Цитокины и факторы роста как маркеры имплантационной способности эндометрия в циклах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО)

Полный текст

Сокращения ЭКО — экстракорпоральное оплодотворение LIF — лейкемия ингибирующий фактор IL — интерлейкин GM–CSF — гранулоцитарно-макрофагальный фактор роста М–CSF — макрофагальный фактор роста G-CSF — гранулоцитарный фактор роста VEGF — сосудистый эпителиальный фактор роста TGF — трансформирующий фактор роста HB-EGF — гепарин-связывающий фактор роста IGF — инсулиноподобный фактор роста EGF — эпидермальный фактор роста Th — T хелперы Treg — T регуляторные клетки IFN — интерферон TNF — фактор некроза опухоли LIFR — рецептор лейкемии ингибирующего фактора r-hLIF — рекомбинантная форма человеческого лейкемия ингибирующего фактора Е2 — эстрадиол Р — прогестерон NK — натуральные киллеры IGFBP-1 — протеин, связывающий инсулиноподобный фактор роста-1 TGFβ1R — рецептор трансформирующего фактора роста β1 Самым эффективным методом лечения бесплодия является экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО), результативность которого в лучших центрах мира колеблется от 21,1 % до 47,9 % [11]. Отсутствие имплантации в циклах ЭКО является одной из основных проблем современной репродуктологии. В связи с чем, с целью повышения результативности циклов ЭКО, в последние годы, особое внимание уделяется изучению «окна имплантации» и процессам, происходящим между рецепторным аппаратом эндометрия и бластоцистой. Этот период приходится на 7–10 день после овуляции и соответствует 21–24 дню естественного 28-дневного менструального цикла [53, 59] или наступает на 1–2 дня раньше в циклах стимуляции овуляции [60]. Эндометрий в это время становится наиболее восприимчивым к имплантации бластоцисты. Продолжительность предполагаемого «окна имплантации» составляет около 48 часов и, в первую очередь, определяется половыми стероидами, которые регулируют экспрессию локально действующих цитокинов, хемокинов, факторов роста и транскрипции [74, 75]. Несомненно, большое значение имеет адекватно функционирующая иммунная система матери в целом и, особенно, в период окна имплантации. Определение оптимального времени максимальной рецептивности эндометрия для проведения переноса эмбрионов в полость матки являлось целью исследования большого числа публикаций за последние 2 десятилетия [31, 66, 70, 82]. В связи с этим изучен широкий спектр иммунокомпетентных клеток и секретируемых ими регуляторных веществ, участвующих в процессе имплантации. Однако, на сегодняшний день, нет единого мнения о ценности определения тех или иных цитокинов и факторов роста в качестве предиктивного критерия рецептивности эндометрия, поэтому поиски в данном направлении активно продолжаются. В настоящем обзоре рассмотрены данные о функциональной роли основных цитокинов и факторов роста, которые участвуют в регуляции дифференцировки, адгезии и инвазии трофобласта, а также методы определения данных маркеров для прогнозирования исходов циклов ЭКО. Процесс имплантации Согласно современным представлениям процесс имплантации делится на три взаимосвязанных и условно выделяемых фазы. Аппозиция — определяется как неустойчивая адгезия бластоцисты к поверхности эндометрия и проявляется началом "диалога" между бластоцистой и рецептивным эндометрием посредством локального действия гормонов, паракринных регуляторов: ряда цитокинов (LIF, IL-1, IL-6), факторов роста (GM–CSF, VEGF, TGF, HB-EGF, IGF), простагландинов [6, 44]. Второй этап — фаза стабильной адгезии, которая проявляется усилением функциональных взаимосвязей между эпителием трофобласта и поверхностным эпителием эндометрия посредством местных паракринных сигналов (молекулы адгезии). Имплантация завершается инвазией трофобласта через просвет эпителия и базальный слой эндометрия в строму, для установления сосудистого контакта с организмом матери. В ответ на продолжающееся действие прогестерона и инвазию бластоцисты клетки стромы и экстрацеллюлярного матрикса подвергаются децидуализации. Маркеры имплантационной способности эндометрия Эндометриальные факторы имеют немаловажное значение в процессе имплантации, где они выступают в качестве медиаторов между эмбрионом и эндометрием на всех ее этапах. Первый контакт эмбриона после его попадания в полость матки происходит с эпителиальными клетками эндометрия. Влияние эндометрия на развитие эмбриона, уже на ранних этапах его развития, отметили еще в 1998 году, Barmat LI, и соавт. Авторы заметили, что со-культивирование эмбрионов с аутологическими клетками эндометрия стимулирует рост эмбрионов и улучшает их качество [40]. Далее было установлено, что эпителиальные клетки эндометрия секретируют в полость матки целый ряд биологически активных молекул, которые влияют на эмбрион, эндометрий, на процесс слияния эмбриона с эндометрием, а так же на дальнейшее развитие беременности. Однако, точная роль этих факторов и механизмы их молекулярных взаимодействий у человека не до конца изучены. Текущее понимание этих механизмов складывается, в основном, из экспериментальных работ [82]. Признаки имплантационной способности эндометрия были впервые выявлены в опытах на крысах [67]. В литературе описано множество методик оценки степени созревания эндометрия и его готовности к имплантации [75]. Однако наиболее широко используемым остается метод, предложенный Noyes и соавторами в 1950 г, определившим степень зрелости эндометрия исходя из его морфологических критериев [55]. Считается, что наиболее значимым морфологическим маркером имплантационной способности эндометрия являются эндометриальные пиноподии, развитая форма которых выявляется методом сканирующей электронной микроскопии в среднем на 20-й и 22-й дни цикла [53] и на 18–20-й день в циклах стимуляции суперовуляции яичников в программе ЭКО [13.60]. Неоднократно продемонстрировано in vitro, что имплантация эмбриона происходит путем образования контакта между клетками трофобласта и эпителиальными клетками эндометрия несущими пиноподии [13, 60]. Большинство авторов выявили существенную корреляционную связь между числом пиноподий и успешной имплантацией после переноса эмбрионов, однако фазологическое значение пиноподий не вполне понятно. В то же время большой интерес уделяется исследованию иммунологических факторов, активно участвующих в репродуктивном процессе — цитокинам, хемокинам, факторам роста и транскрипции, молекулам адгезии, металлопротеиназам и др. В многочисленных работах доказано, что иммунная система имеет тесную функциональную взаимосвязь с репродуктивным процессом и играет важную роль в этиологии бесплодия [9, 19, 58]. Наличие исходных иммунных дисфункций в системе цитокинов может быть серьёзной причиной нарушения имплантации и неправильного развития плаценты, и в конечном итоге, отсутствия или потери беременности [74]. Выявление ряда цитокинов и их рецепторов, в период имплантационного окна, в тканях эндометрия: в децидуальной ткани, на поверхности эндометрия и трофобласта доказывает их несомненную роль в регуляции ключевых процессов имплантации эмбриона [21, 82]. С целью оценке рецептивности эндометрия, большинство работ были выполнены с применением инвазивных методов исследования, так как эти методы считаются максимально информативными [53, 63]. При этом надо отметить их травматичность для эндометрия. В циклах ЭКО отсутствует возможность определения рецептивности эндометрия инвазивными методами, так как перенос эмбрионов должен проводиться на интактный эндометрий и по этой причине на сегодняшний день приобретают популярность неинвазивные методы оценки рецептивности эндометрия [3, 24, 28, 42, 58, 66, 79]. Авторы оценивали имплантационную способность эндометрия с использованием ультразвукового метода исследования, генетическими методами, а так же путем определения содержание гормонов, ряда цитокинов и факторов роста (IL-6, IL-10, LIF, TGFβ1, TGFβ2, EGF, M–CSF, GM–CSF, HB-EGF, VEGF и др.) в различных биологических жидкостях (венозная кровь, смывы из полости матки, цервикальная слизь). При этом были получены противоречивые результаты. Использование цитокинов в качестве скриннингового критерия рецептивности эндометрия в циклах ЭКО представляется перспективным как с медицинской, так и с экономической точки зрения, учитывая доступность их определения в различных биологических жидкостях (кровь, смывы из полости матки, цервикальная слизь), непосредственно в протоколах стимуляции суперовуляции [10, 24, 34, 58]. Цитокины и факторы роста Цитокины являются многофункциональными водорастворимыми гликопротеинами. В мембранной форме цитокины обладают полным спектром биологической активности, проявляя свое биологическое действие при межклеточном контакте посредством специфических и неспецифических рецепторов, находящихся на поверхности клеток мишеней) [26]. По мнению Симбирцева А. С. 2002, цитокины можно выделить в отдельную самостоятельную систему регуляции функций организма, существующую наряду с нервной и эндокринной системой [1]. Цитокины и факторы роста синтезируются во всех органах человека, включая органы репродуктивной системы и ткани эмбриона [69]. У человека цитокины и факторы роста, участвующие в процессе имплантации, выделяются местно сромально-соединительными клетками (фибробласты, децидуальные клетки, ламинальный эпителий и эпителий желез), клетками трофобласта и некоторыми клетками иммунной системы (лимфоциты, моноциты, макрофаги), а так же мигрируют из системного кровотока и участвуют в регуляции толерантности иммунной системы во время имплантации и на протяжении беременности. В связи, с чем преобладание тех или иных цитокинов определяет тип иммунной реакции. Под действием прогестерона в эндометрии происходит активация выработки иммунокомпетентными клетками целого ряда цитокинов (IL-4, IL-5, IL-10, IL-17, LIF, M–CSF). В многочисленных работах доказано, что преобладание выработки цитокинов Тh-2 совместно с Treg клетками и снижение их выработки Тh-1 в сочетании с Th17 благоприятно влияют на процесс имплантации и на дальнейшее развитие беременности [42, 65]. Таким образом, на современном этапе для объяснения механизмов иммунной толерантности во время имплантации и в течение беременности применяется расширенная модель цитокиновой секреции: Th1/Th2/Th17 и регуляторные T (Treg) клетки для характеристики типа иммунной реакции [22]. Эндометриальные NK клетки также участвуют в выработке множества цитокинов, хемокинов и факторов роста участвующих в процессе инвазии (IFN-γ, IL-10, GM–CSF, LIF, TNF) [52] при этом они не оказывают цитотоксического действия на трофобласт, но дисбаланс выработки ими соответствующих цитокинов приводит к повторным репродуктивным потерям [30]. Попадание бластоцисты в полость матки в период окна имплантации индуцирует выработку ряда биологически активных веществ клетками трофобласта, эндотелиальными клетками эндометрия, а так же различными клетками иммунной системы присутствующими локально в месте имплантации или мигрирующими из общего кровотока, что приводит к изменению рецептивности эндометрия [7, 57]. При этом некоторые из них оказывают стимулирующее (факторы роста), другие ингибирующее действие (ингибины) и способность запускать процессы аппоптоза (Fas лиганд). [74]. В связи с чем, факторы роста, на сегодняшний день, определяют в самостоятельную группу. Их действие направлено на индукцию пролиферации и дифференцировку клеток, в том числе, клеток эндометрия. В литературе обсуждается роль многих цитокинов и факторов роста, участвующих в процессах имплантации. Наиболее значимыми из них в период «окна имплантации» являются: лейкемия ингибирующий фактор (LIF), сосудистый эпителиальный фактор роста (VEGF), гранулоцитарно-макрофагальный колонестимулирующий фактор роста (GM–CSF) и трансформирующий фактор роста (TGF). Одним из основных факторов регуляции процесса имплантации эмбриона является LIF (лейкемия ингибирующий фактор, leukemia inhibitory factor — LIF). Он относится к семейству IL-6. Максимальная экспрессия LIF и его рецептора LIFR в поверхностном и железистом эпителии эндометрия проявляется в период окна имплантации [32] и совпадает с появлением зрелых пиноподий [17]. Помимо поверхностных клеток эндометрия и эпителия желез доказано, что LIF так же вырабатывается децидуальной тканью и ворсинами хориона и может оказывать влияние на трофобласт [33]. Было убедительно продемонстрировано, что мутация в гене LIF у женщин приводит к снижению биологической активности этого цитокина в эндометрии и является причиной нарушения процесса имплантации, что может являться причиной репродуктивных потерь у женщин с необъяснимым бесплодием и эндометриозом [12, 50]. Добавление LIF в среды для культивирования ооцитов мышей и человека стимулирует рост клеток кумулюса, а так же улучшает развитие эмбрионов мышей и приводит к улучшению исходов ЭКО [51]. Позднее была подтверждена роль LIF в процессах адгезии и инвазии in vitro у животных [46] и в дальнейшем у человека [67]. Системное или вагинальное использование антагонистов данного цитокина в качестве иммунологического метода контрацепции успешно было продемонстрировано на животных рядом авторов [54, 73]. У женщин с идиопатическим бесплодием, в период имплантационного окна было показано снижение экспрессии LIF в эндометрии [41]. Аналогичные данные получены у женщин с неудачными попытками ЭКО и бесплодием, обусловленным эндометриозом [47, 56] по сравнению с фертильными женщинами. LIF присутствует в смывах из полости матки и достигает максимума в течении средне-поздней стадии фазы секреции, при этом отмечается сниженное его содержание у женщин с необъяснимым бесплодием [18, 71]. Однако у женщин с бесплодием, обусловленным эндометриозом в период имплантационного окна не было обнаружено статистических различий в содержании LIF в смывах из полости матки по сравнению с фертильными женщинами [49]. Serafini P. C., и соавт., 2009, считают LIF предиктором имплантационной способности эндометрия в циклах ЭКО [27], другие авторы [31] не подтверждают эту точку зрения. Этот цитокин на сегодняшний день доступен в виде рекомбинантной формы (r-hLIF), однако попытки его использования на протяжении лютеиновой фазы цикла у женщин с повторными неудачами имплантации не приводили к увеличению частоты наступления беременности в циклах ЭКО [64]. Колонестимулирующие факторы (CSF) — гетерогенная группа факторов роста и дифференцировки миелоидного ростка гемопоэза. К ним относятся гранулоцитарный колонестимулирующий фактор (G-CSF или CSF-3), моноцитарный колонестимулирующий фактор (M–CSF или CSF-1), гранулоцитарно-макрофагальный колонестимулирующий фактор (GM–CSF или CSF-2) и IL-3 или мульти-CSF. GM–CSF отличается от G-CSF и M–CSF меньшей специфичностью действия, стимулируя пролиферацию и дифференцировку предшественников как гранулоцитов так и моноцитов. За последние годы опубликовано множество работ, в которых была показана роль колонестимулирующих факторов в репродукции: в фолликулогенезе [43], овуляции, развитии эмбриона (Kawamura K, et al., 2012) [61], функции эндометрия [39], имплантации и в течение беременности [37]. Доказано, что высокий уровень G-CSF в фолликулярной жидкости определяет успех ЭКО [43], его уровень в сыворотке крови может быть предиктором беременности [48]. Более того, имеются отдельные сообщения о применении G-CSF (филграстима) во время беременности с благоприятным исходом [37, 68]. Считается, что M–CSF играет важную роль в физиологии эндометрия и патогенезе эндометриоза [45]. В работе Salmassi A. И соавт., 2010 было установлено, что уровень M–CSF в циркулирующей крови может быть прогностическим фактором исходов ЭКО у человека [15]. Внутривенное введение М–CSF в циклах ЭКО с применением мочевых гонадотропинов оказывало положительное действие на фолликулгенез в яичниках, особенно у женщин со сниженным сывороточным содержанием М–CSF в начале фолликулярной фазы [16]. В своих исследованиях Gargiulo A. R., и соавт., 2004 было показано, что концентрация М- CSF в цервикальной слизи коррелирует с уровнем Е2 в крови и соотношением Е2/Р в крови [24]. В конце 90-х годов прошлого века были получены данные о том, что помимо клеток иммунной системы (Т-лимфоциты, моноциты, гранулоциты, макрофаги), GM–CSF синтезируется эндотелиальными и эпителиальными клетками органов репродуктивной системы: гранулезными клетками фолликулов, клетками децидуальной и стромальной ткани, эпителиальными клетками эндометрия [29], клетками маточных труб, NK- клетками эндометрия и эпителиальными клетками трофобласта. Максимальная экспрессия GM–CSF была обнаружена в эпителиальных клетках эндометрия в середине секреторной фазы менструального цикла [72]. Отмечено его существенное содержание в достаточной концентрации в смывах из полости матки [8, 24, 58]. Так же доказано, что с момента своего первого деления, эмбрион экспрессирует на своей поверхности рецепторы к GM–CSF [2]. Spandorfer S. D. и соавт, 1998 отметили, что культивирование эмбрионов в со-культуре эндометрия с добавлением GM–CSF в дозе превышающей 130 пг/мл приводило к улучшению исходов ЭКО [38]. Однако Seo W. S. и соавт., 2011 не выявили корреляции между экспрессией GM–CSF в ткани эндометрия в цикле предшествующем ЭКО и частотой наступления беременности [31]. Сывороточный уровень GM–CSF при беременности понижен у женщин с привычным невынашиванием беременности, что свидетельствует о смещении баланса иммунологической реакции с Th2 и Treg в сторону Th1 и Th17 [36]. В настоящее время все три колонестимулирующих фактора доступны в виде рекомбинантной формы и широко применяются в различных областях медицины. В последние годы ведутся исследования по их клиническому применению в репродуктивной медицине. Имеются данные о положительном влиянии всех трех CSF на качество эмбрионов [5, 20, 25] и/или рецептивность эндометрия в протоколах ЭКО. Показано, что орошение полости матки G-CSF перед переносом эмбрионов, а так же его подкожное введение с целью подготовки эндометрия [4] у женщин с привычным невынашиванием [80] и повторными неудачами имплантации в циклах ЭКО [39] приводит к увеличению толщины эндометрия и частоты наступления беременности в циклах ЭКО. Отмечено, что частота наступления беременности при использовании GM–CSF в день переноса эмбрионов в 2 раза больше, чем при использовании G-CSF. Однако, с точки зрения применения в клинической практике, наиболее перспективным остается G-CSF, так как применение GM–CSF связано со значительным числом побочных эффектов. Семейство VEGF, а так же их рецепторы являются потенциальными ангиогенными факторами и основными медиаторами как физиологического, так и патологического роста, и дифференцировки сосудов различных тканей организма. Среди существующих шести подтипов сосудистого эндотелиального фактора роста, VEGF-А является наиболее значимым фактором регуляции ангиогенеза и наиболее экспрессируемым в эндометрии человека [74]. Максимальная экспрессия VEGF эпителиальными и стромальными клетками эндометрия была отмечена в средней секреторной фазе цикла [81]. Так, Seo W. S., и соавт., 2011 выявили значительно повышенную экспрессию VEGF-A железистым эпителием в период окна имплантации в цикле, предшествующем проведению ЭКО, у женщин с наступившей беременностью по сравнению с группой женщин у которых беременность не наступила [31]. Авторы пришли к выводу, что VEGF-A является маркером имплантационной способности эндометрия и предиктором успеха циклов ЭКО. В то же время в смывах из полости матки, полученных в период окна имплантации, отмечен низкий уровень VEGF-A у женщин с идиопатическим бесплодием по сравнению с фертильными женщинами, что свидетельствует о существенной роли VEGF-A в процессе имплантации [8]. Hannan N. J., и соавт., 2011, отметили максимальную концентрацию VEGF в смывах из полости матки в период окна имплантации. Эти же авторы показали позитивное влияние VEGF-А на качество эмбрионов и адгезивную способность эндометрия при его добавлении в культуральную среду в виде рекомбинантной формы. Клиническое применение VEGF в настоящее время не разработано. Трансформирующий фактор роста- β (TGF- β) существует в виде трех изоформ (TGF-β1, TGF-β2, и TGF-β3), которые играют ключевую роль в процессах пролиферации, дифференцировки клеток и адгезии, лежащих в основе имплантации. Действуя на эпителиальные клетки эндометрия, TGF-βs способны стимулировать (in vitro) синтез множества других молекул, участвующих в процессе имплантации, таких как VEGF, IGFBP-1, металлопротеиназ, LIF, а так же снижают выработку провоспоительного цитокина- IL-6. Таким образом, TGF-βs участвуют в обеспечении толерантности иммунной системы матери путем смещения иммунной реакции Th1 в сторону Th2. Считается, что TGF-β является сигнальным медиатором в эндометрии, способным как стимулировать, так и подавлять инвазию трофобласта во время имплантации и плацентации путем активации или ингибирования различных сигнальных путей и системы аппоптоза [76]. Доказано, что TGF-β1 участвует в процессе адгезии трофобласта к экстрацеллюлярному матриксу [35]. Ginsburg E. S., и соавт., 2005 установили, что уровень TGFβ1 в крови, полученной в день трансвагинальной пункции фолликулов значительно выше у женщин с наступившей беременностью в программах ЭКО по сравнению с женщинами, у которых беременность не наступила [78]. Было показано значительное увеличение экспрессии TGF-β в ткани эндометрия у фертильных женщин по сравнению с женщинами с привычными имплантационными потерями [23]. Другие авторы отмечали, что недостаток экспрессии TGFβ1 и TGFβ1R в ворсинах хориона и децидуальной ткани является одной из причин самопроизвольных абортов раннего срока, как при спонтанной беременности, так и при беременности в результате ЭКО [14]. Ge MX, и соавт., 2003 пришли к выводу, что высокий уровень TGFβ1 в фолликулярной жидкости способствует созреванию ооцитов, отражает их оплодотворяющую способность и может использоваться в качестве прогностического маркера исходов ЭКО [77]. В заключении необходимо отметить, что имплантация является результатом сложных многофакторных процессов, находящихся под непосредственным контролем гормонов, цитокинов, хемокинов, факторов роста, молекул адгезии, продуктов синтеза клеток иммунной системы. В настоящее время, отсутствует четкое понимание о координации взаимодействия между этими факторами в течение физиологического процесса имплантации эмбриона и последующего развития беременности. Необходимы дальнейшие исследования для определения алгоритма предиктивной оценки успешной имплантации в циклах ВРТ и возможности коррекции этого процесса на ранних этапах развития эмбриона.

Об авторах

Юлия Нажибовна Шарфи

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: youlia03@yandex.ru
аспирант кафедры акушерства, гинекологии и репродуктологии медицинского факультета СПбГУ

Список литературы

Дополнительные файлы