Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор как ключевой регулятор инвазивного потенциала эмбриона и рецептивности эндометрия

Полный текст

Биологическая роль G-CSF

Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF) представляет собой хорошо известный гематопоэтический цитокин, который способствует пролиферации, дифференцировке и активации клеток линии гранулоцитов путем связывания со своим рецептором на поверхности клетки. Биологические эффекты, инициируемые G-CSF, не ограничиваются исключительно гематопоэтическими тканями: G-CSF в дозозависимой манере обладает широким спектром иммуномодулирующих эффектов — способен индуцировать миграционную активность, выживаемость и регенеративную способность различных клеточных элементов [1].

В последние два десятилетия получены дополнительные доказательства иммунорегуляторного эффекта G-CSF, в частности, его воздействия на функцию Т-клеток [2]. В экспериментах на лабораторных животных (мыши линий C57BL/6 и B6D2F1) введение G-CSF препятствовало формированию реакции «трансплантат против хозяина». В результате действия G-CSF экспрессируется транскрипционный фактор GATA-3 и супрессор цитокинового сигнала 3-го типа (SOCS3), которые осуществляют контроль над пролиферацией и дифференцировкой Т-хелперов (Tx), обеспечивая смещение баланса субпопуляций Тх1/Тх2 в сторону Тх2. Важно отметить, что G-CSF также усиливает генерацию CD4⁺ и CD25⁺ регуляторных T-клеток (Treg) и Treg-клеток, продуцирующих интерлейкин-10 (IL-10), что способствует повышению толерантности макроорганизма к трансплантату, при этом иммунологическая толерантность коррелирует с уровнем продукции IL-10 Т-клетками [3].

Имплантация генетически полноценного, но в то же время на 50 % (при естественной беременности) или 100 % (в программах суррогатного материнства) генетически чужеродного эмбриона в отношении материнского организма в эндометрий служит ключом к началу успешной беременности [4], поэтому опыт клинической и экспериментальной трансплантологии в некоторых случаях можно экстраполировать на пациентов с многократными неудачными попытками ЭКО. Следует отметить, что нарушение рецептивности эндометрия рассматривается как основная причина нарушения процессов имплантации эмбриона [5], при этом его успешная имплантация требует сложного биологического взаимодействия между имплантирующимся эмбрионом и эндометрием [6]. Основная часть молекулярных факторов, которые были вовлечены в этот сложный процесс, включает интегрины и другие молекулы адгезии, связанные с протеинами экстрацеллюлярного матрикса, транспортеры ионных каналов и факторы роста [7], одним из которых и является G-CSF [1]. С другой стороны, экспериментальные данные демонстрируют, что не только от рецептивности эндометрия, но и от инвазивного потенциала развивающегося эмбриона зависит благоприятный исход имплантации [8]. Введение G-CSF повышает активность матричной металлопротеиназы 2-го типа и секрецию сосудисто-эндотелиального фактора роста в культуре клеток трофобласта человека Swan 71, при этом за счет изменений в цитоскелете актина и повышения экспрессии β1-интегрина улучшается миграционная и адгезивная способность клеток трофобласта [9].

В контексте современных знаний конечные эффекты G-CSF ассоциированы с прямым действием на клеточные элементы, экспрессирующие рецепторы к данному ростовому фактору как в материнских тканях, так и в тканях эмбриона, и событиями, опосредуемыми через различные популяции нейтрофилов и/или других клеток иммунной системы.

Роль нейтрофилов в регуляции репродуктивно значимых иммунологических реакций

Вопреки примитивным представлениям о противоинфекционном иммунитете с участием нейтрофилов (Нф) данные клеточные элементы иммунной системы способны оказывать регуляторное действие на другие клетки, участвующие в регуляции иммунных процессов (рис. 1) [10]. Неспособность к прямому киллингу внутриклеточных патогенов компенсируется регуляторными свойствами Нф: киллинг происходит опосредованно через Тх 1-го типа [11]. Нф неспособны синтезировать гамма-интерферон (γ-IFN) и IL-2 — основные цитокины, стимулирующие цитотоксические Т-лимфоциты (CD8) и макрофаги, при этом, наоборот, Нф синтезируют IL-6 и G-CSF, ингибирующие активность CD8 клеток и макрофагов. В то же время с помощью IL-1 они могут стимулировать CD4 клетки к выработке γ-IFN и IL-2. Основными мишенями регулирующего действия Нф служат Тх 2-го типа, В-лимфоциты и плазмоциты, которые в большей степени отвечают на действие IL-1, IL-6 и фактора активации лейкоцитов (LAF, leucocyte activating factor) [12]. Данная направленность действия медиаторов Нф сложилась эволюционно и более целесообразна: стимулируя продукцию антител, Нф усиливают опсонические свойства крови и обеспечивают формирование антителозависимых цитотоксических реакций, в том числе и против собственных клеток, экспрессирующих микробные антигены, что является одной из ступеней на этапе формирования иммунологической памяти [13].

 

Рис. 1. Влияние нейтрофилов на другие клетки иммунной системы: APRIL — лиганд A, индуцирующий пролиферацию; BAFF — фактор активации В-клеток; CCL(х), CXCL(х), LL(x) — сигнатуры хемокинов; HNPs — пептиды нейтрофилов человека; LAF — фактор активации лейкоцитов; Г-КСФ — гранулоцитарный колониестимулирующий фактор; IL(х) — сигнатуры интерлейкинов, ДК — дендритные клетки, Tx — Т-хелперы

Fig. 1. Effect of neutrophils on other immune cells: APRIL — a proliferation-inducing ligand; BAFF — B cell-activating factor; CCL(х), CXCL(х), LL(x) — chemokine signatures (based on chain modeling); HNPs — human neutrophil peptides; LAF — lymphocyte-activating factor; G-CSF — granulocyte colony-stimulating factor; IL(х) — interleukin signatures; DC — dendritic cells; Th — T-helper lymphocytes

 

Следует отметить, что реституция или частичная регенерация поврежденных процессами воспаления тканей, как и сами процессы регресса воспалительных реакций, не обходятся без участия Нф, которые играют важную роль в восстановлении архитектоники и функциональной активности как соматических клеток, так и клеток иммунной системы, тем самым стимулируя восстановление и регенерацию тканей. Данные явления в настоящее время объясняют различными фенотипами Нф, при этом «репаративные программы», запускаемые Нф, формируются вследствие различных вариантов взаимодействия со стромальными клетками и клетками адаптивного иммунного ответа (табл. 1) [14].

 

Таблица 1 / Table 1

Дифференциация по экспрессии и синтезу основных цитокинов различных фенотипов нейтрофилов

Various neutrophil phenotype main cytokine expression and synthesis differentiation

Синтез и секреция биологически активных веществ	Фенотипы нейтрофилов
	Нф 1-го типа	Нф 2-го типа
Цитокины
IL-1β IL-4 IL-10 IL-12 TNF-α	+ − − + +	+ + + − +
Хемокины
CCL2 CCL3 CCL5 CXCL1	− + ↓ ↑	+ − ↑ ↑
Мембранные антигены
CD11b CD49d ICAM1	− + −	+ − −
Эффекторные молекулы
ROS Миелопероксидаза ЩФ Аргиназа	↑ ↑ + ↑	↑ ↓ + ↓
Основной эффект	Провоспалительный	Противовоспалительный

Примечание. CCL(х), CXCL(х) — сигнатуры хемокинов; CD(х) — сигнатура кластера дифференциации; ICAM1 — inter-cellular adhesion molecule-1, молекула клеточной адгезии; IL(x) — сигнатура интерлейкинов; ROS — реактивные формы кислорода; TNF — фактор некроза опухоли; Нф — нейтрофил, ЩФ — щелочная фосфатаза.

 

Синтезируемый некоторыми генерациями Нф противовоспалительный белок аннексин А1 опосредует эндокринные реакции, реализующие иммуносупрессивные, противовоспалительные и/или противоаллергические эффекты глюкокортикоидов: угнетает активность фосфолипазы A2 и циклооксигеназы 1-го и 2-го типов, что в конечном счете приводит к снижению синтеза эйкозаноидов (простагландинов и лейкотриенов) [15]. Связываясь со специфическим рецептором ALX/FPR2 на мембране лейкоцитов, аннексин A1 угнетает активность лейкоцитов: подавляет способность к адгезии, миграционную способность лейкоцитов, хемотаксис, фагоцитоз, высвобождение провоспалительных медиаторов, лизосомальных ферментов из Нф, макрофагов и тучных клеток [16]. Аннексин А1 регулирует способность макрофагов к эффероцитозу, влияет на продуцирование TNF и IL-6 и снижает способность к дегрануляции тучных клеток [17]. Недавнее исследование продемонстрировало, что человеческие Нф выделяют противовоспалительный цитокин IL-10 в ответ на продукцию сывороточного амилоида A [18]. Секреция IL-10 и IL-12 Нф происходит также в ответ на наличие липополисахарида (LPS), гамма-интерферона, антигенов грибов рода Candida [19].

Tsuda et al. определили два подтипа Нф с различной экспрессией цитокинов и хемокинов: Нф 1-го типа (Нф1) в основном продуцируют IL-12 и CCL3 и CD49d + CD11b-антигены, в то время как Нф 2-го типа (Нф2) — IL-10 и CCL2 и демонстрируют CD49d-CD11b + фенотип [20].

В настоящее время доминируют представления о наличии двух фенотипов Нф, которые лишь дополняются с появлением новых данных. Противоположные по действию генерации Нф сосуществуют одновременно на протяжении всех фаз воспаления, при этом в начале воспалительной реакции преобладают Нф 1-го типа, а в период регенеративных реакций — Нф 2-го типа.

Роль G-CSF в регуляции репродуктивной функции

Рецепторы G-CSF расположены не только в эндометрии. Молекулярный анализ тканей женской репродуктивной системы продемонстрировал их экспрессию в лютеинизированных клетках гранулезы, плацентарных тканях, клетках трофобласта и ооцитах, что указывает на возможную роль G-CSF в регуляции не только менструального цикла, но и функции плаценты [1]. Присутствие G-CSF практически во всех отделах женской половой системы и органах плода свидетельствует о ключевой роли именно этого цитокина в большинстве циклических процессов эндометрия (репарации, дифференцировки, миграции, пролиферации) и в физиологическом течении беременности [21].

В начале 90-х гг. в экспериментальных исследованиях шведскими авторами было установлено, что перфузия лейкоцитов лабораторным животным (беспородные крысы) увеличивала частоту наступления овуляции [22], в то время как введение Нф-специфических цитотоксических RP-3 моноклональных антител достоверно снижало частоту наступления овуляции, косвенно оцениваемую путем подсчета количества ооцитов в ампулярной части яйцеводов через 20 часов после введения ХГЧ, на 27 % [23]. Далее в клинической практике в 1997 г. было продемонстрировано, что при стимуляции яичников мочевыми гонадотропинами параллельно росту фолликулов происходит постепенное повышение уровней G-CSF и лейкоцитов в сыворотке крови [24].

В клиническом исследовании на относительно небольшой группе пациенток (n = 44) было показано, что секреция G-CSF у женщин без нарушения репродуктивной функции (получающих процедуру ВРТ исключительно по мужскому фактору) в сыворотке крови и в фолликулярной жидкости выше, чем у женщин с синдромом поликистозных яичников: 54,8 ± 1,7 vs. 48,1 ± 0,9 пг/мл и 48,8 ± 1,4 vs. 44,1 ± 0,5 пг/мл соответственно. Суммируя результаты лабораторных данных, авторы делают вывод, что секреция G-CSF постепенно увеличивается на протяжении фолликулярной фазы менструального цикла и достигает своего пика в периовуляторный период, что приводит к накоплению лейкоцитов в фолликуле, фолликулярной стенке и ускоряет овуляцию [25]. В независимых исследованиях было установлено, что концентрация в крови и локальная экспрессия Г-КСФ изменяются в течение менструального цикла и беременности: повышение уровней Г-КСФ наблюдается не только в периовуляторном периоде, но и в поздней лютеиновой фазе [26]. Экспрессия Г-КСФ определяется в гранулезных и лютеальных клетках (перед и после овуляции), в эндометрии (на протяжении всего менструального цикла) [27, 28]. В сыворотке крови беременных концентрация цитокина значительно увеличивается сразу после имплантации и сохраняется на высоком уровне в течение всей беременности [29]. Источник продукции фактора в случае наступления беременности — клетки децидуальной оболочки и плаценты, в которых уровень Г-КСФ после подъема от момента имплантации снижается только ко II триместру гестации, после чего опять увеличивается, достигая максимальных значений в III триместре [30].

Впервые лекарственный эффект G-CSF у пациентов с неудачными попытками ЭКО в анамнезе был исследован еще в 2000 г. Würfel et al. Авторам удалось установить, что систематическое введение G-CSF повышает частоту имплантации [31].

В итальянском исследовании было обнаружено, что добавление G-CSF пациенткам с низким ответом увеличивает результативность циклов ВРТ. При этом концентрация G-CSF в фолликулярной жидкости напрямую коррелировала с качеством ооцита, что исследователи объяснили не столько системными, сколько паракринными эффектами G-CSF на стимулированные ооциты [32]. По данным анализа 523 образцов фолликулярной жидкости, уровень фолликулярного G-CSF был более значимым и достоверным прогностическим фактором для последующей имплантации в сравнении с морфологией эмбрионов (ОШ = 0,77, 95 % ДИ 0,69–0,83, p < 0,001 vs. ОШ = 0,66, 95 % ДИ 0,58–0,73, p = 0,01). Авторы классифицировали эмбрионов по концентрации G-CSF в фолликулярной жидкости на три класса: I класс > 30 пг/мл, II класс ∈ (30; 18,4) пг/мл, III класс < 18,4 пг/мл [33].

В проспективном исследовании по влиянию G-CSF у женщин с синдромом лютеинизации неовулирующего фолликула (ЛНФ) было показано, что адъювантное применение данного ростового фактора (ленограстим 100 мкг однократно) одновременно с триггером овуляции (ХГЧ 5000 МЕ) у 68 из 112 женщин в протоколах стимуляции овуляции кломифеном (n = 80) или рекомбинантным ФСГ (n = 32) улучшало исходы лечения: ЛНФ зарегистрирован в 4,4 % (3/68 циклов) циклах при применении G-CSF и в 19,1 % (13/68 циклов) в группе сравнения (p = 0,013, χ²-тест по методу Мак-Немара) [34]. Теоретическое обоснование данному режиму применения G-CSF (вместе с триггером овуляции) было сделано исходя из того, что период полужизни Нф составляет в среднем 3,75 дня, что обеспечивает их максимальную эффективность в периовуляторную фазу [35]. В японском проспективном клиническом исследовании (n = 30) введение рекомбинантного G-CSF (8 млн ЕД, через день) у пациенток с бедным ответом с началом контролируемой овариальной стимуляции приводило к улучшению развития фолликулов, снижению частоты отмены циклов ВРТ (вследствие отсутствия ответа на контролируемую овариальную стимуляцию (КОС)), увеличению частоты наступления беременности, при этом авторы отметили, что в целом для проведения КОС потребовалось меньшее количество гонадотропинов в получавшей G-CSF группе женщин [36].

Данные метаанализов по применению G-CSF в протоколах ВРТ (табл. 2)

По данным метаанализа 2017 г. с включением 682 пациенток (339 в группе G-CSF vs. 343 в группе сравнения) из 11 соответствующих критериям анализа исследований установлено, что внутриматочная перфузия G-CSF влияет на толщину эндометрия (ΔM = 1,79, 95 % ДИ 0,92–2,67),достоверно увеличивает частоту наступления клинической беременности (ОШ = 2,52, 95 % ДИ 1,39–4,55) и частоту имплантации эмбрионов (ОШ = 2,35, 95 % ДИ 1,20–4,60), в то же время достоверно снижая частоту отмены цикла ВРТ (ОШ = 0,38, 95 % ДИ 0,25–0,58) [37].

 

Таблица 2 / Table 2

Клинические исследования эффективности адъювантного применения Г-КСФ в протоколах ВРТ, наиболее часто включаемые в метааналитические обзоры

Clinical studies of the effectiveness of the adjuvant use of G-CSF in ART protocols, most often referred to in meta-analytical reviews

Авторы	Год публикации	Вид исследования	n	Основные результаты применения G-CSF	Примечание
A. Aleyasin et al. [41]	2016	Многоцентровое рандомизированное контролируемое (системное введение)	112	Частота имплантации (18 % vs. 7,2 %, ОШ = 2,63, 95 % ДИ 1,09–6,96, р = 0,007), биохимической (44,6 % vs. 19,6 %, ОШ = 2,74, 95 % ДИ 1,11–7,38, р = 0,005) и клинической (37,5 % vs. 14,3 %, ОШ = 2,94, 95 % ДИ 1,23–8,33, р = 0,005) беременности	Клинический протокол IRCT201503119568N11
D.H. Barad et al. [42]	2014	Рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое (системное введение)	141	Увеличение толщины эндометрия на 1,37 мм в группе G-CSF; частота наступления беременности (45,57 % vs. 39,29 %, р > 0,05)	Возраст пациенток 40,09 (± 5,20) в группе G-CSF и 39,68 (± 3,81) в группе плацебо (клинический протокол NCT01202656)
M. Eftekhar et al. [43]	2014	Сравнительное (внутриматочная перфузия)	68	Частота наступления биохимической (39,30 % vs. 14,30 %) и клинической (32,10 % vs. 12,00 %) беременности	Вместе с G-CSF пациентки получали АСК 80 мг в сутки (клинический протокол IRCT201108116420N8)
N. Gleicher et al. [44]	2013	Проспективное когортное (внутриматочная перфузия)	21	Толщина эндометрия увеличилась с 6,4 ± 1,4 до 9,3 ± 2,1 мм (p < 0,001); частота наступления клинической беременности (19,1 % vs. 0)	Перфузия G-CSF выполнена в протоколе КОС
V.V. Mishra et al. [45]	2016	Проспективное когортное (внутриматочная перфузия)	35	Увеличение толщины эндометрия с 5,86 ± 0,58 до 6,58 ± 0,84 мм	Перфузия G-CSF выполнена в протоколе КОС
F. Scarpellini, M.Sbracia [46]	2009	Рандомизированное плацебо-контролируемое (системное введение 1,5 мкг/кг)	68	Частота рождения (82,8 % vs. 48,5 %, p = 0,0061, ОШ = 5,1; 95 % ДИ 1,5–18,4)	Длительное введение G-CSF (протокол NCT00772122)
F. Scarpellini, M.Sbracia [47]	2011	Рандомизированное плацебо-контролируемое (системное введение)	89	Частота наступления клинической беременности (35,6 % vs. 15,9 %, ОШ = 2,23; 95 % ДИ 1,02–4,28)	Длительное введение G-CSF
F. Scarpellini, M. Sbracia [48]	2013	Рандомизированное плацебо-контролируемое (системное введение 60 мкг/кг)	50	Частота наступления клинической беременности (48 % vs. 16 %, ОШ = 3,0; 95 % ДИ 1,12–8,05)	Длительное введение G-CSF (клинический протокол NCT01715974)
E. Tehraninejad etal. [49]	2015	Наблюдательное (внутриматочная перфузия)	15	Увеличение толщины эндометрия с 3,59 ± 0,25 до 7,12 ± 0,84 мм (p < 0,001); частота наступления беременности (20,0 % vs. 0)	Вместе с G-CSF пациентки получали силденафил вагинально
B. Xu et al. [50]	2015	Проспективное когортное (внутриматочная перфузия)	82	Увеличение толщины эндометрия с 5,7 ± 0,7 до 8,1 ± 2,1 мм (p < 0,001); частота имплантации (31,5 % vs. 13,9 %, p < 0,01), частота наступления беременности (48,1 % vs. 25,0 %, р = 0,038)	Перенос эмбрионов в криопротоколе

Примечание. Г-КСФ — гранулоцитарный колониестимулирующий фактор; КОС — контролируемая овариальная стимуляция; АСК — ацетилсалициловая кислота.

 

В результате метаанализа 2017 г., включающего в себя данные исключительно рандомизированных исследований, не было выявлено статистически значимого увеличения толщины эндометрия после перфузии G-CSF у женщин с тонким эндометрием, при этом отмечена значительно более высокая частота наступления клинической беременности (ОШ = 2,43, 95 % ДИ 1,09–5,40), включая когорту пациенток с неудачными попытками ЭКО в анамнезе (ОШ = 2,51, 95 % ДИ 1,36–4,63) [38].

В метаанализе J. Li et al., включающем в себя 6 клинических исследований, было установлено, что перфузия эндометрия G-CSF ассоциирована с более высокой частотой клинической беременности по сравнению с плацебо (ОР = 1,563, 95 % ДИ 1,122–2,176), при этом у пациентов с синдромом тонкого эндометрия, несмотря на отсутствие статистически значимого увеличения толщины эндометрия, также увеличивалась частота имплантации эмбриона (ОР = 1,887, 95 % ДИ 1,256–2,833) и частота наступления биохимической беременности (ОР = 2,385, 95 % ДИ 1,414–4,023) [39].

Метаанализ 2018 г., включающий 10 клинических исследований общей емкостью 1016 циклов ВРТ (521 G-CSF vs. 495 в группе сравнения), продемонстрировал, что применение G-CSF достоверно увеличивает более высокий уровень частоты наступления беременности и частоту имплантации эмбриона: ОШ = 2,07 (95 % ДИ 1,64–2,61) и ОШ = 1,52 (95 % ДИ 1,08–2,14) соответственно. При этом как и внутриматочное введение (ОШ = 1,46, 95 % ДИ 1,04–2,05), так и подкожные инъекции (ОШ = 2,23, 95 % ДИ 1,68–2,95) приводят к существенному увеличению частоты наступления клинической беременности [40].

После получения данных о доказанных эффектах G-CSF встает вопрос о пути введения G-CSF: системное введение или внутриматочная перфузия? Каждый путь введения имеет свои преимущества в каждой конкретной клинической ситуации, однако сочетание данных способов введения, возможно, является верным, так как при этом G-CSF воздействует на мишени в репродуктивно значимых органах и тканях, а в эндометрии в более высоких концентрациях, что позволяет обеспечить его последующие морфо-функциональные изменения, необходимые для благоприятных условий имплантации эмбриона [51].

В рекомендациях ESHRE 2018 г., касающихся привычной потери беременности, впервые изложены данные о возможности применения G-CSF у данного контингента пациенток [52], однако необходимы дальнейшие исследования, уточняющие режим и способ введения препаратов рекомбинантного G-CSF.

Об авторах

Наталья Игоревна Тапильская

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта»; ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Автор, ответственный за переписку.
Email: tapnatalia@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-5309-0087

д-р мед. наук, профессор, ведущий научный сотрудник отделения вспомогательных репродуктивных технологий. ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта», Санкт-Петербург; профессор кафедры акушерства и гинекологии с курсом детской и подростковой гинекологии. ФГБОУ ВО «СПбГПМУ» Минздрава России

Россия, Санкт-Петербург

Александр Мкртичевич Гзгзян

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта»; ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет»

Email: iagmail@ott.ru
ORCID iD: 0000-0003-3917-9493

д-р мед. наук, руководитель отделения вспомогательных репродуктивных технологий. ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта», Санкт-Петербург; профессор кафедры акушерства, гинекологии и репродуктологии медицинского факультета. ФГБОУ ВО «СПбГУ»

Россия, Санкт-Петербург

Игорь Юрьевич Коган

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта»

Email: iagmail@ott.ru
ORCID iD: 0000-0002-7351-6900

д-р мед. наук, профессор, член-корреспондент РАН, ВрИО директора

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы