Сравнительный анализ аномалий кариотипа при неразвивающейся беременности, наступившей естественным путем и с применением вспомогательных репродуктивных технологий
- Авторы: Чиряева О.Г.1, Пендина А.А.1, Тихонов А.В.2, Ефимова О.А.3, Петрова Л.И.1, Дудкина В.С.4, Садик Н.А.4, Кузнецова Т.В.1, Баранов В.С.1, Галембо И.А.2
-
Учреждения:
- ФГБУ «НИИАГ им. Д. О. Отта» СЗО РАМН
- ФГБУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет»
- ФГБУ «НИИ АГ им. Д. О. Отта» СЗО РАМН
- СПбГКУЗ «Диагностический центр (медико-генетический)»
- Выпуск: Том 61, № 3 (2012)
- Страницы: 132-140
- Раздел: Статьи
- Статья получена: 15.06.2012
- Статья опубликована: 15.06.2012
- URL: https://journals.eco-vector.com/jowd/article/view/1297
- DOI: https://doi.org/10.17816/JOWD613132-140
- ID: 1297
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Полный текст
Введение Неразвивающаяся беременность (НБ) представляет собой серьезную проблему в акушерско-гинекологической практике. Для неразвивающейся беременности характерно довольно длительное скрытое течение, что в значительной мере затрудняет ее своевременную диагностику. Показано, что 12–20 % всех клинически установленных беременностей, завершаются самопроизвольным выкидышем [27]. Существует множество причин невынашивания беременности: анатомические аномалии, воспалительные процессы, гормональные изменения, нарушения в системе свертывания крови, носительство родителями сбалансированных хромосомных перестроек, влияние эмбриотоксических и тератогенных веществ [26]. Без сомнения, фундаментальную роль среди факторов, приводящих к остановке развития беременности в первом триместре, играют аномалии кариотипа плода. По обобщенным данным до 10 недели развития частота хромосомных аномалий у самопроизвольных выкидышей составляет 60–70 % [9, 14, 16]. Такие исследования не теряют своей актуальности в связи с их диагностической и практической значимостью. Особый интерес представляет частота и спектр хромосомных аномалий плода при неразвивающейся беременности, наступившей с применением вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), широко применяемых в последнее время. Данные о частоте хромосомных аномалий, обнаруженных при остановке развития беременностей, наступивших с применением ВРТ по сравнению с таковыми при естественных беременностях, противоречивы. Так, в отдельных случаях частота первых превышала таковую при естественно наступившей беременности, а других — напротив, была ниже [13, 15, 17, 27]. В связи с этим целью настоящего исследования было сравнительное изучение частоты и спектра аномалий кариотипа при неразвивающейся беременности, наступившей естественным путем и с применением вспомогательных репродуктивных технологий. Материал и методы В период с мая 2007 года по декабрь 2011 года из различных акушерско-гинекологических стационаров Санкт-Петербурга в лабораторию поступили образцы абортного материала от 679 женщин с диагнозом неразвивающаяся беременность. В 558 случаях остановка развития плода произошла при беременности, наступившей естественным путем, в 121 случае — с применением ВРТ. Срок беременности и характер нарушений эмбрионального развития определялись ультразвуковыми методами специалистами лечебно-профилактических учреждений. Операционный материал был представлен фрагментами плодного яйца, хориона и децидуальных оболочек, доставленных в течение 2–4 часов после операции в физиологическом растворе. Для всех случаев известна информация о возрасте матери, сроке беременности, характере нарушения развития и анамнезе пациентки, за исключением 46 случаев беременностей, полученных с помощью ВРТ, для которых анамнестические данные отсутствуют. Препараты метафазных хромосом получали из клеток цитотрофобласта ворсинчатого хориона ускоренным «прямым» методом. Окрашивание хромосом проводили с использованием флуорохрома Hoechst 33258 с контрастированием актиномицином D. Препараты анализировали с помощью микроскопа LEICA DM LS, оснащенного цветной камерой Leica DFC 320. При кариотипировании руководствовались правилами, рекомендованными для цитогенетических исследований в учреждениях медико-генетической службы. Статистическую обработку данных проводили с использованием статистического пакета программ GraphPad Prizm 4. Для анализа различий в структуре групп использовали критерий χ 2. Для оценки различий между группами использовали t-тест для независимых выборок. Результаты и обсуждение Проведен сравнительный анализ частоты и спектра аномалий кариотипа в абортном материале пациенток, беременность которых наступила естественным путем (группа I) или с помощью ВРТ (группа II). Группу пациенток с естественно наступившей беременностью составили 558 человек, группу сравнения — 121 человек. Структура исследованных выборок с учетом возраста пациентки и срока беременности представлена в таблице 1. Возраст женщин обеих групп варьировал от 18 до 53 лет. В группе I наибольшее число исследованных случаев пришлось на возрастной период с 25 до 39 лет, в то время как в группе II — с 30 до 39 лет (таблица 1). Средний возраст в группе I составил 30,82 ± 5,49 и был меньше, чем в группе II — 34,33 ± 5,57 (t-тест, p < 0,05). Выявленные различия, вероятно, обусловлены предпочтительным обращением в клиники ВРТ женщин более старшего возраста. В обеих группах большинство случаев НБ было зарегистрировано в период с 6 по 10 неделю (табл. 1). Срок остановки развития беременности варьировал от 3 до 20 недель, при этом средний срок не отличался между группами I и II и составлял 7,35 ± 2,19 и 6,80 ± 1,66 соответственно (в среднем — 7,26 ± 2,11). Согласно данным других исследователей средний срок остановки развития был несколько больше и приближался к 10 неделям как в группе женщин, беременность которых наступила естественным путем, так и у женщин после применения ВРТ [11, 17]. Полученные результаты служат наглядной иллюстрацией тому, что период, соответствующий плацентации, нейруляции и началу активного органогенеза, является критическим для эмбрионального развития человека [1, 2]. Стандартное кариотипирование позволило установить аномальный кариотип в 63,6 % случаев суммарно в группах I и II. В группе I аномалии кариотипа были выявлены в 371 случае из 558 (66,5 %), а в группе II — в 61 случае из 121 (50,4 %). Доля аномальных кариотипов оказалась выше в группе I (χ2 для таблиц сопряженности 2 × 2, p < 0,001), что вызывает определенное удивление. Преобладание нормальных кариотипов, выявленных при беременности наступившей с помощью ВРТ, было описано и другими авторами. Однако, в ряде работ была отмечена обратная тенденция [11, 17, 29, 25]. В связи с этим представлялось целесообразным проанализировать частоту хромосомных патологий в разных возрастных группах пациенток. Для этого каждая из групп I и II была разделена на 2 подгруппы с учетом возраста пациенток — до 35 лет и старше. В подгруппе пациенток до 35 лет, беременность которых наступила естественным путем, доля аномальных кариотипов была выше, чем в той же возрастной подгруппе пациенток клиники ВРТ (χ2 для таблиц сопряженности 2 × 2, p < 0,001). При сравнении подгрупп пациенток старше 35 лет различий между группами I и II не обнаружено. В группе I в обеих подгруппах было показано преобладание аномальных кариотипов над нормальными. В то время как, в группе II до 35 лет было выявлено преобладание нормальных кариотипов, а после 35 лет — аномальных (рис. 1). Таким образом, ведущим фактором остановки развития беременности в группе до 35 лет пациенток клиник ВРТ, являются не аномалии кариотипа, а иные причины: воспалительные процессы, анатомические аномалии, гормональные изменения, нарушения в системе свертывания крови и другие факторы неблагоприятного соматического статуса женщины. Именно эти нарушения в большинстве случаев являются причиной невозможности наступления беременности естественным путем и обращения в клиники ВРТ. В то же время, доминирующим фактором остановки развития беременности в обеих группах после 35 лет становятся хромосомные аномалии плода, возникшие по причине нарушений расхождения хромосом в гаметогенезе, прогрессирующих с возрастом матери. Частота спонтанных геномных и хромосомных мутаций у плода коррелирует со сроком остановки развития беременности. Известно, что чем раньше остановилось развитие зародыша, тем больше вероятность обнаружения у него хромосомной патологии [12, 21]. Однако, в нашем исследовании в группе II при остановке развития на сроке менее 7 недель число аномальных кариотипов было меньше (45,6 %), чем нормальных (54,4 %), в то время как в группе I на этом сроке число аномальных кариотипов (66,2 %) практически в 2 раза превышало число нормальных (33,8 %). В период с 7 по 12 неделю развития в группе I процентное отношение сохранилось, при этом в группе II оно изменилось в сторону увеличения аномальных кариотипов (57,7 % против 42,3 %) (рис. 2). Преобладание нормальных кариотипов над аномальными в группе II на сроке до 7 недель, противоречит многочисленным известным данным [11, 17]. Наши результаты свидетельствуют, о том, что на более ранних сроках остановка развития беременности, наступившей с помощью ВРТ, происходит не по причине хромосомной патологии, роль которой становится лидирующей после 7 недели развития. Вероятнее всего, на сроке развития до 7 недель решающее значение приобретают непреодолимые патофизиологические процессы и анатомические аномалии женщин. Не исключено также, что невозможность развития плода обусловлена ошибками эпигенетического репрограммирования его генома. Репрограммирование генома — глобальное изменение эпигенетического статуса, происходящее в онтогенезе человека дважды: в процессе дифференцировки половых клеток и затем в доимлантационном развитии [18, 24]. В результате репрограммирования в геноме устанавливаются специфические для разных типов клеток эпигенетические паттерны, необходимые для их корректного функционирования [3, 4, 5, 6]. Существует мнение, что применение ВРТ повышает риск возникновения эпигенетических аномалий у эмбрионов, в том числе связанных с нарушениями геномного импринтинга [22]. В то же время, благодаря назначению поддерживающей гормональной терапии и тщательному мониторингу беременности, полученной с помощью ВРТ, плоды с аномалиями кариотипа развиваются до более поздних сроков, чем при естественной беременности. Из анамнеза 558 пациенток группы I и 76 группы II было известно общее число беременностей и число неразвивающихся беременностей. На основании этих данных была проанализирована доля неразвивающихся беременностей от общего числа беременностей для каждой пациентки обеих групп. В этом анализе не были учтены пациентки, у которых была зарегистрирована одна беременность, которая оказалась неразвивающейся. В группе I процент пациенток, в анамнезе которых половина и более беременностей были неразвивающимися, составил 76,63 %, в группе II — 69,05 %. Подробные данные для пациенток групп I и II представлены на рис 3. При этом все беременности были неразвивающимися у 26,36 % женщин в группе I и у 21,43 % женщин в группе II. Таким образом, большинство пациенток обеих групп страдали привычным невынашиванием. Причинами привычного невынашивания могли быть как ненаследственные факторы — анатомические аномалии матки, эндокринные нарушения и аутоиммунные заболевания, неблагоприятный соматический статус — так и наследственные: носительство родителями хромосомных перестроек, генные болезни и наследственная предрасположенность [2, 20]. В последнее время пристальное внимание уделяется семейному анализу проблем привычного невынашивания. У родственников пациентов с привычным невынашиванием I, II и III степени родства неразвивающаяся беременность была выявлена в 2–3 раза чаще, чем в среднем в популяции [23]. Полногеномный анализ позволил выявить в таких семьях критические локусы, ассоциированные с привычным невынашиванием: 3p14.2, 6q16.3, 6q27, 9p22.1, 9q33.1, 11q13.4, Xp22.11 [10; 19]. Таким образом, при оценке риска остановки развития беременности важно учитывать наследственную предрасположенность к привычному невынашиванию. Аномалии кариотипа, выявленные в хорионе при неразвивающейся беременности, четко дифференцируются по их значимости для раннего эмбрионального развития. Причинами остановки развития плодов с аномальным кариотипом могут служить как нарушения собственно формирования эмбриона, так и патология процесса плацентации. При культивировании клеток плаценты с аномальным кариотипом, их деление происходит гораздо медленнее, чем с нормальным кариотипом. При этом возникает резкая десинхронизация процессов развития зародыша и плаценты. Недостаточное и запоздалое формирование плаценты приводит к нарушению трофики и гипоксии эмбриона, а также к снижению гормональной продукции плацентой [7]. Анализ спектра патологий кариотипа позволил установить, что преобладающим типом нарушения являются трисомии: в группе I — 44,3 %, в группе II — 36,9 %. В таблице 2 и на рис. 4 представлены данные по всему спектру выявленных хромосомных нарушений. В группе I трисомии были зарегистрированы по всем хромосомам набора за исключением хромосом 5, 17 и 18. В группе II не найдены трисомии по хромосомам 1, 3, 4, 5, 9, 14, 17, 18, 19, что может быть связано с низкой вероятностью их выявления в небольших выборках по причине их редкой встречаемости. Как и в других исследованиях [8, 16, 17], в нашей работе в обеих группах чаще других в простые трисомии вовлекались хромосомы 16 (13,8 % в группе I и 9,9 % в группе II), 22 (5 % в группе I и 4,9 % в группе II), 15 (3,6 % в группе I и 5,8 % в группе II), 21 (3,2 % в группе I и 2,5 % в группе II) и 13 (3 % в группе I и 3,3 % в группе II). Второй по численности аномалией кариотипа в группе I оказалась триплоидия (10,2 %). Триплоидия возникает примерно в 80 % случаев как результат диандрии (удвоение отцовского генома) или диспермии (оплодотворение 2 сперматозоидами), а в остальных случаях — как результат дигинии (удвоение женского генома) [7]. Обращает на себя внимание практически полное отсутствие этой патологии в группе II (всего 1 случай — 0,2 %). Это является следствием искусственного отбора эмбрионов с тремя пронуклеусами на стадии одной клетки при процедуре ЭКО. Следующей по численности патологией является моносомия Х, процент которой в обеих группах был сопоставим (0,4 % в группе I и 0,3 % в группе II), что хорошо согласуется с данными других авторов [30]. Также в группе I был обнаружен единичный случай моносомии по хромосоме 21. В обеих группах выявленные хромосомные мутации были представлены несбалансированными перестройками аутосом (производные, делеции, изохромосомы, кольцевые хромосомы), в отдельных случаях сочетающимися с геномными мутациями, а также маркерными хромосомами (3,4 % в группе I и 4,1 % в группе II). Таким образом, спектры хромосомных нарушений у плодов групп I и II не отличался, за исключением практически полного отсутствия триплоидии в группе II (рис. 4). Числовые и структурные изменения кариотипа в абортном материале были проанализированы с учетом возраста пациенток. В группе I при нормальном кариотипе плода средний возраст пациенток практически не отличался от среднего группы (29,76 ± 4,86 лет и 30,82 ± 5,49 лет, соответственно), в то время как в группе II он был несколько ниже, чем средний в группе (32,65 ± 5,29 и 34,33 ± 5,57 лет соответственно). В случае наличия трисомий у плода, возраст пациенток оказался повышенным как в группе I (32,36 ± 5,78 лет), так и в группе II (36,94 ± 5,11 лет) относительно среднего по группам, что соответствует данным других авторов, указывающих на увеличение вероятности возникновения трисомий у плода с возрастом матери [12, 21]. В случае выявления у плода полиплоидии, моносомии Х, структурных перестроек и сочетанной хромосомной патологии возраст матери был несколько ниже, как в группе I, так и в группе II, что подтверждает меньшую зависимость этой патологии от возраста (табл. 2). Таким образом, аномалиям кариотипа принадлежит доминирующее значение в этиологии неразвивающейся беременности ранних сроков, возникшей как естественным путем, так и с помощью ВРТ у пациенток после 35 лет. Частота и спектр аномалий кариотипа не отличаются в двух сравниваемых группах, что может свидетельствовать о том, что способ получения беременности сам по себе не является фактором риска возникновения хромосомной патологии у плода. Следует отметить, что в группе пациенток младше 35 лет, обратившихся в клиники ЭКО, ведущим фактором остановки развития беременности является неблагоприятный соматический статус женщины. Этот феномен наиболее ярко проявляется на сроках беременности до 7 недель, когда в абортном материале регистрируется преобладание нормальных кариотипов над аномальными.Об авторах
Ольга Гавриловна Чиряева
ФГБУ «НИИАГ им. Д. О. Отта» СЗО РАМНврач-лаборант генетик, к. б. н.
Анна Андреевна Пендина
ФГБУ «НИИАГ им. Д. О. Отта» СЗО РАМНврач-лаборант генетик, к. б. н.
Андрей Владимирович Тихонов
ФГБУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет»студент
Ольга Алексеевна Ефимова
ФГБУ «НИИ АГ им. Д. О. Отта» СЗО РАМНнаучный сотрудник, ФГБУ «НИИ АГ им. Д. О. Отта» СЗО РАМН; СПбГКУЗ «Диагностический центр (медико-генетический)»; ФГБУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет»
Любовь Ивановна Петрова
ФГБУ «НИИАГ им. Д. О. Отта» СЗО РАМНврач-лаборант генетик
Вера Святославовна Дудкина
СПбГКУЗ «Диагностический центр (медико-генетический)»врач-лаборант генетик
Наталия Александровна Садик
СПбГКУЗ «Диагностический центр (медико-генетический)»врач-лаборант генетик
Татьяна Владимировна Кузнецова
ФГБУ «НИИАГ им. Д. О. Отта» СЗО РАМНведущий научный сотрудник, д. б. н., ФГБУ «НИИАГ им. Д. О. Отта» СЗО РАМН; СПбГКУЗ «Диагностический центр (медико-генетический)»; ФГБУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет»
Владислав Сергеевич Баранов
ФГБУ «НИИАГ им. Д. О. Отта» СЗО РАМНзаведующий лабораторией пренатальной диагностики наследственных и врожденных заболеваний человека, член-корр. РАМН, з. д. н., д. м. н., проф., ФГБУ «НИИАГ им. Д. О. Отта» СЗО РАМН; ФГБУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет»
Илона Александровна Галембо
ФГБУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет»студент
Список литературы
- Айламазян Э. К., Баранов В. С. Пренатальная диагностика наследственных и врожденных болезней. — М.: МЕДпресс-инфом, 2006. — 416 с.
- Баранов В. С., Кузнецова Т. В. Цитогенетика эмбрионального развития человека. — СПб.: Н-Л, 2007. — 640 с.
- Дифференциальное метилирование ДНК метафазных хромосом — основа нового способа окраски хромосом человека в пре- и постнатальный периоды онтогенеза / Ефимова О. А. [и др.] // Современные технологии профилактики наследственных болезней и детской инвалидности: к 40-летию медико-генетического центра / ред. Романенко О. П. — СПб.: Феникс, 2009. — C. 143–149.
- Иммуноцитохимический анализ статуса метилирования метафазных хромосом человека / Пендина А. А. [и др.] // Цитология. — 2005. — Т. 47, № 8. — C. 731–737.
- Метилирование ДНК — универсальный механизм регуляции активности генов / Пендина А. А. [и др.] // Экологическая генетика. — 2004. — Т. 1 (II). — С. 27–37.
- Некоторые особенности статуса метилирования метафазных хромосом у зародышей человека доимплантационных стадий развития / Баранов В. С. [и др.] // Цитология. — 2005. — Т. 47, № 8. — С. 723–730
- Радзинский В. Е., Димитрова В. И., Майскова И. Ю. Неразвивающаяся беременность. — М.: Гэотар-Медиа, 2009. — 200 с.
- Цитогенетический анализ хориона при неразвивающейся беременности / Чиряева О. Г. [и др.] // Журнал акушерства и женских болезней. — 2007. — Т. LVI, № 1. — С. 35–45.
- A cytogenetic study of 1000 spontaneous abortions / Hassold T. [et al.] // Ann. Hum. Genet. — 1980. — Vol. 44, pt. 2. — P. 151–178.
- A genome-wide scan in affected sibling pairs with idiopathic recurrent miscarriage suggests genetic linkage / Kolte A. M. [et al.] // Mol. Hum. Reprod. — 2011. — Vol. 6. — P. 379–385.
- Aneuploidy rates in failed pregnancies following assisted reproductive technology / Nayak S. [et al.] // J. Womens. Health. — 2011. — Vol. 20, N 8. — P. 1239–1243.
- Basal follicle-stimulating hormone as a predictor of fetal aneuploidy / Massie J. A. [et al.] // Fertil. Steril. — 2008. — Vol. 90. — P. 2351–2355.
- Bettio D., Venci A., Levi Setti P. E. Chromosomal abnormalities in miscarriages after different assisted reproduction procedures // Placenta. — 2008. — Vol. 29. — P. 126–128.
- Boue J., Boue A., Lazar P. Retrospective epidemiological studies of 1500 karyotyped spontaneous human abortions // Teratology. — 1975. — Vol. 12. — P. 11–26.
- Chromosomal abnormalities in spontaneous abortion after assisted reproductive treatment / Kim J. W. [et al.] // BMC Med. Genet. — 2010. — Vol. 3 (11). — P. 153.
- Chromosome abnormalities identified in 347 spontaneous abortions collected in Japan / Nagaishi M. [et al.] // J. Obstet. Gynaecol. Res. — 2004. — Vol. 30. — P. 237–241.
- Cytogenetic analysis of early nonviable pregnancies after assisted reproduction treatment / Martinez M. C. [et al.] // Fertil. Steril. — 2010. — Vol. 93, N 1. — P. 289–292.
- DNA methylation patterns of metaphase chromosomes in human preimplantation embryos / Pendina A. A. [et al.] // Cytogenetic and Genome Research. — 2011. — Vol. 132, N 1–2. — P. 1–7.
- Genome-wide screening for risk loci of idiopathic recurrent miscarriage in a Han Chinese population: a pilot study / Wang L. [et al.] // Reprod. Sci. — 2010. — Vol. 6. — P. 578–584.
- Hassold T. J. A cytogenetic study of repeated spontaneous abortions // Am. J. Hum. Genet. — 1980. — Vol. 32, N 5. — P. 723–730.
- Hassold T., Hunt P. Maternal age and chromosomally abnormal pregnancies: what we know and what we wish we knew // Curr. Opin. Pediatr. — 2009. — Vol. 21. — P. 703–708.
- Influence of spermatogenic profile and meiotic abnormalities on reproductive outcome of infertile patients / Barri P. N. [et al.] // Reprod. Biomed. Online. — 2005. — Vol. 6. — P. 735–739.
- Positive reproductive family history for spontaneous abortion: predictor for recurrent miscarriage in young couples / Miskovic S. [et al.] // Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. — 2012. — Vol.161, N 2. — P. 182–186.
- Reik W. Stability and flexibility of epigenetic gene regulation in mammalian Development // Nature. — 2007. — Vol. 447, N 7143. — P. 425–432.
- Reproductive counseling in patients who have had a spontaneous abortion / Poland B. J. [et al.] // Am J Obstet Gynecol. — 1977. — Vol. 127. — P. 685–691.
- Selective karyotyping in recurrent miscarriage: are recommended guidelines adopted in daily clinical practice? / Boogaard E. [et al.] // Hum. Reprod. — 2011. — Vol. 8. — P. 1965–1970.
- Sperm DNA damage is associated with an increased risk of pregnancy loss after IVF and ICSI: systematic review and meta-analysis / Zini A. [et al.] // Hum. Reprod. — 2008. — Vol. 23, N 12. — P. 2663–2668.
- Spontaneous abortion rates after natural and assisted conception / Steer C. [et al.] // Br. Med. J. — 1989. — Vol. 299, N 6711. — P. 1317–1318.
- The effects of age on the incidence of aneuploidy rates in spermatozoa of oligoasthenozoospermic patients and its relationship with ICSI outcome / Plastira K. [et al.] // Int. J. Androl. — 2007. — Vol. 30, N 2. — P. 65–72.
- Warburton D. Biological aging and the etiology of aneuploidy // Cytogenet. Genome Res. — 2005. — Vol. 111 — P. 266–272.