Granulocyte colony-stimulating factor as a checkpoint of the embryo invasive potential and endometrial receptivity

Full Text

Биологическая роль G-CSF

Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF) представляет собой хорошо известный гематопоэтический цитокин, который способствует пролиферации, дифференцировке и активации клеток линии гранулоцитов путем связывания со своим рецептором на поверхности клетки. Биологические эффекты, инициируемые G-CSF, не ограничиваются исключительно гематопоэтическими тканями: G-CSF в дозозависимой манере обладает широким спектром иммуномодулирующих эффектов — способен индуцировать миграционную активность, выживаемость и регенеративную способность различных клеточных элементов [1].

В последние два десятилетия получены дополнительные доказательства иммунорегуляторного эффекта G-CSF, в частности, его воздействия на функцию Т-клеток [2]. В экспериментах на лабораторных животных (мыши линий C57BL/6 и B6D2F1) введение G-CSF препятствовало формированию реакции «трансплантат против хозяина». В результате действия G-CSF экспрессируется транскрипционный фактор GATA-3 и супрессор цитокинового сигнала 3-го типа (SOCS3), которые осуществляют контроль над пролиферацией и дифференцировкой Т-хелперов (Tx), обеспечивая смещение баланса субпопуляций Тх1/Тх2 в сторону Тх2. Важно отметить, что G-CSF также усиливает генерацию CD4⁺ и CD25⁺ регуляторных T-клеток (Treg) и Treg-клеток, продуцирующих интерлейкин-10 (IL-10), что способствует повышению толерантности макроорганизма к трансплантату, при этом иммунологическая толерантность коррелирует с уровнем продукции IL-10 Т-клетками [3].

Имплантация генетически полноценного, но в то же время на 50 % (при естественной беременности) или 100 % (в программах суррогатного материнства) генетически чужеродного эмбриона в отношении материнского организма в эндометрий служит ключом к началу успешной беременности [4], поэтому опыт клинической и экспериментальной трансплантологии в некоторых случаях можно экстраполировать на пациентов с многократными неудачными попытками ЭКО. Следует отметить, что нарушение рецептивности эндометрия рассматривается как основная причина нарушения процессов имплантации эмбриона [5], при этом его успешная имплантация требует сложного биологического взаимодействия между имплантирующимся эмбрионом и эндометрием [6]. Основная часть молекулярных факторов, которые были вовлечены в этот сложный процесс, включает интегрины и другие молекулы адгезии, связанные с протеинами экстрацеллюлярного матрикса, транспортеры ионных каналов и факторы роста [7], одним из которых и является G-CSF [1]. С другой стороны, экспериментальные данные демонстрируют, что не только от рецептивности эндометрия, но и от инвазивного потенциала развивающегося эмбриона зависит благоприятный исход имплантации [8]. Введение G-CSF повышает активность матричной металлопротеиназы 2-го типа и секрецию сосудисто-эндотелиального фактора роста в культуре клеток трофобласта человека Swan 71, при этом за счет изменений в цитоскелете актина и повышения экспрессии β1-интегрина улучшается миграционная и адгезивная способность клеток трофобласта [9].

В контексте современных знаний конечные эффекты G-CSF ассоциированы с прямым действием на клеточные элементы, экспрессирующие рецепторы к данному ростовому фактору как в материнских тканях, так и в тканях эмбриона, и событиями, опосредуемыми через различные популяции нейтрофилов и/или других клеток иммунной системы.

Роль нейтрофилов в регуляции репродуктивно значимых иммунологических реакций

Вопреки примитивным представлениям о противоинфекционном иммунитете с участием нейтрофилов (Нф) данные клеточные элементы иммунной системы способны оказывать регуляторное действие на другие клетки, участвующие в регуляции иммунных процессов (рис. 1) [10]. Неспособность к прямому киллингу внутриклеточных патогенов компенсируется регуляторными свойствами Нф: киллинг происходит опосредованно через Тх 1-го типа [11]. Нф неспособны синтезировать гамма-интерферон (γ-IFN) и IL-2 — основные цитокины, стимулирующие цитотоксические Т-лимфоциты (CD8) и макрофаги, при этом, наоборот, Нф синтезируют IL-6 и G-CSF, ингибирующие активность CD8 клеток и макрофагов. В то же время с помощью IL-1 они могут стимулировать CD4 клетки к выработке γ-IFN и IL-2. Основными мишенями регулирующего действия Нф служат Тх 2-го типа, В-лимфоциты и плазмоциты, которые в большей степени отвечают на действие IL-1, IL-6 и фактора активации лейкоцитов (LAF, leucocyte activating factor) [12]. Данная направленность действия медиаторов Нф сложилась эволюционно и более целесообразна: стимулируя продукцию антител, Нф усиливают опсонические свойства крови и обеспечивают формирование антителозависимых цитотоксических реакций, в том числе и против собственных клеток, экспрессирующих микробные антигены, что является одной из ступеней на этапе формирования иммунологической памяти [13].

 

Рис. 1. Влияние нейтрофилов на другие клетки иммунной системы: APRIL — лиганд A, индуцирующий пролиферацию; BAFF — фактор активации В-клеток; CCL(х), CXCL(х), LL(x) — сигнатуры хемокинов; HNPs — пептиды нейтрофилов человека; LAF — фактор активации лейкоцитов; Г-КСФ — гранулоцитарный колониестимулирующий фактор; IL(х) — сигнатуры интерлейкинов, ДК — дендритные клетки, Tx — Т-хелперы

Fig. 1. Effect of neutrophils on other immune cells: APRIL — a proliferation-inducing ligand; BAFF — B cell-activating factor; CCL(х), CXCL(х), LL(x) — chemokine signatures (based on chain modeling); HNPs — human neutrophil peptides; LAF — lymphocyte-activating factor; G-CSF — granulocyte colony-stimulating factor; IL(х) — interleukin signatures; DC — dendritic cells; Th — T-helper lymphocytes

 

Следует отметить, что реституция или частичная регенерация поврежденных процессами воспаления тканей, как и сами процессы регресса воспалительных реакций, не обходятся без участия Нф, которые играют важную роль в восстановлении архитектоники и функциональной активности как соматических клеток, так и клеток иммунной системы, тем самым стимулируя восстановление и регенерацию тканей. Данные явления в настоящее время объясняют различными фенотипами Нф, при этом «репаративные программы», запускаемые Нф, формируются вследствие различных вариантов взаимодействия со стромальными клетками и клетками адаптивного иммунного ответа (табл. 1) [14].

 

Таблица 1 / Table 1

Дифференциация по экспрессии и синтезу основных цитокинов различных фенотипов нейтрофилов

Various neutrophil phenotype main cytokine expression and synthesis differentiation

Синтез и секреция биологически активных веществ	Фенотипы нейтрофилов
	Нф 1-го типа	Нф 2-го типа
Цитокины
IL-1β IL-4 IL-10 IL-12 TNF-α	+ − − + +	+ + + − +
Хемокины
CCL2 CCL3 CCL5 CXCL1	− + ↓ ↑	+ − ↑ ↑
Мембранные антигены
CD11b CD49d ICAM1	− + −	+ − −
Эффекторные молекулы
ROS Миелопероксидаза ЩФ Аргиназа	↑ ↑ + ↑	↑ ↓ + ↓
Основной эффект	Провоспалительный	Противовоспалительный

Примечание. CCL(х), CXCL(х) — сигнатуры хемокинов; CD(х) — сигнатура кластера дифференциации; ICAM1 — inter-cellular adhesion molecule-1, молекула клеточной адгезии; IL(x) — сигнатура интерлейкинов; ROS — реактивные формы кислорода; TNF — фактор некроза опухоли; Нф — нейтрофил, ЩФ — щелочная фосфатаза.

 

Синтезируемый некоторыми генерациями Нф противовоспалительный белок аннексин А1 опосредует эндокринные реакции, реализующие иммуносупрессивные, противовоспалительные и/или противоаллергические эффекты глюкокортикоидов: угнетает активность фосфолипазы A2 и циклооксигеназы 1-го и 2-го типов, что в конечном счете приводит к снижению синтеза эйкозаноидов (простагландинов и лейкотриенов) [15]. Связываясь со специфическим рецептором ALX/FPR2 на мембране лейкоцитов, аннексин A1 угнетает активность лейкоцитов: подавляет способность к адгезии, миграционную способность лейкоцитов, хемотаксис, фагоцитоз, высвобождение провоспалительных медиаторов, лизосомальных ферментов из Нф, макрофагов и тучных клеток [16]. Аннексин А1 регулирует способность макрофагов к эффероцитозу, влияет на продуцирование TNF и IL-6 и снижает способность к дегрануляции тучных клеток [17]. Недавнее исследование продемонстрировало, что человеческие Нф выделяют противовоспалительный цитокин IL-10 в ответ на продукцию сывороточного амилоида A [18]. Секреция IL-10 и IL-12 Нф происходит также в ответ на наличие липополисахарида (LPS), гамма-интерферона, антигенов грибов рода Candida [19].

Tsuda et al. определили два подтипа Нф с различной экспрессией цитокинов и хемокинов: Нф 1-го типа (Нф1) в основном продуцируют IL-12 и CCL3 и CD49d + CD11b-антигены, в то время как Нф 2-го типа (Нф2) — IL-10 и CCL2 и демонстрируют CD49d-CD11b + фенотип [20].

В настоящее время доминируют представления о наличии двух фенотипов Нф, которые лишь дополняются с появлением новых данных. Противоположные по действию генерации Нф сосуществуют одновременно на протяжении всех фаз воспаления, при этом в начале воспалительной реакции преобладают Нф 1-го типа, а в период регенеративных реакций — Нф 2-го типа.

Роль G-CSF в регуляции репродуктивной функции

Рецепторы G-CSF расположены не только в эндометрии. Молекулярный анализ тканей женской репродуктивной системы продемонстрировал их экспрессию в лютеинизированных клетках гранулезы, плацентарных тканях, клетках трофобласта и ооцитах, что указывает на возможную роль G-CSF в регуляции не только менструального цикла, но и функции плаценты [1]. Присутствие G-CSF практически во всех отделах женской половой системы и органах плода свидетельствует о ключевой роли именно этого цитокина в большинстве циклических процессов эндометрия (репарации, дифференцировки, миграции, пролиферации) и в физиологическом течении беременности [21].

В начале 90-х гг. в экспериментальных исследованиях шведскими авторами было установлено, что перфузия лейкоцитов лабораторным животным (беспородные крысы) увеличивала частоту наступления овуляции [22], в то время как введение Нф-специфических цитотоксических RP-3 моноклональных антител достоверно снижало частоту наступления овуляции, косвенно оцениваемую путем подсчета количества ооцитов в ампулярной части яйцеводов через 20 часов после введения ХГЧ, на 27 % [23]. Далее в клинической практике в 1997 г. было продемонстрировано, что при стимуляции яичников мочевыми гонадотропинами параллельно росту фолликулов происходит постепенное повышение уровней G-CSF и лейкоцитов в сыворотке крови [24].

В клиническом исследовании на относительно небольшой группе пациенток (n = 44) было показано, что секреция G-CSF у женщин без нарушения репродуктивной функции (получающих процедуру ВРТ исключительно по мужскому фактору) в сыворотке крови и в фолликулярной жидкости выше, чем у женщин с синдромом поликистозных яичников: 54,8 ± 1,7 vs. 48,1 ± 0,9 пг/мл и 48,8 ± 1,4 vs. 44,1 ± 0,5 пг/мл соответственно. Суммируя результаты лабораторных данных, авторы делают вывод, что секреция G-CSF постепенно увеличивается на протяжении фолликулярной фазы менструального цикла и достигает своего пика в периовуляторный период, что приводит к накоплению лейкоцитов в фолликуле, фолликулярной стенке и ускоряет овуляцию [25]. В независимых исследованиях было установлено, что концентрация в крови и локальная экспрессия Г-КСФ изменяются в течение менструального цикла и беременности: повышение уровней Г-КСФ наблюдается не только в периовуляторном периоде, но и в поздней лютеиновой фазе [26]. Экспрессия Г-КСФ определяется в гранулезных и лютеальных клетках (перед и после овуляции), в эндометрии (на протяжении всего менструального цикла) [27, 28]. В сыворотке крови беременных концентрация цитокина значительно увеличивается сразу после имплантации и сохраняется на высоком уровне в течение всей беременности [29]. Источник продукции фактора в случае наступления беременности — клетки децидуальной оболочки и плаценты, в которых уровень Г-КСФ после подъема от момента имплантации снижается только ко II триместру гестации, после чего опять увеличивается, достигая максимальных значений в III триместре [30].

Впервые лекарственный эффект G-CSF у пациентов с неудачными попытками ЭКО в анамнезе был исследован еще в 2000 г. Würfel et al. Авторам удалось установить, что систематическое введение G-CSF повышает частоту имплантации [31].

В итальянском исследовании было обнаружено, что добавление G-CSF пациенткам с низким ответом увеличивает результативность циклов ВРТ. При этом концентрация G-CSF в фолликулярной жидкости напрямую коррелировала с качеством ооцита, что исследователи объяснили не столько системными, сколько паракринными эффектами G-CSF на стимулированные ооциты [32]. По данным анализа 523 образцов фолликулярной жидкости, уровень фолликулярного G-CSF был более значимым и достоверным прогностическим фактором для последующей имплантации в сравнении с морфологией эмбрионов (ОШ = 0,77, 95 % ДИ 0,69–0,83, p < 0,001 vs. ОШ = 0,66, 95 % ДИ 0,58–0,73, p = 0,01). Авторы классифицировали эмбрионов по концентрации G-CSF в фолликулярной жидкости на три класса: I класс > 30 пг/мл, II класс ∈ (30; 18,4) пг/мл, III класс < 18,4 пг/мл [33].

В проспективном исследовании по влиянию G-CSF у женщин с синдромом лютеинизации неовулирующего фолликула (ЛНФ) было показано, что адъювантное применение данного ростового фактора (ленограстим 100 мкг однократно) одновременно с триггером овуляции (ХГЧ 5000 МЕ) у 68 из 112 женщин в протоколах стимуляции овуляции кломифеном (n = 80) или рекомбинантным ФСГ (n = 32) улучшало исходы лечения: ЛНФ зарегистрирован в 4,4 % (3/68 циклов) циклах при применении G-CSF и в 19,1 % (13/68 циклов) в группе сравнения (p = 0,013, χ²-тест по методу Мак-Немара) [34]. Теоретическое обоснование данному режиму применения G-CSF (вместе с триггером овуляции) было сделано исходя из того, что период полужизни Нф составляет в среднем 3,75 дня, что обеспечивает их максимальную эффективность в периовуляторную фазу [35]. В японском проспективном клиническом исследовании (n = 30) введение рекомбинантного G-CSF (8 млн ЕД, через день) у пациенток с бедным ответом с началом контролируемой овариальной стимуляции приводило к улучшению развития фолликулов, снижению частоты отмены циклов ВРТ (вследствие отсутствия ответа на контролируемую овариальную стимуляцию (КОС)), увеличению частоты наступления беременности, при этом авторы отметили, что в целом для проведения КОС потребовалось меньшее количество гонадотропинов в получавшей G-CSF группе женщин [36].

Данные метаанализов по применению G-CSF в протоколах ВРТ (табл. 2)

По данным метаанализа 2017 г. с включением 682 пациенток (339 в группе G-CSF vs. 343 в группе сравнения) из 11 соответствующих критериям анализа исследований установлено, что внутриматочная перфузия G-CSF влияет на толщину эндометрия (ΔM = 1,79, 95 % ДИ 0,92–2,67),достоверно увеличивает частоту наступления клинической беременности (ОШ = 2,52, 95 % ДИ 1,39–4,55) и частоту имплантации эмбрионов (ОШ = 2,35, 95 % ДИ 1,20–4,60), в то же время достоверно снижая частоту отмены цикла ВРТ (ОШ = 0,38, 95 % ДИ 0,25–0,58) [37].

 

Таблица 2 / Table 2

Клинические исследования эффективности адъювантного применения Г-КСФ в протоколах ВРТ, наиболее часто включаемые в метааналитические обзоры

Clinical studies of the effectiveness of the adjuvant use of G-CSF in ART protocols, most often referred to in meta-analytical reviews

Авторы	Год публикации	Вид исследования	n	Основные результаты применения G-CSF	Примечание
A. Aleyasin et al. [41]	2016	Многоцентровое рандомизированное контролируемое (системное введение)	112	Частота имплантации (18 % vs. 7,2 %, ОШ = 2,63, 95 % ДИ 1,09–6,96, р = 0,007), биохимической (44,6 % vs. 19,6 %, ОШ = 2,74, 95 % ДИ 1,11–7,38, р = 0,005) и клинической (37,5 % vs. 14,3 %, ОШ = 2,94, 95 % ДИ 1,23–8,33, р = 0,005) беременности	Клинический протокол IRCT201503119568N11
D.H. Barad et al. [42]	2014	Рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое (системное введение)	141	Увеличение толщины эндометрия на 1,37 мм в группе G-CSF; частота наступления беременности (45,57 % vs. 39,29 %, р > 0,05)	Возраст пациенток 40,09 (± 5,20) в группе G-CSF и 39,68 (± 3,81) в группе плацебо (клинический протокол NCT01202656)
M. Eftekhar et al. [43]	2014	Сравнительное (внутриматочная перфузия)	68	Частота наступления биохимической (39,30 % vs. 14,30 %) и клинической (32,10 % vs. 12,00 %) беременности	Вместе с G-CSF пациентки получали АСК 80 мг в сутки (клинический протокол IRCT201108116420N8)
N. Gleicher et al. [44]	2013	Проспективное когортное (внутриматочная перфузия)	21	Толщина эндометрия увеличилась с 6,4 ± 1,4 до 9,3 ± 2,1 мм (p < 0,001); частота наступления клинической беременности (19,1 % vs. 0)	Перфузия G-CSF выполнена в протоколе КОС
V.V. Mishra et al. [45]	2016	Проспективное когортное (внутриматочная перфузия)	35	Увеличение толщины эндометрия с 5,86 ± 0,58 до 6,58 ± 0,84 мм	Перфузия G-CSF выполнена в протоколе КОС
F. Scarpellini, M.Sbracia [46]	2009	Рандомизированное плацебо-контролируемое (системное введение 1,5 мкг/кг)	68	Частота рождения (82,8 % vs. 48,5 %, p = 0,0061, ОШ = 5,1; 95 % ДИ 1,5–18,4)	Длительное введение G-CSF (протокол NCT00772122)
F. Scarpellini, M.Sbracia [47]	2011	Рандомизированное плацебо-контролируемое (системное введение)	89	Частота наступления клинической беременности (35,6 % vs. 15,9 %, ОШ = 2,23; 95 % ДИ 1,02–4,28)	Длительное введение G-CSF
F. Scarpellini, M. Sbracia [48]	2013	Рандомизированное плацебо-контролируемое (системное введение 60 мкг/кг)	50	Частота наступления клинической беременности (48 % vs. 16 %, ОШ = 3,0; 95 % ДИ 1,12–8,05)	Длительное введение G-CSF (клинический протокол NCT01715974)
E. Tehraninejad etal. [49]	2015	Наблюдательное (внутриматочная перфузия)	15	Увеличение толщины эндометрия с 3,59 ± 0,25 до 7,12 ± 0,84 мм (p < 0,001); частота наступления беременности (20,0 % vs. 0)	Вместе с G-CSF пациентки получали силденафил вагинально
B. Xu et al. [50]	2015	Проспективное когортное (внутриматочная перфузия)	82	Увеличение толщины эндометрия с 5,7 ± 0,7 до 8,1 ± 2,1 мм (p < 0,001); частота имплантации (31,5 % vs. 13,9 %, p < 0,01), частота наступления беременности (48,1 % vs. 25,0 %, р = 0,038)	Перенос эмбрионов в криопротоколе

Примечание. Г-КСФ — гранулоцитарный колониестимулирующий фактор; КОС — контролируемая овариальная стимуляция; АСК — ацетилсалициловая кислота.

 

В результате метаанализа 2017 г., включающего в себя данные исключительно рандомизированных исследований, не было выявлено статистически значимого увеличения толщины эндометрия после перфузии G-CSF у женщин с тонким эндометрием, при этом отмечена значительно более высокая частота наступления клинической беременности (ОШ = 2,43, 95 % ДИ 1,09–5,40), включая когорту пациенток с неудачными попытками ЭКО в анамнезе (ОШ = 2,51, 95 % ДИ 1,36–4,63) [38].

В метаанализе J. Li et al., включающем в себя 6 клинических исследований, было установлено, что перфузия эндометрия G-CSF ассоциирована с более высокой частотой клинической беременности по сравнению с плацебо (ОР = 1,563, 95 % ДИ 1,122–2,176), при этом у пациентов с синдромом тонкого эндометрия, несмотря на отсутствие статистически значимого увеличения толщины эндометрия, также увеличивалась частота имплантации эмбриона (ОР = 1,887, 95 % ДИ 1,256–2,833) и частота наступления биохимической беременности (ОР = 2,385, 95 % ДИ 1,414–4,023) [39].

Метаанализ 2018 г., включающий 10 клинических исследований общей емкостью 1016 циклов ВРТ (521 G-CSF vs. 495 в группе сравнения), продемонстрировал, что применение G-CSF достоверно увеличивает более высокий уровень частоты наступления беременности и частоту имплантации эмбриона: ОШ = 2,07 (95 % ДИ 1,64–2,61) и ОШ = 1,52 (95 % ДИ 1,08–2,14) соответственно. При этом как и внутриматочное введение (ОШ = 1,46, 95 % ДИ 1,04–2,05), так и подкожные инъекции (ОШ = 2,23, 95 % ДИ 1,68–2,95) приводят к существенному увеличению частоты наступления клинической беременности [40].

После получения данных о доказанных эффектах G-CSF встает вопрос о пути введения G-CSF: системное введение или внутриматочная перфузия? Каждый путь введения имеет свои преимущества в каждой конкретной клинической ситуации, однако сочетание данных способов введения, возможно, является верным, так как при этом G-CSF воздействует на мишени в репродуктивно значимых органах и тканях, а в эндометрии в более высоких концентрациях, что позволяет обеспечить его последующие морфо-функциональные изменения, необходимые для благоприятных условий имплантации эмбриона [51].

В рекомендациях ESHRE 2018 г., касающихся привычной потери беременности, впервые изложены данные о возможности применения G-CSF у данного контингента пациенток [52], однако необходимы дальнейшие исследования, уточняющие режим и способ введения препаратов рекомбинантного G-CSF.

About the authors

Natalya I. Tapilskaya

The Research Institute of Obstetrics, Gynecology, and Reproductology named after D.O. Ott; Saint Petersburg State Pediatric Medical University

Author for correspondence.
Email: tapnatalia@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-5309-0087

MD, PhD, DSci (Medicine), Professor, Leading Researcher. The Department of Assisted Reproductive Technologies, The Research Institute of Obstetrics, Gynecology, and Reproductology named after D.O. Ott, Saint Petersburg, Russia; Professor. The Department of Obstetrics and Gynecology with the Course of Pediatric and Adolescent Gynecology, Saint Petersburg State Pediatric Medical University

Russian Federation, Saint Petersburg

Alexander M. Gzgzyan

The Research Institute of Obstetrics, Gynecology, and Reproductology named after D.O. Ott; Saint Petersburg State University

Email: iagmail@ott.ru
ORCID iD: 0000-0003-3917-9493

MD, PhD, DSci (Medicine), the Head of the Department of Assisted Reproductive Technologies. The Research Institute of Obstetrics, Gynecology, and Reproductology named after D.O. Ott, Saint Petersburg, Russia; Professor. The Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproduction, Medical Faculty, Saint Petersburg State University

Russian Federation, Saint Petersburg

Igor Yu. Kogan

The Research Institute of Obstetrics, Gynecology, and Reproductology named after D.O. Ott

Email: iagmail@ott.ru
ORCID iD: 0000-0002-7351-6900

MD, PhD, DSci (Medicine), Professor, Corresponding Member of RAS, Interim Director

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files