Роль биологически активных молекул в развитии сократительной деятельности матки

Полный текст

Введение

Большое значение для возникновения родовой деятельности и правильной ее регуляции на фоне общей подготовки беременной к родам имеет, помимо степени зрелости шейки матки, чувствительность миометрия к воздействию контрактильных веществ [1–3]. В настоящее время в сфере внимания исследователей остаются вопросы, связанные с механизмами развития сократительной деятельности матки [4–6]. Сокращение и расслабление миометрия требует высокоразвитого клеточного взаимодействия и координации, которые достигаются образованием межклеточных GAP-соединений между соседними клеточными мембранами [7]. Проводящая система щелевых контактов обеспечивает синхронизацию и координацию сокращений миометрия в активной фазе родов, превращая миометрий в гигантский морфофункциональный синцитий, а его внутреннюю среду — в единое гуморальное пространство [8–10]. Белки, входящие в состав GAP-соединений, называются коннексинами [11, 12]. Существуют различные типы коннексинов. Коннексин-43 является основным белком щелевидных контактов, обнаруженным между миоцитами. Щелевые контакты формируются к доношенному сроку беременности, и их количество увеличивается в родах, затем они исчезают в течение 24 часов после родов. Щелевые контакты отсутствуют при недоношенной беременности, обеспечивая пролонгирование беременности путем предотвращения электрического сопряжения клеток и координированности сокращений, наблюдаются при преждевременных родах и при слабости родовой деятельности (продолжительность родов более 18 часов), что также свидетельствует о значительной роли щелевых контактов в координации сокращения миоцитов [13]. Появление щелевых контактов непосредственно перед родами ведет к формированию обширных областей плазматической мембраны с низким сопротивлением, обеспечивающих электрическое сопряжение клеток и синхронность сокращения миоцитов (в результате низкого электрического сопротивления данных участков мембраны при возбуждении миоцита волна деполяризации быстро распространяется на соседние клетки). Непосредственно перед родами отдельные щелевидные контакты группируются в бляшки на поверхности цитоплазматической мембраны. Образование GAP-соединения требует наличия молекул клеточной адгезии [14]. R. Meyer (1992) показал, что формирование GAP-соединений в инфицированных S180 клетках блокировалось инкубацией с антисывороткой к печеночным молекулам клеточной адгезии. Отсутствие GAP-соединений в миометрии при беременности приводит к снижению координированности сокращений и повышенной резистентности гладкой мускулатуры к терапии. Во время родов наблюдается значительное увеличение GAP-соединений, что значительно увеличивает электрическое взаимодействие клеток и позволяет миометрию сокращаться синхронно и с большой амплитудой. Доказано увеличение уровня потока веществ через цитоплазматическую мембрану при увеличении площади формирующихся бляшек щелевых контактов. Если подобное объединение происходит раньше положенного времени, то это может привести к преждевременным родам.

Активирует формирование щелевых контактов изменение концентрации в миометрии прогестерона, эстрогенов, простагландинов, окситоцина. Известно, что прогестерон предотвращает, а эстрогены способствуют образованию межклеточных контактов. Так, при уменьшении уровня прогестерона снижается трафик коннексина-43 (основного белка межклеточных контактов) к плазматической мембране и объединение белков в щелевые каналы. Эстрогены активируют экспрессию генов коннексина-43, и воздействие антиэстрогенными препаратами вызывает снижение цитоплазматической концентрации коннексина-43, не ведущее к образованию щелевых контактов. Угнетение синтеза простагландинов подавляет образование щелевых контактов. Для образования GAP-соединения необходимы белки-интегрины, которые опосредуют адгезию между клетками и клеток к экстрацеллюлярному матриксу [15].

В поддержании матки в состоянии относительного покоя важную роль играют ингибиторы сократительной активности матки, которые необходимы для сложного баланса ингибиторных и активирующих факторов. Снижение или повышение одного или более из них может запустить процесс активации миометрия и привести к началу родов. Важным эндогенным релаксантом является оксид азота (NO), синтез которого зависит от пиков растяжения миометрия. Эффект NO реализуется путем активации растворимой гуанилатциклазы, что ведет к синтезу циклического гуазинмонофосфата, вызывающему падение концентрации Са²⁺ в клетке. На препаратах человеческого миометрия показано, что при воздействии нитропруссида снижается сила сокращений миоцитов и угнетается фосфорилирование легких цепей миозина. Однако также отмечено, что гладкая мускулатура миометрия менее чувствительна к действию NO, чем гладкая мускулатура сосудов. Изоформы NO-синтазы (NOS) в тканях плодовых оболочек регистрировали при помощи метода ПЦР в реальном времени [16]. Наибольший уровень мРНК, кодирующей индуцибельную NOS (iNOS), в миометрии человека определялся перед родами и снижался так же, как и сама iNOS, во время родов [17]. Вероятно, что NO действует паракринным образом (возможно, в некоторой связи с прогестероном), в результате чего достигается релаксирующий эффект на миометрий в течение беременности. Таким образом, дальнейшее изучение влияния активирующих и ингибирующих факторов сократительной активности миометрия имеет большое значение для определения патогенеза аномалий сократительной активности матки, преждевременных родов и разработки методов лечения данных состояний.

Клинические работы, посвященные изучению содержания ингибирующих (NO-синтазы) и активирующих (протеина межклеточных контактов коннексина-43) факторов сократительной деятельности матки в миометрии при беременности и в родах, в доступной литературе отсутствуют.

Целью данного исследования было изучить экспрессию NO-синтазы, молекул адгезии CD51, CD61, протеина межклеточных контактов коннексина-43 в миометрии у женщин при беременности, в родах и на основании этого оценить роль ингибирующих и активирующих факторов в развитии сократительной деятельности матки.

Методы исследования

Для оценки роли ингибирующих и активирующих факторов сократительной деятельности матки проводили иммуногистохимическое исследование биоптатов миометрия из области нижнего сегмента матки, полученных во время кесарева сечения у 24 пациенток: у 8 женщин при доношенном сроке физиологической беременности, у 8 рожениц в активную фазу неосложненных родов и у 8 со слабостью родовой деятельности. В качестве маркеров клеточной адгезии использованы интегрины — белки CD51, CD61. Локализацию и количество межклеточных контактов оценивали по экспрессии коннексина-43, интенсивность окислительных процессов — по активности NO-синтазы.

Иммуногистохимическое исследование проводили с использованием моноклональных мышиных антител к CD51 (Clone CJ00, 1 : 100, Novocastra), CD61 (Clone 2f2, 1 : 50, Novocastra), Connexin-43 (Clone IgG1; 1 : 50, Shymicon), NitricOxide Synthase-3 (Clone RN5, 1 : 40, Novocastra). В качестве вторых антител использовали универсальный набор, содержащий биотинилированные антимышиные и антикроличьи иммуноглобулины. Визуализацию окрасок проводили с применением комплекса авидина с биотинилированной пероксидазой (ABC-kit), с последующим проявлением пероксидазы хрена. Для негативного контроля во всех случаях применяли блокирующую сыворотку (DAKO LSAB 2 kit). Количественную оценку результатов иммуногистохимических реакций выполняли с помощью системы компьютерного анализа микроскопических изображений, состоящую из микроскопа NikonEclipse E400, цифровой камеры Nikon DXM1200, персонального компьютера на базе IntelPentium 4, программного обеспечения АСТ-1, версия 2.12, и «Видеотест-Морфология 5.0». В программе «Видеотест-Морфология 5.0» оценивали экспрессию исследуемых белков в ткани, используя показатель средней оптической плотности, показатель относительной площади иммунопозитивного окрашивания, которую рассчитывали как соотношение площади окрашенных клеток к относительной площади поля зрения. Количественную оценку результатов иммуногистохимической реакции осуществляли при помощи относительной площади экспрессии (S, %) CD51, CD61, коннексина-43, NO-синтазы в миометрии нижнего сегмента матки.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием методов параметрической и непараметрической статистики. Методы описательной статистики включали оценку среднего арифметического (М), средней ошибки среднего значения (m) — для признаков, имеющих непрерывное распределение, а также частоты встречаемости признаков с дискретными значениями. Для определения межгрупповых различий значений признаков, имеющих непрерывное распределение, применяли t-критерий Стьюдента, а при сравнении частотных величин — χ2-критерий Пирсона и точный метод Фишера. Для сравнения парных выборок использовали парный td-критерий, для оценки комплексного характера изменений — линейный дискриминантный, кластерный и факторный анализ. Статистическую обработку материала выполняли на персональном компьютере с помощью стандартного пакета программ прикладного статистического анализа (Statistica for Windows v.6.0). Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы (об отсутствии значимых различий или факторных влияний) принимали равным 0,05.

Результаты исследования

Во время оперативного вмешательства у 24 женщин была произведена биопсия миометрия из области нижнего сегмента матки, впоследствии выполнено иммуногистохимическое исследование биоптатов. Были изучены биоптаты миометрия у 8 женщин при доношенном сроке физиологической беременности (показания к операции — осложненная миопия высокой степени), у 8 в активной фазе неосложненных родов (показания к операции — осложненная миопия высокой степени, тазовое предлежание крупного плода), у 8 рожениц со слабостью родовой деятельности. При доношенном сроке беременности накануне родов отмечалась умеренная степень экспрессии NO-синтазы (10,35 ± 2,8 %), молекул адгезии CD51, CD61 (9,82 ± 2,70 и 12,54 ± 1,45 % соответственно) и протеина межклеточных контактов коннексина-43 (3,61 ± 0,55 %). При оценке экспрессии NO-синтазы в миометрии было выявлено ее достоверное снижение у пациенток в активную фазу родов (1,69 ± 0,10 %) по сравнению с беременными при доношенном сроке (10,35 ± 2,8 %, p < 0,001) и роженицами со слабостью родовой деятельности (33,53 ± 3,66, p < 0,0001) (табл. 1).

 

Таблица1 / Table 1

Экспрессия NO-синтазы в тканях миометрия (M ± m, %)

Expression of NO synthase in the myometrium (M ± m, %)

Площадь экспрессии	Доношенный срок беременности накануне родов	Активная фаза родов	Слабость родовой деятельности	p
Относительная площадь экспрессии (%)	10,35 ± 1,8	1,69 ± 0,10	33,53 ± 3,66	p1–2 < 0,001 p1–3 < 0,001 p2–3 < 0,0001

 

Данные, представленные в табл. 2–4, свидетельствуют о том, что наименьшая величина площади экспрессии белков CD51, CD61, коннексина-43 наблюдалась при слабости родовой деятельности (3,91 ± 0,69, 4,88 ± 1,11, 2,08 ± 0,34 % соответственно). В активную фазу неосложненных родов величина площади экспрессии молекул адгезии CD51, CD61 и коннексина-43 была почти в 2 раза больше, чем при доношенном сроке физиологической беременности накануне родов.

 

Таблица 2 / Table 2

Экспрессия СD51 в тканях миометрия (M ± m, %)

Expression of CD51 in the myometrium (M ± m, %)

Площадь экспрессии	Доношенный срок беременности накануне родов	Активная фаза родов	Слабость родовой деятельности	p
Относительная площадь экспрессии (%)	12,54 ± 1,45	24,89 ± 2,14	3,91 ± 0,69	p1–2 < 0,001 p1–3 < 0,001 p2–3 < 0,0001

 

Таблица 3 / Table 3

Экспрессия СD61 в тканях миометрия (M ± m, %)

Expression of CD61 in the myometrium (M ± m, %)

Площадь экспрессии	Доношенный срок беременности накануне родов	Активная фаза родов	Слабость родовой деятельности	p
Относительная площадь экспрессии (%)	9,82 ± 2,10	29,95 ± 2,35	4,88 ± 1,11	p1–2 < 0,001 p2–3 < 0,001

 

Таблица 4 / Table 4

Экспрессия коннексина-43 в тканях миометрия (M ± m, %)

Expression of connexin-43 in the myometrium (M ± m, %)

Площадь экспрессии	Доношенный срок беременности накануне родов	Активная фаза родов	Слабость родовой деятельности	p
Относительная площадь экспрессии (%)	3,61 ± 0,55	7,85 ± 0,21	2,08 ± 0,34	p1–2 < 0,01 p1–3 < 0,001 p2–3 < 0,001

 

Результаты иммуногистохимического исследования показали, что при слабости родовой деятельности отмечалось достоверное снижение экспрессии молекул адгезии CD51, CD61 и коннексина-43 в миометрии по сравнению с доношенным сроком физиологической беременности накануне родов (p < 0,001) на фоне трехкратного увеличения площади экспрессии NO-синтазы. У рожениц в активную фазу неосложненных родов экспрессия CD61 (p < 0,0001), CD51 (p < 0,001), коннексина-43 (p < 0,01) достоверно превышала значения у беременных с доношенным сроком физиологической беременности (29,95 ± 2,35, 24,89 ± 2,14, 7,85 ± 1,21 % и 9,82 ± 2,10, 12,54 ± 1,45, 3,61 ± 0,55 % соответственно). Эти результаты представлены на рис. 1.

 

Рис.1 .NO-синтазы, CD51, CD61, коннексина-43 в тканях миометрия у пациенток при доношенном сроке физиологической беременности, в активной фазе неосложненных родов, у рожениц со слабостью родовой деятельности

Fig. 1. Relative (%) expression of eNOS, CD51, CD61, and Con-43 in myometrial tissues in patients with a full-term physiological pregnancy, in the active phase of uncomplicated parturition, and in women with uterine inertia

 

Выводы

На основании данных иммуногистохимического исследования миометрия определена роль биологически активных молекул (NO-синтазы, молекул адгезии CD51, CD61, коннексина-43) в механизмах сократительной деятельности матки. В миометрии в активную фазу физиологических родов происходит трехкратное повышение экспрессии активирующих (адгезивных молекул CD61, CD51, белка межклеточных контактов коннексина-43) и пятикратное снижение ингибирующего (NO-синтазы) факторов сократительной деятельности матки по сравнению с таковым при доношенном сроке физиологической беременности.

Также впервые выявлено, что при слабости родовой деятельности наблюдается изменение соотношения ингибирующих и активирующих факторов сократительной деятельности миометрия, о чем свидетельствует снижение относительной площади экспрессии молекул адгезии CD51, CD61 и протеина межклеточных контактов коннексина-43 в миометрии по сравнению с доношенным сроком физиологической беременности на фоне увеличения площади экспрессии NO-синтазы. Таким образом, одним из механизмов развития слабости родовой деятельности является дисбаланс между ингибирующими и активирующими факторами сократительной деятельности миометрия.

Об авторах

Татьяна Ульяновна Кузьминых

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта»

Автор, ответственный за переписку.
Email: 9260@mail.ru
Scopus Author ID: 56719818800
ResearcherId: U-8950-2017

д-р мед. наук, руководитель родильного отделения

Россия, Санкт-Петербург

Вера Юрьевна Борисова

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта»

Email: borisova.ver@gmail.com
SPIN-код: 9499-9530

канд. мед. наук, научный сотрудник родильного отделения

Россия, Санкт-Петербург

Игорь Павлович Николаенков

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта»

Email: nikolaenkov_igor@mail.ru

канд. мед. наук, врач-акушер-гинеколог родильного отделения

Россия, Санкт-Петербург

Георгий Романович Козонов

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта»

Email: kozonovg@mail.ru

канд. мед. наук, научный сотрудник родильного отделения

Россия, Санкт-Петербург

Гулрухсор Хайбуллоевна Толибова

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта»

Email: gulyatolibova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-6216-6220
SPIN-код: 7544-4825
Scopus Author ID: 23111355700
ResearcherId: Y-6671-2018

канд. мед. наук, старший научный сотрудник лаборатории клеточной биологии. Отдел патоморфологии

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы