций, вставок и FS внутри гена). Однако эти перестройки никак не повлияли на скорость адгезии. Действительно, как показал Blastp-анализ продуктов измененных генов, все они сохранили активные домены, характерные для пилинов.

 

Рис. 2. Сравнение msh-кластеров двух штаммов V. cholerae. Гены, идентичные либо близкие прототипным, обозначены черным цветом, существенно отличные — серым

Fig. 2. Comparison of msh-clusters of 2 V. cholerae strains. Genes, identical or similar to prototypes are shown in black and significantly different – in grey

 

Существенными отклонениями от прототипа обладали и идентичные друг другу vps-rbm-кластеры этих штаммов (рис. 3). В частности, в кластере vps-I обнаружена новая открытая рамка считывания (ORF — open reading frame) длиной 1149 п. н., локализованная между усеченным вследствие образования PSC vpsH и значительно измененным vpsI. Вероятно, эта orfU-1149 может транслироваться, поскольку перед ней имеется предполагаемый сайт связывания с рибосомой. Продукт ее трансляции имеет 100 % гомологии с гипотетическими белками шести штаммов холерных вибрионов, найденных в NCBI (WP_069730871, OEJ10796, OFI89280, OFI93704, OFJ06220, OFJ10326) и, согласно данным Blastp-анализа, содержит два предполагаемых домена, один из которых (ATPgrasp_ST), вероятно, участвует в синтезе поверхностных полисахаридов; функция второго не установлена. У обоих штаммов отсутствовали гены vpsC и vpsG, продукты которых (ацетилтрансферазы), по-видимому, модифицируют полисахариды, придавая им бо́льшую вязкость, но биопленка в их отсутствие все равно образуется [10]. Ген vpsI обладал всего 50 % идентичности прототипному гену и изменил длину с 1098 до 1062 п. н., а его продукт имел измененную архитектуру доменов гликозилтрансфераз, из которых три совпадали с таковыми прототипа, а вместо трех остальных появились два относящихся к другим семействам. Полные гомологи этого гена принадлежали найденным в NCBI шести штаммам (WP_069730871, OEJ10796, OFI89280, OFI93704, OFJ06220, OFJ10326). PSC в vpsH образовался вследствие SNP A/T-1327, и ген укоротился без FS всего на 12 п. н., а его продукт cохранил активный домен лигазы PaaK. Такие же укороченные на четыре аминокислотных остатка (аа) белки были свойственны множеству штаммов из NCBI (WP_069730870, OEJ10795, OFI89279, OFI93703, OFJ06219, OFJ10325 и др.). Кроме того, были существенно изменены гены vpsU, vpsD, vpsP, rbmF и усечены отличные от прототипов vpsJ и rbmB. Ген vpsU, кодирующий тирозинфосфатазу, вовлеченную в продукцию VPS, был удлинен на 63 п. н. (5’-концевых), но его продукт сохранил активный домен. В NCBI найден его 99 % гомолог (EEN99244), содержащий несколько 1-6-нуклеотидных вставок/делеций и удлиненный на 9 п. н., vpsD имел всего 58,5 % гомологии с прототипом, и тем не менее в продукте выявлены те же домены гликозилтрансфераз, что и у прототипа. Продукт гена vpsP содержал один «лишний» остаток треонина в позиции 136 и характеризовался таким же отсутствием консервативных доменов, как и прототип. Он также имел гомологи в NCBI (WP_000990931, OEJ10808, OFI89292, OFI93716 и др.). Ген rbmB укоротился с 1227 до 1194 п. н. из-за образования PSC (SNP C/T-1225, без FS). В его продукте, лишенном 11 С-концевых аа, программой Blastp консервативные домены не выявлены, впрочем, как и в прототипном RbmB. Это не позволяет судить о вероятности сохранения функциональности усеченным белком. Fong et al. [10] установили, что элиминация rbmB не влияла на саму способность к образованию биопленки, но меняла ее структуру: пленки становились более толстыми и гетерогенными. При этом у делеционного мутанта не изменялся уровень синтеза VPS, но увеличивалось их накопление в биопленке. И наоборот, гиперэкспрессия этого гена с индуцибельного промотора приводила к снижению толщины и плотности зрелой биопленки. Авторы полагают, что RbmB действует как полисахарид-лиаза, разрущающая компоненты матрикса. Ген rbmF имел существенные отличия за счет FS, вызванного делецией 6 п. н. в позиции 20–25, однако продукт его трансляции полностью гомологичен гипотетическим белкам 18 штаммов V. cholerae, найденных в NCBI (WP_001247411, EKM05021, KNA51715 и др.), но также не содержит консервативных доменов. Этот белок участвует в агрегации клеток и образовании структуры биопленки [10].

 

Рис. 3. Сравнение кластеров vps-I – rbm – vps-II двух штаммов V. cholerae. Гены, идентичные либо близкие прототипным, обозначены черным цветом, существенно отличные — серым, усеченные — белым, новый ген заштрихован

Fig. 3. Comparison of vps-I – rbm – vps-II clusters of two V. cholerae strains. Genes, identical or similar to prototypes are shown in black, significantly different – in grey, truncated – in white, the new gene is hatched

 

Следует отметить, что при Blastn-поиске гомологов полной последовательности vps-rbm-кластера наших штаммов Р-19786/434 и 19308 в базах NCBI был найден единственный штамм V. cholerae 1154–74, содержащий не идентичную, но очень близкую (98–99 %) последовательность. Когда мы «вырезали» ее из генома (CP010811) и проанализировали, в ней были выявлены такие же измененные гены.

Из двух медленно образующих биопленку штаммов у 14156 таких резких изменений не обнаружено. Все гены кластера msh были близки прототипу, кроме укороченного mshQ (c 3717 до 1197 п. н. за счет вставки G-1167, FS и PSC). Его укороченный продукт (398 вместо 1252 аа) фактически утратил единственный свойственный ему лектиновый домен. Вполне вероятно, что это и послужило причиной замедленной адгезии, поскольку MshQ необходим для сборки пилей и в его отсутствие их число значительно снижается [9]. Замедленное формирование биопленки этим штаммом, по всей видимости, было связано с укорочением гена rbmC (делеция G1090, PSC), как в случае со штаммом Р-5879, хотя, в отличие от последнего, его продукт имел бо́льшую длину и сохранил один из шести доменов. Интересно, что у штамма 14156 был также сильно усечен ген rbmB (SNP C/G-834, PSC), как у двух быстро образующих биопленку штаммов.

У штамма 14863 резко усечен ген mshL (с 1680 до 216 п. н. за счет SNP C/T-214 и образования PSC) и менее значительно — mshN (с 1170 до 1155 п. н. за счет SNP C/A-13 и утраты прототипного старт-кодона). Продукты обоих участвуют в биогенезе пилей [8]. Однако промоторные области msh-оперонов не отличались от прототипа, а его укороченный MshN сохранил активный домен, хотя белок вполне мог иметь другую конфигурацию и пониженную активность. Возможно, на адгезивные свойства пилей влияют многочисленные SNP во всех генах кластера, в том числе миссенс-мутации, но это предположение требует экспериментального подтверждения. С другой стороны, его vps- и rbm-кластеры были очень близки (но далеко не идентичны) таковым штаммов Р-19787/434 и 19308, образущих биопленку в пределах 3 сут. VpsD штамма 14863 отличался от двух других по шести единичным заменам аа. По-видимому, эти белки не утратили своей активности, в отсутствие которой прекращается синтез VPS, формирование пелликулы и способность к биопленкообразованию резко подавляется [10]. Ген vpsJ был укорочен на 9 п. н. (5’-концевых), и его соответственно укороченный на три N-концевых аа продукт сохранил активный домен. Идентичные ему белки выявлены у девяти штаммов из NCBI (WP_000154423, KNA51709, OEC29014 и др.) и обозначены как аспартатдегидрогеназы. Отмеченные в табл. 2 измененные гены 14863 имели такую же длину, но отличались от генов Р-19787/434 и 19308 рядом SNP. Не исключено, что различные SNP привели к увеличению сроков образования биопленки у первого и к их сокращению у двух последних. Также длительное созревание биопленки могло быть следствием медленной адгезии.

ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные данные позволили установить некоторые корреляции между скоростью биопленкообразования и структурой ответственных на это белков. В частности, изменения и повреждения ряда генов коррелируют с замедлением или, наоборот, с ускорением созревания биопленки, в связи с чем, вероятно, могут служить критериями при определении потенциальной способности штаммов к переживанию в водных ООС. Однако при этом следует иметь в виду, что холерные вибрионы обладают огромным количеством генетических детерминант, продукты которых различными способами влияют на формирование биопленки. По-видимому, сохранение их всех в неизменном виде в относительно небольшом геноме и поддержание в активном состоянии энергетически невыгодно. Поэтому в процессе адаптации к разным экологическим нишам многие штаммы, предположительно, снижают эти затраты путем утраты или «вывода из строя» части генов, влияние которых не столь значительно либо может быть дублировано другими (например, vpsP, vpsQ, vpsC, vpsG, отдельные гены cdg) [10, 21]. Еще один предполагаемый путь — это укорочение и изменение нуклеотидного состава ряда генов с вероятным сохранением, а возможно, и с улучшением функциональной активности их продуктов (mshH, mshA, mshC, vpsU, vpsD, vpsE, vpsH,vpsI, vpsJ). Мы также наблюдали присутствие нового гена (orfU-1149), по-видимому, кодирующего фактор образования матрикса биопленки. Такая изменчивость в большей степени свойственна нетоксигенным штаммам, которые чаще персистируют в ООС и вынуждены приспосабливаться к их условиям, сохраняя под давлением отбора самые жизнеспособные варианты. На неслучайный характер консервации в геноме ряда существенно измененных детерминант указывает обнаружение в базах NCBI полных гомологов их продуктов, принадлежащих штаммам из разных регионов мира. Мы полагаем, что многие факторы биопленкообразования так же «взаимозаменяемы», как и факторы патогенности, а также некоторые другие факторы персистенции, описанные ранее [3, 4]. С другой стороны, результатом повреждения некоторых генов (mshQ, rbmC, vpsR) является замедление процесса, а генов отрицательных регуляторов (hapR, hns), напротив, его ускорение. То и другое оказывает влияние на конкурентоспособность и выживаемость штаммов в ООС. Вместе с тем следует отметить, что укорочение исследованных нами генов произошло в основном в результате точковых мутаций, приведших к образованию PSC. Поэтому не исключена возможность их восстановления вследствие обратных мутаций и реверсии штаммов в исходное состояние.

Токсигенные штаммы биовара Эль Тор за редким исключением содержат интактные гены, близкие прототипам, что свидетельствует в пользу их потенциальной способности к сохранению в ООС в составе биопленок. Геномы двух штаммов (Р-19241/301 и Р-19613/81) — геновариантов с повышенным эпидемическим потенциалом, выделенных в Ростовской области с разницей в 3 года, различаются незначительно [24], что наводит на мысль о вероятности длительного выживания первого в ООС. Сохранение классических штаммов в настоящее время менее актуально, поскольку на сегодняшний день они практически вытеснены вибрионами Эль Тор, и изученный нами штамм Р-17917 с ускоренным биопленкообразованием является последним обнаруженным в России; ранее два таких штамма были выделены из воды в Ростове (1981) и в Сочи (1996) [25]. Скорее всего, они были занесены из стран Юго-Восточной Азии, где в 1980–1990-е гг. снова «возродились» классические штаммы, а в Бангладеш на некоторое время даже заняли доминирующую позицию в этиологии холеры [26–28], хотя с 1983 по 1997 г. они периодически встречались и в Мексике [29, 30]. Появление классических штаммов в водоемах России не сопровождалось эпидосложнениями. Тем не менее мы не можем полностью исключить возможности их циркуляции в эндемичных странах и новых заносов в будущем. Известно, например, что в 2008 г. 11 штаммов были выделены из сточных вод в Непале [31], а в 2012 г. в Иране 1 из 11 клинических «вспышечных» штаммов оказался классическим [32].

Представляет интерес и тот факт, что один из двух быстро образующих биопленку нетоксигенных штаммов (Р-19786/434) является представителем клонального комплекса, получившего необычно широкое распространение в водоемах Сочи и окрестностей в 2015 г., где в течение двух месяцев было выделено 83 одинаковых штамма. Второй, практически идентичный ему штамм 19308, вероятно, был его предшественником, занесенным с другой территории [1]. Возможно, длительное существование указанного клона в ООС и трехлетнее сохранение штамма 19308 было отчасти или полностью обусловлено способностью к ускоренному формированию биопленок. В этот период заболеваний людей, вызванных такими штаммами, зарегистрировано не было, однако они обладают патогенетическим потенциалом, поскольку содержат интактные детерминанты дополнительных факторов патогенности (сериновой протеазы, гемагглютинин/протеазы, цитотонического токсина Cef, гемолизина, системы секреции 6-го типа) и в определенных условиях могут стать этиологическими агентами холероподобной диареи [3, 4]. Все это подчеркивает значимость постоянного мониторинга за холерными вибрионами на территории РФ независимо от их токсигенности.

Наконец, холерные вибрионы могут еще более интенсивно формировать биопленки на биотических поверхностях, таких как водная растительность и хитин ракообразных [11]. Проявление этой способности в экологических условиях РФ и ее связи с состоянием ответственных генетических детерминант служат предметом наших дальнейших исследований.

About the authors

Svetlana V. Titova

Rostov-on-Don Research Anti-Plague Institute

Email: titova_sv@antiplague.ru

PhD, Director

Russian Federation, 117/40, Gorkogo street, Rostov-on-Don, 344002

Elena V. Monakhova

Rostov-on-Don Research Anti-Plague Institute

Author for correspondence.
Email: monakhova_ev@antiplague.ru

DPhil, Leading Researcher, Head of Group of Molecular Biology of Vibrio Human Pathogens

Russian Federation, 117/40, Gorkogo street, Rostov-on-Don, 344002

Ludmila P. Alekseeva

Rostov-on-Don Research Anti-Plague Institute

Email: alekseeva_lp@antiplague.ru

DPlil, Professor, Head of Laboratory of Hybridomes

Russian Federation, 117/40, Gorkogo street, Rostov-on-Don, 344002

Ruslan V. Pisanov

Rostov-on-Don Research Anti-Plague Institute

Email: pisanov_rv@antiplague.ru

Phd, Head of Laboratory of Diagnostics of Especially Dangerous Infections

Russian Federation, 117/40, Gorkogo street, Rostov-on-Don, 344002

References

Supplementary files