Влияние способа родоразрешения и типа вскармливания на микробиом кишечника детей в постнатальном периоде

Полный текст

Обоснование

В эпоху быстрого развития медицинских технологий процесс родов становится все менее приближенным к физиологичному под все большим контролем многочисленного оборудования и при медикаментозном воздействии. С одной стороны, это приводит к снижению материнской и младенческой смертности, с другой — неизбежно к росту числа кесаревых сечений и, в том числе, как следствие, к искусственному вскармливанию младенца [1–3]. Безусловно, акушеры стремятся к тому, чтобы ни одно кесарево сечение не было выполнено без показаний, а в задачи неонатологов входит помощь в налаживании грудного вскармливания. Тем не менее, растет обеспокоенность по поводу потенциальных последствий оперативного родоразрешения и искусственного вскармливания для новорожденного, в том числе, микробиоты его кишечника [4, 5].

Одно из наиболее существенных различий между кесаревым сечением и вагинальными родами заключается в первоначальном микробном воздействии на новорожденного [6]. Во время вагинальных родов новорожденные пересекают родовые пути, встречая разнообразный набор материнских микроорганизмов, обеспечивающих раннюю инокуляцию кишечника ребенка [7–9]. Материнская микробиота, включающая лактобактерии влагалища и бифидобактерии из кишечника при самопроизвольном опорожнении прямой кишки в потужном периоде, обеспечивает основу для формирования здорового микробного сообщества новорожденного [10]. При этом дети, рожденные путем операции кесарева сечения, подвержены воздействию микроорганизмов окружающей среды, преобладающих в условиях лечебных учреждений, а также на коже матери [11, 12].

Что касается типа вскармливания после рождения ребенка, то этот механизм считают по своей значимости даже более важным, чем способ родоразрешения. Известны и доказаны различия в микробиоте кишечника младенцев, находящихся на исключительно грудном и искусственном вскармливании. Главные компоненты грудного молока, формирующие состав микробиома кишечника ребенка, — олигосахариды. Олигосахариды женского молока представляют собой сложные гликаны, устойчивые к пищеварению и осуществляющие ряд функций в дистальном отделе желудочно-кишечного тракта ребенка [13]. Идентифицировано более 200 уникальных олигосахаридов, и доказано, что генетика матери влияет на конкретный состав олигосахаридов грудного молока [13]. Олигосахариды являются пребиотическим субстратом для бактерий рода Bifidobacterium, а также действуют в качестве рецептора-ловушки для патогенных микроорганизмов [13]. Добавление олигосахаридов и других пребиотиков в детские смеси за последнее десятилетие, вероятно, привело к некоторой конвергенции микробиоты детей на искусственном и грудном вскармливании. Кроме олигосахаридов дети получают постоянный источник полезных бактерий непосредственно из самого грудного молока, содержащего Staphylococcus, Streptococcus, Bifidobacterium, Lactobacillus, Clostridium и Veillonella (все резидентные роды бактерий, обнаруженные в микробиоме кишечника ребенка первых месяцев жизни), а также не менее важные секреторные иммуноглобулины, обеспечивающие работу иммунной системы в просвете кишечника новорожденного [14–16].

Функциональная активность микробиома кишечника детей, находящихся на искусственном вскармливании, похожа на таковую у взрослых [17]. Микробиом кишечника этих детей включает большую долю генов, связанных с синтезом желчных кислот и метана, и в меньшей степени представлен генами, ответственными за углеводный и липидный обмен, а также биосинтез жирных кислот [18]. По сравнению с микробиомом детей, находящихся на искусственном вскармливании, микробиом младенцев на грудном вскармливании содержит больше генов, обеспечивающих метаболизм витаминов и кофакторов, детоксикацию свободных радикалов и метаболизм глутатиона [18, 19].

Так или иначе состав микробиоты кишечника ребенка в первые месяцы жизни оказывает длительное влияние на формирование траектории здоровья человека, формируя в некоторых случаях предрасположенность к метаболическим нарушениям (ожирению, сахарному диабету, инсулинорезистентности), а также нарушениям работы иммунной системы (аллергическим реакциям, атопическому дерматиту, бронхиальной астме) [20, 21].

Цель — изучить влияние способа родоразрешения и типа вскармливания на состав микробиома кишечника детей в возрасте 4–6 нед. жизни.

Материалы и методы

В исследование включены 103 ребенка в возрасте 4–6 нед. жизни, обследованных в условиях ООО «Клиника профессора Буштыревой» в рамках Приказа Минздрава России от 10.08.2017 № 514н «О порядке проведения профилактических медицинских осмотров несовершеннолетних» с 2021 по 2022 г. Все дети разделены на четыре группы: в 1-ю группу вошли 39 детей, рожденных через естественные родовые пути и находившихся на грудном вскармливании; во 2-ю группу — 10 детей, родившихся через естественные родовые пути и находившихся на искусственном вскармливании; в 3-ю группу — 31 ребенок, рожденный путем кесарева сечения и находившийся на грудном вскармливании; в 4-ю группу — 23 младенца, родившихся путем операции кесарева сечения и находившихся на искусственном вскармливании. У каждого ребенка в 4–6 нед. после рождения брали кал для секвенирования генов 16S рибосомной РНК. Критерии включения в исследование: здоровые дети возраста 4–6 нед., рожденные в результате доношенной беременности, выписанные из родильного стационара на 2–3-и сутки после родов, находившиеся на исключительно грудном или полностью искусственном (молочными смесями) вскармливании.

Критерии невключения:

• преждевременные роды;
• дети, рожденные от матерей с беременностью, протекавшей на фоне преэклампсии, фетоплацентарной недостаточности, задержки развития плода, тяжелой экстрагенитальной и акушерской патологии;
• дети, находившиеся после родоразрешения в условиях отделения реанимации и интенсивной терапии новорожденных;
• дети на смешанном типе вскармливания.

Критерии исключения: отказ от участия в исследовании, появление признаков острой респираторной вирусной или кишечной инфекции у ребенка в процессе исследования, информация о приеме ребенком любых биологических препаратов, воздействующих на микробиоту кишечника (про-, пре-, син-, сим- и метабиотиков).

Каждая мать, как законный представитель ребенка, заполнила информированное добровольное согласие на участие в исследовании. Локальный этический комитет ООО «Клиника профессора Буштыревой» одобрил проведение настоящего исследования.

Взятие образцов

Биологический образец забирали сухим стерильным зондом и помещали в пробирку со специальной стерильной транспортной средой. Кал забирали из подгузника после дефекации ребенка в день исследования естественным путем без применения слабительных и клизм.

Образец кала помещали в пробирку Эппендорф со специальной «транспортной средой с муколитиком» (Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия). До выделения ДНК материал сохраняли при температуре +4 ℃.

Тотальную ДНК выделяли из образцов кала, подвергнутых гомогенизации в лизирующем растворе. Гомогенизацию проводили вместе с шариками с последующей экстракцией ДНК методом сорбентной колонки (Qiagen, США) в соответствии с рекомендациями производителя.

Библиотеки для секвенирования 16S рибосомной РНК готовили в соответствии с протоколом Illumina по подготовке 16S метагеномных библиотек для секвенирования (Part #15044223 Rev. B). Для первичной амплификации использовали рекомендованные праймеры к участку V3–V4 гена 16S рибосомной РНК, несущие адаптерные последовательности на 5’-конце. Для первого раунда амплификации брали по 5 нг геномной ДНК и проводили 25 циклов полимеразной цепной реакции с использованием смеси KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2×) (Roche Diagnostics, Швейцария). Продукты амплификации очищали на магнитных частицах, брали по 10 нг ДНК и проводили 8 циклов индексирующей полимеразной цепной реакции с использованием наборов KAPA HiFi HotStart ReadyMix и Nextera XT Index Kit (Illumina, США). Готовые библиотеки очищали на магнитных частицах, пулировали в эквимолярном соотношении и секвенировали на платформе MiSeq (Illumina, США) с использованием набора MiSeq Reagent Kits v2 (Illumina, США) в парноконцевом режиме с длинами прямого и обратного прочтений по 250 нуклеотидов.

Анализ данных

Биоинформатическую обработку результатов секвенирования проводили с помощью собственного биоинформатического пайплана, реализованного на языках программирования R 3.6 и Python 3. На первом этапе обработки последовательности праймеров обрезали для парных прочтений, а прочтения, не содержащие последовательности праймеров удаляли. Затем удаляли прочтения с плохим качеством (по Phred score менее 10 баллов) и короткие прочтения (менее 200 п. н.) и обрабатывали полученные данные с помощью конвейера DADA2 для выявления точных вариантов последовательностей [22]. После этого прямые и обратные прочтения конкатенировали, а полученные последовательности использовали для таксономической классификации по методу Naive Bayes [23] с использованием референсной базы данных SILVA 138 [24]. Виды бактерий идентифицировали с помощью алгоритма точного совпадения в DADA2 по предварительно обработанным соответствующим образом последовательностям SILVA 138 с помощью пользовательских скриптов.

Статистический анализ

В процессе обработки данных оценивали значения медианы и интерквартильного размаха. Статистическая значимость результатов рассчитана при доверительной вероятности 95 %. Для сравнения групп использованы непараметрический критерий Краскела – Уоллиса для независимых выборок и непараметрический коэффициент корреляции Спирмена.

Для статистической обработки данных применен алгоритм «деревья решений» (или «деревья классификации»), а также ROC-анализ, дающий дополнительные инструменты для анализа построенных моделей и их верификации.

Исходные признаки обработаны с использованием пакетов прикладных программ Statistica 14.0.0.15, Microsoft Excel 2019, IBM SPSS 27.0.0.1. Для нахождения решающих правил с помощью пакета SPSS применены алгоритмы Ranfor («случайный лес») и Decision Tree («деревья решений») с кросс-проверкой. Для снижения размерности исходных параметров использован модуль «Скрининг предикторов» пакета Statistica.

Для визуализации непараметрических корреляций применен пакет GVedit 2.39.

Результаты

Микробиом кишечника анализировали на таксономическом уровне микробных родов. Суммарно обнаружен 81 род микроорганизмов. Из них с помощью метода «деревья решений» выявлен 21 род, по относительной представленности которого в четырех группах различия между группами были максимальными (табл. 1): Escherichia/Shigella, Bifidobacterium, Streptococcus, Bacteroides, Enterococcus, Veillonella, Lactobacillus, Clostridium_sensu_stricto_1, Klebsiella, Gemella, Atopobium, Actinomyces, Parabacteroides, Akkermansia, Prevotella, Bilophila, Haemophilus, Blautia, Floricoccus, Faecalibacterium, Collinsella.

 

Таблица 1. Роды микроорганизмов, относительная представленность которых максимально влияла на различия между группами

Table 1. Bacteria genera the relative abundance of which had the greatest impact on differences between the study groups

Род микроорганизмов	Критерий χ2	Значение p
Escherichia/Shigella	36,87988	0,000028
Bifidobacterium	29,41835	0,000051
Streptococcus	31,68864	0,000225
Bacteroides	21,95520	0,001234
Enterococcus	15,79585	0,001249
Veillonella	25,81723	0,002188
Lactobacillus	25,61182	0,002364
Clostridium_sensu_stricto_1	17,98182	0,006278
Klebsiella	35,31667	0,008621
Gemella	29,62479	0,013349
Atopobium	24,00000	0,020341
Actinomyces	9,55096	0,022795
Parabacteroides	27,70167	0,023513
Akkermansia	9,46939	0,023659
Prevotella	23,40000	0,024516
Bilophila	14,00000	0,029636
Haemophilus	22,59917	0,031328
Blautia	26,54167	0,032700
Floricoccus	8,31111	0,040001
Faecalibacterium	29,54340	0,042129
Collinsella	21,24364	0,046925

 

Относительная представленность этих родов в составе микробиома кишечника детей всех четырех групп представлена в табл. 2.

 

Таблица 2. Относительная представленность родов микроорганизмов с наибольшими различиями между группами

Table 2. Relative abundance of bacteria genera for which the differences between study groups were the greatest

Род микроорганизмов	1-я группа ЕР и ГВ (n = 39)	2-я группа ЕР и ИВ (n = 10)	3-я группа КС и ГВ (n = 31)	4-я группа КС и ИВ (n = 23)	Значение р
Actinomyces	0,08 (0,04–0,13)	1,21 (0,33–2,09)	0,32 (0,09–4,72)	0,29 (0,10–0,78)	р = 0,126
Akkermansia	0,01 (0,01–0,02)	1,66 (0,01–4,79)	0,12 (0,03–30,83)	34,07 (29,29–38,85)	p1–4 = 0,011
Atopobium	0,94 (0,86–1,02)	0,12 (0,11–0,13)	0,05 (0,04–0,07)	0,12 (0,03–0,22)	р = 0,198
Bacteroides	29,52 (9,95–37,09)	20,98 (0,03–27,81)	9,51 (0,11–28,77)	0,06 (0,03–0,07)	р = 0,125
Bifidobacterium	30,68 (21,65–39,41)	21,00 (10,46–31,23)	31,46 (24,30–52,97)	17,08 (9,86–21,68)	p1–4 = 0,002 p3–4 = 0,001
Bilophila	0,34 (0,16–0,63)	1,54 (1,54–1,54)	1,47 (1,47–1,47)	0	р = 0,145
Blautia	0,80 (0,14–1,85)	2,52 (1,86–3,19)	0,92 (0,20–1,12)	3,73 (1,94–8,86)	р = 0,129
Clostridium_sensu_stricto_1	3,84 (0,09–23,52)	4,95 (0,95–11,09)	9,15 (1,71–17,43)	8,20 (5,63–10,56)	р = 0,854
Collinsella	6,32 (3,35–14,58)	2,54 (0,07–4,37)	3,38 (2,71–4,21)	7,53 (3,99–23,37)	р = 0,186
Enterococcus	0,58 (0,12–1,87)	1,06 (0,11–2,35)	4,69 (1,01–8,59)	4,29 (2,07–6,96)	p1–3 = 0,003 p1–4 = 0,001
Escherichia/Shigella	6,89 (2,32–25,25)	19,19 (6,81–22,17)	17,68 (4,49–23,02)	14,40 (10,87–34,08)	р = 0,289
Faecalibacterium	0,04 (0,03–0,05)	0,06 (0,02–7,95)	0,08 (0,05–13,10)	0,04 (0,01–0,05)	р = 0,112
Floricoccus	0,09 (0,09–0,39)	0,30 (0,20–0,39)	0,06 (0,00–0,08)	0,03 (0,00–0,11)	р = 0,204
Gemella	0,04 (0,02–0,05)	0,04 (0,03–0,04)	0,08 (0,08–0,17)	0,36 (0,36–0,36)	р = 0,187
Haemophilus	0,26 (0,25–2,73)	1,71 (1,71–1,71)	1,05 (0,11–3,11)	5,50 (2,29–12,20)	р = 0,162
Klebsiella	11,81 (1,23–17,14)	18,50 (6,34–30,32)	4,96 (1,77–17,72)	7,16 (3,02–15,06)	р = 0,778
Lactobacillus	1,91 (0,08–4,18)	1,21 (0,95–2,27)	4,67 (2,29–13,41)	3,21 (1,39–9,17)	р = 0,088
Parabacteroides	1,78 (0,54–8,54)	0,53 (0,47–1,58)	4,50 (3,04–10,16)	1,14 (0,00–2,29)	р = 0,351
Prevotella	0,03 (0,02–22,25)	0,06 (0,01–1,96)	9,71 (0,16–19,27)	0,07 (0,07–0,07)	р = 0,513
Streptococcus	3,29 (1,90–13,7)	9,35 (1,79–25,1)	5,58 (1,92–8,90)	12,8 (5,94–24,9)	р = 0,082
Veillonella	2,43 (0,49–10,56)	24,24 (0,48–26,38)	1,22 (0,53–5,36)	12,45 (1,75–22,05)	р = 0,059

Примечание. Данные представлены в процентах в виде медианы и интерквартильного размаха. ЕР — естественные роды; КС — кесарево сечение; ГВ — грудное вскармливание; ИВ — искусственное вскармливание.

 

При анализе относительной представленности родов бактерий в составе микробиома кишечника детей из 4-й группы выявлены следующие статистически значимые отличия: средняя представленность бактерий рода Akkermansia в группе детей, рожденных оперативным путем и находившихся на искусственном вскармливании, была значимо выше, чем у детей, находившихся на исключительно грудном вскармливании и рожденных через естественные родовые пути, — 34,07 (29,29–38,85) и 0,01 (0,01–0,02) % соответственно (р = 0,011).

Показатели средней относительной представленности бактерий рода Bifidobacterium в кишечнике статистически значимо отличались между детьми 1-й и 4-й, а также 3-й и 4-й групп. В группе детей, находящихся на грудном вскармливании и рожденных через естественные родовые пути, эти микроорганизмы выявляли с частотой 30,68 (21,65–39,41) %, что было статистически значимо выше, чем в 4-й группе [17,08 (9,86–21,68) %], где представленность бифидобактерий была минимальной (p_1–4 = 0,002). При этом в 3-й группе (у детей, рожденных путем операции кесарева сечения и находившихся на грудном вскармливании) средняя относительная представленность Bifidobacterium была значимо выше, чем в 4-й группе — 31,46 (24,30–52,97) и 17,08 (9,86–21,68) % соответственно (p_3–4 = 0,001). Таким образом, средняя относительная представленность Bifidobacterium была наибольшей в группах детей, находившихся на грудном вскармливании, независимо от способа родоразрешения и наименьшей — в группах детей, находящихся на искусственном вскармливании.

Примечательно, что по средней относительной представленности бактерий рода Enterococcus в кишечнике детей статистически значимо отличались 1-я и 3-я (р = 0,003), а также 1-я и 4-я (р = 0,001) группы. Минимальная относительная представленность бактерий этого рода обнаружена в группе детей на грудном вскармливании, родившихся через естественные родовые пути [0,58 (0,12–1,87) %]. Наибольшая средняя относительная представленность этих бактерий была в группе детей на искусственном вскармливании, рожденных с помощью операции кесарева сечения [4,29 (2,07–6,96) %].

Данные по частоте выявления Akkermansia, Bifidobacterium и Enterococcus в составе микробиоты кишечника детей четырех групп представлены на рис. 1.

 

Рис. 1. Диаграммы размаха относительной представленности бактерий родов Akkermansia (a), Bifidobacterium (b) и Enterococcus (c) в составе микробиоты кишечника детей четырех групп. Жирная линия отражает медиану показателя, нижняя и верхняя стороны прямоугольника — 25-й и 75-й процентили соответственно, «усы» — минимальное и максимальное значения, не являющиеся экстремальными. * Выбросы показателей; ° экстремумы показателей; ЕР — естественные роды; КС — кесарево сечение; ГВ — грудное вскармливание; ИВ — искусственное вскармливание

 

Для определения степени интеграции между изучаемыми элементами микробиома кишечника детей проведен корреляционный анализ. Для удобства межгруппового сравнения при помощи метода корреляционной адаптометрии осуществляли суммарную оценку корреляционных весов в сопоставляемых группах.

Коррелограммы представлены на рисунках 2, 3, 4 и 5 соответственно для 1-й, 2-й, 3-й и 4-й обследуемых групп. Все связи, показанные на рисунках, были статистически значимыми (p ≤ 0,05).

 

Рис. 2. Коррелограмма связей между родами бактерий, выявленных в результате секвенирования 16S рибосомной РНК, в составе микробиома кишечника детей 1-й группы, рожденных через естественные родовые пути и находившихся на грудном вскармливании. Сплошными стрелками обозначены положительные связи, пунктирными — отрицательные

 

Рис. 3. Коррелограмма связей между родами бактерий, выявленных в результате секвенирования 16S рибосомной РНК, в составе микробиома кишечника детей 2-й группы, рожденных через естественные родовые пути и находившихся на искусственном вскармливании. Сплошной стрелкой обозначена положительная связь, пунктирной — отрицательная

 

Рис. 4. Коррелограмма связей между родами бактерий, выявленных в результате секвенирования 16S рибосомной РНК, в составе микробиома кишечника детей 3-й группы, рожденных путем операции кесарева сечения и находившихся на грудном вскармливании. Сплошными стрелками обозначены положительные связи, пунктирной — отрицательная

 

Рис. 5. Коррелограмма связей между родами бактерий, выявленных в результате секвенирования 16S рибосомной РНК, в составе микробиома кишечника детей 4-й группы, рожденных путем операции кесарева сечения и находившихся на искусственном вскармливании. Сплошными стрелками обозначены положительные связи

 

При анализе корреляционных матриц в 1-й группе детей, рожденных через естественные родовые пути и находившихся на грудном вскармливании (рис. 2), обращает на себя внимание большое количество как положительных, так и отрицательных связей между родами бактерий (ρ = 0,5). У бактерий рода Bifidobacterium отмечены только положительные связи с бактериями родов Akkermansia (cильная связь 0,96) и Lactobacillus (связь средней силы 0,5). Enterococcus продемонстрировали сильную положительную связь с Actinomyces (0,9), среднюю положительную связь с Veilonella (0,5) и отрицательную сильную связь с Gemella (0,7). Кроме того, у бактерий рода Gemella выявлена также положительная сильная связь с бактериями рода Haemophillus (0,9). Parabacteroides показали отрицательную сильную связь с Veilonella (0,8) и Escherichia (0,8).

Значение коэффициента корреляционной адаптометрии для 1-й группы составило 6,39, что было максимальным значением из всех четырех групп.

Анализ корреляционных матриц в группе детей, рожденных через естественные родовые пути и находившихся на искусственном вскармливании (рис. 3), показал значительно меньшее количество корреляционных связей, чем в 1-й группе. Так, обнаружена сильная отрицательная связь между бактериями родов Streptococcus и Bacteroides (0,9). Кроме того, отмечена сильная положительная связь между бактериями родов Streptococcus и Clostridium_sensu_stricto_1 (0,8). При этом коэффициент корреляционной адаптометрии для 2-й группы составил 1,72.

Далее проводили анализ в группах детей, рожденных путем операции кесарева сечения. Так, анализ корреляционных матриц в группе детей, рожденных оперативным путем и находившихся на грудном вскармливании (рис. 4), показал достаточно большое количество положительных связей: у бактерий рода Escherichia/Shigella выявлены сильные положительные связи с бактериями родов Actinomyces (0,9) и Haemophilus (0,7). Streptococcus показали положительную связь средней силы с бактериями родов Haemophilus (0,6) и сильную положительную связь с бактериями рода Collinsella (0,9). Clostridium_sensu_stricto_1 продемонстрировали отрицательную связь средней силы с Lactobacillus (0,6) и сильную положительную связь с Klebsiella (0,9). Коэффициент корреляционной адаптометрии для 3-й группы составил 4,74.

Анализ корреляционных матриц в группе детей, рожденных оперативным путем и находившихся на искусственном вскармливании (рис. 5), показал малое количество связей. Обнаружена сильная положительная связь между бактериями родов Clostridium_sensu_strictu_1 и Escherichia/Schigella (0,8), а также сильная положительная связь между бактериями родов Streptococcus и Klebsiella (0,7). Коэффициент корреляционной адаптометрии для 4-й группы был минимальным и составил 1,48.

Все дети, принимавшие участие в исследовании, продолжали наблюдение у педиатров клиники. До 1 года жизни этих детей ретроспективно оценена частота обращений их родителей за консультацией к педиатрам по поводу тех или иных заболеваний (табл. 3).

 

Таблица 3. Частота заболеваемости обследуемых детей на первом году жизни

Table 3. Frequency of morbidity in surveyed children in the first year of life

Нозология	1-я группа ЕР и ГВ (n = 39), n (%)	2-я группа ЕР и ИВ (n = 10), n (%)	3-я группа КС и ГВ (n = 31), n (%)	4-я группа КС и ИВ (n = 23), n (%)	Значение р
Аллергические заболевания	6 (15,4)	4 (40 %)	7 (22,6)	15 (65,2)	p > 0,05
Эпизоды острых кишечных инфекций	2 (5,1)	1 (10 %)	3 (9,7)	6 (26,1)	p > 0,05
Острые респираторные вирусные инфекции	7 (17,9)	7 (70 %)	10 (32,2)	18 (78,3)	p1–4 = 0,0064 p3–4 = 0,018

Примечание. ЕР — естественные роды; КС — кесарево сечение; ГВ — грудное вскармливание; ИВ — искусственное вскармливание.

 

Представленные группы не отличались по частоте аллергических заболеваний и эпизодов острых кишечных инфекций на первом году жизни. Однако обнаружены статистически значимые отличия по частоте острой респираторной вирусной инфекции (ОРВИ) между детьми 1-й и 4-й групп: в группе детей, рожденных через естественные родовые пути и находившихся на грудном вскармливании, частота ОРВИ была значимо ниже, чем в группе детей, рожденных путем кесарева сечения и находившихся на искусственном вскармливании (17,9 и 78,3 % соответственно; p = 0,0064). Кроме того, частота ОРВИ была также значимо выше в группе детей, рожденных путем кесарева сечения и находившихся на искусственном вскармливании, чем у детей на грудном вскармливании (78,3 и 32,2 % соответственно; p = 0,018).

Обсуждение

В составе микробиоты кишечника детей обследуемых групп самая высокая относительная представленность бактерий рода Bifidobacterium выявлена в 1-й и 3-й группах, то есть у детей, находившихся на исключительно грудном вскармливании, независимо от способа родоразрешения (30,68 и 31,46 % соответственно). При этом минимальное относительное содержание бактерий рода Bifidobacterium обнаружено в группе детей на искусственном вскармливании, рожденных путем операции кесарева сечения. Известно, что в составе микробиоты кишечника здоровых детей первого года жизни в норме Bifidobacterium играют доминирующую роль. Олигосахариды грудного молока являются главным пребиотическим компонентом для роста Bifidobacterium в кишечнике младенца. Эти данные свидетельствуют о том, что, вероятно, для обеспечения механизма доминирования бифидобактерий в составе микробиоты кишечника тип вскармливания играет более значимую роль, чем способ родоразрешения, и к возрасту 4–6 нед. жизни разницы между детьми, находящимися на грудном вскармливании, по частоте обнаружения бифидобактерий нет независимо от способа родоразрешения. Таким образом, в условиях растущей частоты кесарева сечения поддержание исключительно грудного вскармливания служит одним из механизмов обеспечения микробиологического здоровья кишечника.

Что касается относительного содержания бактерий рода Enterococcus в составе микробиоты кишечника, отмечено, что их минимальное количество было типичным для детей 1-й группы, рожденных через естественные родовые пути и находившихся на грудном вскармливании, их доля была статистически значимо ниже, чем в 3-й и 4-й группах (0,58, 4,69 и 4,29 % соответственно). Известно, что у детей на исключительно грудном вскармливании отмечают в составе микробиома кишечника меньшее микробное разнообразие и большое количество разных видов Bifidobacterium, Staphylococcus и Streptococcus. А у детей на искусственном вскармливании выявляют более разнообразный микробиом, представленный бактериями Bacteroides, Clostridium, Enterobacteriaceae, Enterococcus и Lachnospiraceae, при определенных условиях способными выступать в роли условно-патогенной микробиоты и провоцировать развитие заболевания [25]. Кроме того, значительное количество исследований показывают причастность бактерий кишечника, доминирующих в составе микробиома после оперативного родоразрешения, в том числе энтерококков, к целому спектру хронических заболеваний, включая ожирение, метаболический синдром, некротизирующий энтероколит, воспалительные заболевания желудочно-кишечного тракта, астма и различные виды аллергий [26–30]. Вероятно, преобладание в составе микробиоты кишечника энтерококков у детей после оперативного родоразрешения (по сравнению с их содержанием у детей, рожденных через естественные родовые пути) способствует формированию более высокого воспалительного потенциала кишечника. Примечательно, что способ вскармливания детей не влияет на относительное содержание энтерококков, а способ родоразрешения — на него воздействует.

Статистически значимо более высокая частота обнаружения бактерий рода Akkermansia выявлена в 4-й группе по сравнению с показателем в 1-й группе (34,07 и 0,01 % соответственно). Фактически род Akkermansia был самым распространенным в группе детей, рожденных путем операции кесарева сечения и находившихся на искусственном вскармливании. Akkermansia muciniphila — основной представитель рода бактерий Akkermansia, чаще встречающийся у людей со значимым количеством пищевых волокон в рационе питания, а также соблюдающих средиземноморскую диету. Достаточное количество Akkermansia muciniphila ассоциировано с низким риском развития сахарного диабета и ожирения. При детальном анализе данных рациона матерей детей 4-й группы у матерей детей с высокими концентрациями Akkermansia обнаружена минимальная прибавка массы тела во время беременности (до 8 кг), и в их рационе питания преобладали пищевые волокна растительного происхождения и красное мясо. Это, вероятно, и способствует размножению данной бактерии в кишечнике матерей и обеспечивает ее дальнейшую передачу потомству. Возможно, именно этот факт объясняет доминирование такой нетипичной для младенческого микробиома кишечника бактерии в группе детей, рожденных оперативным путем и находящихся на искусственном вскармливании.

Любопытным представляется корреляционный анализ полученных данных. Особо примечательно количество связей на коррелограммах в четырех группах: количество отрицательных и положительных связей в группах детей, находившихся на грудном вскармливании, было больше, чем в группах детей на искусственном вскармливании. При этом очевидно, что тип родоразрешения также не влиял на количество связей между родами микроорганизмов.

Коэффициент корреляционной адаптометрии отражает напряженность функционирования системы при появлении какого-то внешнего стимула. Так, при внешнем воздействии для сохранения работоспособности системы количество внутренних связей между объектами возрастает, что в конечном итоге приводит к состоянию адаптации, и количество корреляций между составляющими системы уменьшается. Фактически, рост коэффициента корреляционной адаптометрии отражает переход системы из состояния гомеостаза в состояние гомеокинеза, а его снижение — наоборот, из состояния гомеокинеза к состоянию гомеостаза.

Коэффициент корреляционной адаптометрии составил 6,39 для 1-й группы, 1,72 — для 2-й, 4,74 — для 3-й, 1,48 — для 4-й. Таким образом, напряженное взаимодействие бактерий между собой в составе микробиома кишечника ребенка является максимальным на фоне грудного вскармливания и минимальным при искусственном вскармливании адаптированными смесями. Предположительно, грудное вскармливание, являясь эволюционно самым благоприятным и эффективным типом вскармливания для новорожденного, должно способствовать минимальному напряжению процессов адаптации в становлении микробиоты кишечника младенца. Однако, вероятно, для новорожденного с незрелой иммунной системой в агрессивных нестерильных условиях внеутробной среды именно напряжение адаптации посредством грудного вскармливания является одним из способов выживания.

Этот феномен можно объяснить механизмом «обучения» иммунной системы ребенка раннего периода жизни за счет микроорганизмов кишечника, рост которых поддерживает грудное вскармливание. Такой механизм пока недостаточно изучен, но определенную роль в нем играет секреторный иммуноглобулин А (IgA) материнского молока.

В отличие от других органических молекул, иммуноглобулины не секретируются эпителиальными клетками молочных желез, а попадают в грудное молоко через сыворотку крови или доставляются плазматическими клетками из пейеровых бляшек стенки кишечника непосредственно в ткань молочной железы [31, 32]. Попадая в просвет кишечника ребенка, IgA связываются с представителями основных четырех семейств бактерий — Firmicutes, Actinobacteria, Bacteroidetes и Proteobacteria [33]. С одной стороны, IgA связываются с мембраной патогенных бактерий и предотвращают их колонизацию и дальнейшее размножение. Например, колонизация Proteobacteria, а именно бактериями семейства Enterobacteriaceae, является триггерным фактором развития некротизирующего энтероколита, а также других воспалительных заболеваний желудочно-кишечного тракта у новорожденного [34]. IgA грудного молока связываются с Enterobacteriaceae и предотвращают развитие некротизирующего энтероколита у младенцев [35]. Другой эффект IgA связан с тем, что они способствуют адгезии полезных бактерий к энтероцитам (например, Bacteroides fragilis) и их дальнейшей пролиферации [36]. Третий эффект IgA заключается в том, что, находясь на поверхности бактериальных клеток кишечника, они запускают воспалительный процесс у новорожденных, изменяют соотношение Т-клеток в толстом кишечнике (RORγt⁺ Treg), индуцируют иммунный ответ в слизистой оболочке, тем самым повышая устойчивость к развитию инфекционного процесса [37, 38]. Вероятно, эти механизмы и объясняют такой высокий коэффициент корреляционной адаптометрии у детей на фоне грудного вскармливания.

Другим механизмом обучения иммунной системы является непосредственное наличие в материнском молоке микробиоты, колонизирующей желудочно-кишечный тракт новорожденного. Известно, что в микробиоме грудного молока наиболее часто встречаются виды Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus и Propionibacterium [39, 40]. Попадая в просвет кишечника ребенка, эти бактерии также участвуют в каскаде иммунных реакций, обеспечивающих «тренировку» иммунной системы новорожденного.

Заключение

Совершенствование лабораторных технологий год от года расширяет представления о микробиоме кишечника. Рост частоты кесарева сечения и искусственного вскармливания формирует специфический тип микробиома кишечника ребенка младшего возраста, тем самым предрасполагая к развитию тех или иных заболеваний.

Полученные данные свидетельствуют о разнонаправленности развития и созревания микробиоты кишечника детей в зависимости от способа родоразрешения и типа вскармливания. Так, на относительное содержание бифидобактерий, в норме доминирующих в составе микробиома кишечника детей до 1 года жизни, влияет в большей степени тип вскармливания, чем способ родоразрешения. Корреляционный анализ показал, что после первого месяца внеутробной жизни напряжение процессов адаптации, то есть, по сути, состояние гомеокинеза, характерно преимущественно для детей, получавших материнское молоко. Это позволяет рассматривать грудное вскармливание в качестве одного из естественных и целесообразных механизмов адаптации иммунной системы ребенка к условиям окружающей среды. Анализ частоты различных заболеваний на первом году жизни показал, что дети, рожденные путем операции кесарева сечения и находившиеся на искусственном вскармливании адаптированными смесями, чаще болели острыми респираторными вирусными инфекциями, чем дети, находившиеся на грудном вскармливании.

Изучение динамики становления микробиома кишечника на разных возрастных этапах жизни детей позволит открыть перспективы своевременной пробиотической коррекции, что, вероятно, может снизить заболеваемость детей в будущем.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Исследование выполнено на собственные средства авторов без использования спонсорских средств и финансового обеспечения.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Наибольший вклад распределен следующим образом: В.В. Баринова — концепция и дизайн исследования, сбор и обработка материала, написание текста; И.О. Буштырева — концепция и дизайн исследования, сбор и обработка материала, редактирование; Д.Е. Полев — концепция и дизайн исследования; В.В. Дудурич — сбор и обработка материала; Е.Э. Артоуз — сбор и обработка материала, написание текста; Д.О. Иванов — редактирование.

Этический комитет. Локальный этический комитет ООО «Клиника профессора Буштыревой» одобрил проведение настоящего исследования (протокол № 9 от 25.01.2024).

Об авторах

Виктория Владиславовна Баринова

Клиника профессора Буштыревой

Автор, ответственный за переписку.
Email: victoria-barinova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-8584-7096
SPIN-код: 5068-0680

канд. мед. наук

Россия, Ростов-на-Дону

Дмитрий Олегович Иванов

Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет

Email: doivanov@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-0060-4168
SPIN-код: 4437-9626

д-р мед. наук, профессор

Россия, Санкт-Петербург

Ирина Олеговна Буштырева

Клиника профессора Буштыревой

Email: kio4@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9296-2271
SPIN-код: 5009-1565

д-р мед. наук, профессор

Россия, Ростов-на-Дону

Василиса Валерьевна Дудурич

Медико-генетический центр CERBALAB

Email: vasilisadudurich@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-6271-5218
Россия, Санкт-Петербург

Дмитрий Евгеньевич Полев

Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера

Email: brantoza@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9679-2791

канд. биол. наук

Россия, Санкт-Петербург

Екатерина Эдуардовна Артоуз

Ростовский государственный медицинский университет

Email: artouz-ekaterina@rambler.ru
ORCID iD: 0009-0000-1516-7362
Россия, Ростов-на-Дону

Список литературы

Дополнительные файлы