IN VITRO EFFECT OF L-CARNITINE ON THE ACTIVITY OF LYSOSOMAL CYSTEINE PROTEASES AND THE STATE OF LYSOSOMAL MEMBRANE

Full Text

Лизосомальные цистеиновые протеиназы (ЛЦП) относятся к семейству папаиноподобных протеолитических ферментов, характеризуются уникальной направленностью действия и неравномерной выработкой различными тканями. В живых организмах активность тиоловых катепсинов представляет собой тонкий баланс между их экспрессией, направленностью действия, активацией проферментов, подавлением их выработки ингибиторами и дальнейшим распадом. Локализуются ЛЦП преимущественно в лизосомах и поздних эндосомах клетки, однако, могут локализоваться в ядре, цитоплазме и плазматической мембране. Тиоловые катепсины являются важными регуляторами и сигнальными молекулами в неограниченном числе биологических процессов, таких как иммунный ответ, ремоделирование костной ткани, активация предшественников многих белков, дифференцирование кератиноцитов и др. Известна роль катепсинов в развитии мышечной дистрофии, ревматоидного артрита, болезни Альцгеймера, атеросклероза [1-3]. ЛЦП принимают участие в процессах, связанных с раковой прогрессией, таких как апоптоз, метастазирование, опухолевый рост, инвазия и ангиогенез. В тканях многих опухолей показано увеличение активности и содержания цистеиновых протеиназ. Так, в клеточных культурах опухоли простаты наблюдается высокий уровень катепсинов В, L, H и увеличение отношения катепси-ны/ингибиторы по сравнению с культурой нормальных клеток [4]. Активно изучается участие ЛЦП в процессах опосредуемой клеточной гибели. Так, была обнаружена ранняя утечка катепсинов B, D и L в цитозоль, где они активируют каспазы 3 и 9, запуская апоптоз. Также имеются данные о каспазонезависимом пути клеточной гибели, сигналом которого служит пермеабили-зация лизосомальной мембраны (ПЛМ). Наряду с достижением избирательной проницаемости лизосомальной мембраны одним из факторов выхода катепсинов в цитозоль является лабилизация мембраны [5].

В связи с этим важен поиск соединений, способных стабилизировать лизосо-мальную мембрану. Особый интерес представляет L-карнитин, способный в концентрации 5 мМ повышать стабильность лизосомальной мембраны гепатоцитов крысы при часовой  in vitro-инкубации  [6]. На клетках Jurkat было показано, что 5 мМ L-карнитин оказывает защитное действие при апоптозе, что обусловлено ингибированием синтеза церамидов и активности каспаз 3, 7 и 8 [7]. Однако, в ходе исследований, проведенных на клетках карциномы человека, было обнаружено апоптогенное действие 10 мМ карнитина в сочетании с бутиратом [8]. Также было показано, что на фоне гиперго-моцистеинемии L-карнитин приводит к снижению активности катепсинов L и Н и оказывает стабилизирующее влияние на ли-зосомальные мембраны клеток сердечной мышцы [9]. Таким образом, актуальным является изучение влияния L-карнитина на лизосомальный цистеиновый протеолиз и состояние лизосомальной мембраны.

Целью данного исследования стало изучение прямого влияния L-карнитина на лизосомальный цистеиновый протеолиз  in vitro.

Материалы и методы

Выделение лизосом.  За 12 часов до забоя половозрелых интактных крыс-самок линии Wistar массой 280-330 г лишали пищи для стандартизации условий опытов. Эвтаназия животных осуществлялась методом обескровливания под эфирным рауш-наркозом при сохраненном дыхании и сердцебиении. Печень извлекали немедленно после обескровливания, помещая орган в охлажденный 0,25 М раствор сахарозы (среда выделения). Далее печень промывали от остатков крови средой выделения, после чего готовили точные навески участков печени в пределах 740-760 мг на электронных весах (AJH-220 CE, Япония). Полученный материал измельчали ножницами и помещали в стеклянный стакан гомогенизатора «Potter S» (Sartorius, Германия), добавляя холодный 0,25 М раствор сахарозы в соотношении 1:9 и гомогенизировали в течение 35 с тефлоновым пестиком 900 об./мин и зазоре в пределах 0,16-0,24 мм. Описанные процедуры проводили при температуре не выше 4°С. Полученные гомо-генаты центрифугировали 15 мин при 3000 об./мин (центрифуга CM-6M ELMI, Латвия) для осаждения не полностью разрушенных клеток и ядер. Надосадочную жидкость отбирали пипеткой в отдельные гильзы и центрифугировали 15 мин при 13000 об./мин для удаления митохондрий, а затем полученный супернатант - дополнительно при 15500 об./мин в течение 30 мин (центрифуга рефрижераторная К 24 Д, ГДР). Осадок, представляющий собой грубую фракцию лизосом, ресуспендировали в 2 мл 0,25 М сахарозы и использовали для  in vitro  исследования.

Инкубация.  Полученные суспензии лизосом печени в 0,25 М сахарозе разделили на две серии по 6 проб в каждой: серию 1 (серия сравнения, 2 мл 0,25 М сахарозы) и серию 2 (1,9 мл 0,25 М сахарозы с добавлением раствора 0,1 мл карнитина с конечной концентрацией 5 мМ). Каждая серия воспроизводилась трижды; инкубация осуществлялась при температуре 37°С на водяной бане в течение 1-го, 2-х и 4-х часов. После инкубации лизосомы повторно осаждали центрифугированием при 15500 об./мин в течение 30 мин. Затем отбирали надосадоч-ную жидкость (неседиментируемая фракция, НСФ), а осадок (седиментируемая фракция, СФ) ресуспендировали в 0,25 М сахарозе с добавлением Тритона Х-100 в конечной концентрации 0,1%. Полученные аликвоты замораживали и хранили до момента исследования при температуре -20°С не более 1 месяца.

Определение активности лизосомальных цистеиновых протеиназ.  Активность катепсинов В, L и Н изучалась спектроф-луориметрическим методом (System 3 Scanning Spectrofluorometr, Optical technology devices, inc. Elmstord, New York, 10523) по Barrett & Kirschke [10]. Удельную активность катепсинов выражали в нкат/г белка. Содержание белка определяли по методу Лоури коммерческим набором Научно-практического центра «Эко-сервис» (Санкт-Петербург, Россия). Описанное измерение активности ферментов осуществлялось раздельно для СФ и НСФ и обозначалось для каждого катепсина как седимен-тируемая активность (СА) и неседиментируемая активность (НСА) соответственно.

Оценка стабильности лизосомальной мембраны.  Для оценки стабильности лизо-сомальной мембраны традиционно используется коэффициент лабильности (Клаб), рассчитываемый как соотношение активности лизосомального фермента во внелизо-сомальной (неседиментируемой) фракции к общей активности (ОА), представляющей собой сумму НСА и СА для данного фермента [11]. Поскольку для лизосомальных-цистеиновых протеиназ описан механизм секреции [12], в качестве основного маркера лабилизации мембран использовали активность кислой фосфатазы [13]. Активность фермента измеряли унифицированным методом по «конечной точке», используя коммерческий набор «Витал Диагно-стикс СПб» (Санкт-Петербург, Россия).

Для каждой выборки определяли значение медианы ^е), верхнего и нижнего квартилей. Результаты представлены в формате Me [Q₁; Q3]. Для проверки статистической значимости отличий в контрольной и опытной группе использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Отличия считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты и их обсуждение

Обнаружено, что прямое воздействие карнитина в конечной концентрации 5 ммоль/л приводит к отчетливым изменениям как активности ЛЦП, так и стабильности ли-зосомальной мембраны. Оценка стабильности лизосомальной мембраны по показателю Клаб кислой фосфатазы продемонстрировала, что одно- и двухчасовая инкубация в среде, содержащей 5 мМ L-карнитин, приводит к падению Клаб на 59,6% (р=0,022) и 33,4% (р=0,005) соответственно относительно серий сравнения, что свидетельствует о стабилизации мембраны. Данный вывод совпадает с результатами других авторов [6, 9]. При этом, увеличение времени инкубации до 4-х часов привело к возрастанию Клаб кислой фосфатазы на 33,2% (р=0,005), что можно трактовать как повреждение лизосомальной мембраны (табл. 1).

 

Таблица 1. Влияние 5 мМ L-карнитина на значение показателя Клаб, %

Фермент	Продолжительность инкубации
	1 час		2 часа		4 часа
	Сахароза	Карнитин	Сахароза	Карнитин	Сахароза	Карнитин
	37,26	74,87	64,09	84,12	10,83	62,45*
Катепсин В	[0;	[70,76;	[13,74;	[76,18;	[6,69;	[45,19;
	75,64]	78,00]	78,81]	91,42]	13,25]	91,46]
	33,34	37,13	42,85	79,38°	16,85	55,43*
Катепсин L	[32,98;	[30,88;	[14,65;	[75,36;	[11,6;	[53,34;
	39,09]	40,20]	82,17]	83,19]	20,56]	62,10]
	37,35	86,24*	59,07	68,44*	50,56	94,75*х
Катепсин H	[22,20;	[79,46;	[55,16;	[65,76;	[38,27;	[92,45;
	37,38]	97,45]	62,58]	70,42]	54,43]	96,97]
Кислая фосфатаза	23,54 [16,23; 27,02]	9,52* [7,18; 12,03]	27,12 [26,35; 28,80]	18,06*° [16,95; 19,26]	27,62 [24,13; 30,22]	41,35*х° [38,64; 42,71]

Примечание: * - статистически значимые (р<0,05) отличия от групп контроля с соответствующей продолжительностью инкубации, - статистически значимые (р< 0,05) отличия от 1 часа инкубации, х - статистически значимые (р<0,05) отличия от 2-х часов инкубации.

 

При исследовании воздействия карнитина на активность ЛЦП in vitro обнаружен рост ОА на 73,2% (р=0,008) катепсина B за счет роста активности в НСФ на 76,8% (р=0,008) в течение одного часа инкубации (табл. 2). Аналогичные изменения наблюдались в ОА катепсина L при двух- и четырехчасовой инкубации: на 77,7% (р=0,005) и 42,3% (р=0,013) соответственно. Можно предположить, что L-карнитин способствует активации катепсинов из их предшественников или высвобождению их из комплекса с ингибиторами. В литературе имеются сведения о проапоптогенном действии карнитина [8]. Одним из возможных механизмов развития данного явления может оказаться способность карнитина повышать активность катепсинов В и L, для которых описано участие в запуске опосредованной клеточной гибели [5]. При этом, при одно-и двухчасовой инкубации исследуемые ферменты переходят во внелизосомальную фракцию не за счет повреждения мембраны, а видимо, за счет повышения её избирательной проницаемости.

В отношении катепсина Н наблюдалась другая картина: прямое воздействие 5 мМ карнитина приводило к снижению ОА: при одночасовой инкубации на 200,0% (р=0,008) за счет падения активности фермента в СФ на 87,0% (р=0,008), при двухчасовой инкубации - на 67,9% (р=0,05) за счет падения активности фермента в СФ на 79,0% (р=0,005) и при четырехчасовой инкубации - на 27,1% (р=0,02) за счет падения активности фермента в СФ на 95,1% (р=0,005) относительно соответствующих серий сравнения. Аналогичные изменения в отношении катепсина Н карнитин вызывал у крыс в in vivo эксперименте [9]. Также наблюдалось повышение избирательной проницаемости мембраны для данного фермента при одно- и двухчасовой инкубации.

Статистически значимое нарастание значение Клаб для всех изучаемых катеп-синов при четырехчасовой инкубации может объясняться повреждением лизосомальной мембраны.

При исследовании влияния карнитина на изучаемые показатели в зависимости от продолжительности воздействия обнаружено, что основные изменения касаются распределения ферментов между вне- и внутрилизосомальной фракциями. Так, после 2-х часов инкубации в среде, содержащей 5 мМ L-карнитин, наблюдалось статистически значимое увеличение НСА катепсина L на 43,2% (р=0,02) и снижение СА на 71,1% (р=0,02) относительно 1-го часа инкубации (рис. 1), однако удлинение времени воздействия до 4-х часов не приводило к усугублению описываемых эффектов. Для кислой фосфатазы по мере увеличения времени инкубации (1, 2 и 4 часа) наблюдался рост НСА фермента и падение СА (рис. 2). Также с течением времени наблюдалось увеличение Клаб по кислой фосфатазе (табл. 1). В отношении катепсинов В и Н статистически значимых изменений активности и распределения во временном аспекте выявлено не было.

 

Выводы

1. Карнитин в концентрации 5 мМ вызывает статистически значимый рост общей активности катепсинов B и L и снижение общей активности катепсина Н при  in vitro -инкубации лизосом печени крыс.
2. Инкубация в 5 мМ растворе L-карнитина приводит к росту неседименти-руемой активности и падению седименти-руемой активности для катепсина L при двухчасовом, а для кислой фосфатазы - при двух- и четырехчасовом воздействии.
3. При одно- и двухчасовой инкубации L-карнитин в концентрации 5 мМ стабилизирует лизосомальную мембрану, однако увеличение времени инкубации до 4-х часов приводит к её повреждению.
4. 5 мМ L-карнитин повышает избирательную проницаемость лизосомальной мембраны для исследуемых катепсинов, в наибольшей степени - для катепсина Н.

Конфликт интересов отсутствует

About the authors

M A. Fomina

Ryazan State Medical University

Author for correspondence.
Email: anyakudlaeva@mail.ru
Ph Russian Federation

A M. Kudlaeva

Ryazan State Medical University

Email: anyakudlaeva@mail.ru
ассистент кафедры биологической химии Russian Federation

A N. Ryabkov

Ryazan State Medical University

Email: anyakudlaeva@mail.ru
Ph Russian Federation

References

Supplementary files